专利名称：含有苯并[c]菲啶类生物碱及其衍生物的医药新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗乙肝病毒药物方面的新用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒HBV感染是一个世界性的健康难题。由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，绝大部分肝癌患者有慢性肝炎病史，因此HBV感染已成为影响人类寿命的九大疾病之一。据统计，全球20亿人口受过HBV感染，慢性患者达3.6亿，每年死亡患者达52万，其中5万死于急性HBV患者，47万死于肝硬化和肝癌。我国是乙型肝炎的高发区，HBV人群感染率57.6％，乙肝表面抗原(HBsAg)阳性者9.75％，全国现症慢性乙型肝炎约3000-4000万。抗病毒治疗是病毒性肝炎治疗的关键，目前公认有效的抗病毒药物是干扰素和拉米夫定(lamivudine)等化学合成的核苷类似物。以核苷类似物为代表的这些合成抗病毒药的结构类型单一，存在停药后复发率高，对HBeAg作用不明显，需长期用药致病耐受等问题；以干扰素为代表的生物类药物治疗乙肝同样复发率较高、不良反应严重而且价格昂贵，患者经济负担大，临床难以广泛使用。因此，寻求新型高效、低毒和价廉的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。
发明人检索到如下四项专利文献1，CN1061964A，苯并[C]菲啶鎓衍生物的制备方述方法制备的化合物；专利文献2，CN1238772A，新颖的菲啶鎓衍生物；专利文献3，CN1204321A(WO97/16483)，菲啶衍生物和其制备方法及含有菲啶衍生物的药物；专利文献4，WO97/41890，包含苯并菲啶类生物碱的杀虫剂。
以上涉及苯并[C]菲啶类衍生物的制备和应用研究的专利文献，限于抗肿瘤、抗血小板聚集、抗心律失常和杀虫作用；虽然也提到过抗微生物、抗真菌和抗病毒作用，但是没有一项专利文献涉及苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物对乙肝病毒的作用。
发明内容
针对临床上国外和我国慢性乙肝病毒感染的实际，重点对传统中草药中的生物碱类的作用进行了系统筛选和深入研究，本发明提出了一种具有结构通式I的含有苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗乙肝病毒药物方面的新用途，该类生物碱具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，对这种病原体显示较强抑制活性，不仅具有抗病毒作用，而且还可望用于抗肝癌， 其中，R1至R10、R12和R13为氢、羟基、具有1～12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2，R11为氢或甲基或氧原子，R14和R15各自独立地为氢或甲基。
上述所包含的化合物和药物上可接受的盐类或载体作为制备抗乙肝病毒药物的组合物中的应用。
所述R5与R6或R15形成双键；R14与R15形成双键；R12和R13与相邻的N原子形成双键；R1至R10相邻碳上取代基可为二噁茂结构。
所述该药物上可接受的载体选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。
所述的该组合物可以制成口服给药形式或注射给药形式。
本发明中作为有效成分的化合物I至IX在植物中有广泛分布，主要存在于罂粟科和芸香科植物的白屈菜属(Chelidonium)、紫堇属(Corydalis)、博落回属(Macleaya)飞龙掌血属(Toddalia)、崖椒属(Fagara)和花椒属(Zanthoxylum)等多属植物中，常见如白屈菜(Chelidonium majus)，岩黄连(Corydalissaxicola)，博落回(Macleaya cordata)，飞龙掌血(Toddalia asiatica)等。这些化合物已经公开在发表在现有公知文献、例如以下参考文献中[1]宗永立等，时珍国医国药，2006，17，2068；[2]Slavik J.et al.，Collection Czechoslov.Chem.Commun.，1965，30，3697；1968，33，635；1977，42，2686；[3]Paul J.Scheuer，et al.，J.Nat.Prod.，1962，42，1472；[4]Tanahashi，T.et al.，J.Nat.Prod.，1990，53，579；[5]李定祥等，中国天然药物，2004，2，285。
但是，上述参考文献均没有提示这些基于苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物的化合物具有抗乙肝病毒作用。
用于本发明的苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物可以商购或按文献提示的方法制备。例示的化合物如图2所示。
图1是本发明中白屈菜全草酸性醇提取液中单体生物碱I～III及IX的提取分离流程图。
图2是本发明中部分苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物说明示意图。
图3是本发明中典型苯并菲啶类生物碱的体外抗HBV活性和细胞毒性说明示意图。
具体实施例方式
现在将更详细地通过以下实施例描述本发明中制备苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物的方法及其药理作用。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。
实施例1从白屈菜中提取分离单体生物碱I～III及IX。
取白屈菜(Chelidonium majus)全草按参考文献[2，3]中介绍的方法稍作调整进行5kg药材用含5％醋酸的70％乙醇回流提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸去大部分乙醇，酸水提取液按常规酸碱处理方法，先加5％盐酸至PH2，用石油醚萃取，所得酸水层(S-1)用氯仿萃取得23g(L-1)，经硅胶柱层析，石油醚∶氯仿(10∶0～10∶1.5)梯度洗脱，得白屈菜碱(IX＝1.86g)和二氢白屈菜红碱(II＝45mg)。
上述氯仿萃取过的酸水层(S-2)静置后滤取沉淀，用5％盐酸-乙醇(PH1)重结晶分离得到氯化血根碱(III＝0.72g)；上清液再加氨水调至PH10，用氯仿萃取得48g(L-2)，再于石油醚∶氯仿∶甲醇∶二乙胺＝10∶2∶0.5∶0～0∶10∶3∶1的条件下经反复硅胶柱层析得白屈菜红碱(I＝0.94g)、血根碱(III＝0.83g)。
实施例2从季铵型苯并[C]菲啶类生物碱转化为叔胺型苯并[C]菲啶类生物碱。
按参考文献[4]的方法，取白屈菜红碱盐酸盐(20mg，0.052mM)溶于15ml 10％的稀盐酸，室温搅拌下加锌粉0.3g，继续搅拌过夜，反应混合物用氯仿萃取(60ml×3)，用少量酸水(10％稀盐酸)洗涤萃取液，再水洗至中性，回收氯仿，残留物用乙醇重结晶得二氢白屈菜红碱14mg(收率77％)。所得产物理化常数和波谱数据与提取分离所得二氢白屈菜红碱一致。
其他季铵型苯并[C]菲啶类生物碱转化为叔胺型苯并[C]菲啶类生物碱可用类似方法制得。
实施例3单体化合物的理化和波谱数据。
白屈菜红碱盐酸盐(I)[C21H18NO4]+，黄色针晶，mp201-202℃，碘化铋钾反应阳性。IR νmaxKBr(cm-1)3380，2920，2824，1642(C≡N+)，1575，1450，1364，1250，1100，1035(C-O-C)，970，875，825；UV(nm，logε)228(4.49)，274sh(4.54)，282(4.62)，320(4.26)，346sh(3.55)；EIMSm/z 348[M]+(100)，333(12)，318(5)，307(6)，290(5)，167(4)，154(38)，136(31)，124(4)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)4.07(3H，s，OMe)，4.13(3H，s，3H，s，OMe)，4.93(3H，s，3H，s，N-Me)，6.22(2H，s，2H，s，-OCH2O-)，7.83(1H，s，1H，s，H-1)，8.24(1H，d，J＝9.0Hz，H-9)，8.26(1H，s，H-4)，8.29(1H，d，J＝9.0Hz，H-9)，8.80(2H，d，J＝9.0Hz，H-11)，10.06(1H，s)。
二氢白屈菜红碱(II)类白色晶体，C21H19NO4，mp164-165℃，碘化铋钾反应阳性。EIMS349[M]+(100)，348(80)，334[M-Me]+(15)，333(12)，332(14)，319(15)，304(11)，290(19)，276(9)，174(10)；UVλmaxMeOH(nm)226，278；IRνmaxKBr(cm-1)2920，2850，1600，1460，1247cm1。1H NMR(400MHz)7.67，s(H-1)，7.11，s(H-4)，7.48，d，8.5Hz(H-5)，7.70，d，8.6Hz(H-6)，4.29，s(H-8)，6.94，d，8.5Hz(H-11)，7.51，d，8.5Hz(H-12)，6.05，s(H-15)，2.60，s(7-NCH3)，3.88，s(9-OCH3)，3.93，s(10-OCH3)；13C NMR(100MHz)100.8(C-1)，149.3(C-2)，147.2(C-3)，104.0(C-4)，131.0(C-5a)，125.5(C-5)，120.4(C-6)，124.3(C-13)，118.1(C-12)，111.2(C-11)，151.8(C-10)，147.2(C-9)，126.3(C-8a)，48.8(C-8)，40.4(NCH3)，126.4(C-1a)，102.6(C-15)，63.1(9-OMe)，56.9(10-OMe)。
血根碱(III)[C20H14NO4]+，游离碱结晶(H2O)，mp243～244℃(dec.)，碘化铋钾反应阳性。IR νmaxKBr(cm-1)2940，2882，1604，1460，1350，1323，1240，1080，1030，940，860，820，800；UVλmaxMeOHnm(logε)323(4.09)，282(4.52)，228(4.47)，207(4.52)；EIMSm/z 204(2)，122(36)，94(100)，93(22)，91(10)，79(18)，55(21)，41(30)。1H NMR(400Mz，DMSO-d6)δ7.62(1H，s，H-1)，8.14(1H，s，H-4)，10.21(1H，s，H-6)，8.70(1H，d，J＝8.6Hz，H-9)，8.09(1H，d，J＝8.6Hz，H-10)，8.56(1H，d，J＝9.1Hz，H-11)，8.25(1H，d，J＝9.1Hz，H-12)，4.91(3H，s，5-Me)，6.36(2H，s，3-OCH2O-)，6.61(2H，s，7，8-OCH2O-)。
白屈菜碱(IX)(±)-白屈菜碱C20H19NO5，白色结晶(EtOH)，mp215～216℃，碘化铋钾反应阳性。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ6.76(1H，d，J＝7.9Hz，H-9)，6.73(1H，d，J＝7.9Hz，H-10)，6.66(1H，s，H-4)，6.64(1H，s，H-1)，5.99(1H，d，J＝1.5Hz，C2，3-OCH2O)，5.95(1H，d，J＝1.3Hz，C2，3-OCH2O)，5.92(1H，d，J＝1.8Hz，C7，8-OCH2O)，5.93(1H，d，J＝1.5Hz，C7，8-OCH2O)，4.23(1H，br s，H-11)，4.08(1H，d，J＝15.7Hz，H-6)，3.57(1H，br s，H-H)，3.43(1H，d，J＝15.6Hz，H-6)，3.21(1H，d，J＝17.5Hz，H-12)，3.08(1H，dd，J＝16.5，4.3Hz，H-12)，2.98(1H，t，J＝2.8Hz，H-13)，2.27(3H，s，N-CH3)；13C-NMR(CDCl3)δ107.4(C-1)，145.3CC-2)，145.6(C-3)，111.9(C-4)，128.9(C-4a)，53.9(C-6)，117.1(C-6a)，143.1(C-7)，148.2(C-8)，109.6(C-9)，120.4(C-10)，131.4(C-10a)，72.4(C-11)，39.7(C-12)，125.8(C-12a)，42.1(C-13)，62.9(C-14)，42.4(N-CH3)，101.1(2，3-OCH2O)，101.4(7，8-OCH2O)。
实施例4苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物对乙肝病毒的抑制作用测试1.试验材料1.1受试药样品，溶剂及配制方法实验时按照所地设计剂量组浓度用DMEM培养液配制，4℃冰箱保存备用。
1.2 2.2.15细胞引自美国Mount Sinai医学中心构建的乙型肝炎病毒(HBV)基因转染人肝癌细胞(Hep G2)2.2.15细胞系，进行传代培养。
1.3试剂及仪器DMEM干粉、G-418(Geneticin)、胎牛血清，美国Hyclonelab公司产品；HBsAg、HBeAg固相放免测定盒，中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品；卡那霉素，华北制药厂产品；二甲基亚砜，SIGMA公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-lab产品；γ-计数仪，德国BECKMAN产品。
1.4细胞培养液及试剂配制DMEM培养液100ml含胎牛血清10％，G418 380μg/ml，卡那霉素50U/ml。
2.试验方法2.1 2.2.15细胞培养在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化10分钟，加培养液吹散，1∶3传代，10天长满。
2.2药物对细胞毒性试验实验分无药物细胞对照组和不同浓度药物组。细胞消化，配制成每毫升20万个细胞，接种培养板，96孔板每孔100μl，37℃ 5％ CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。各样品分别用培养液配制成2000μg/ml。溶液，2倍稀释加入96孔细胞培养板，共7个稀释度，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每批实验每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％药物浓度B＝log＜50％药物浓度C＝log稀释倍数2.3药物对HBeAg、HBsAg抑制试验试验设HBsAg、HBeAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同浓度药物组。2.2.15细胞每毫升100万个接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，试验药液无毒浓度以下2倍稀释，5个稀释度，每浓度3孔，37℃5％CO2培养，收集4天培养液。换以原浓度药物培养液继续培养，第8天时分别收集细胞及培养液，-20℃冰冻保存。分别测定HBsAg和HBeAg。用γ-计数仪测定每孔cpm值。
②计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50)IC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％药物浓度B＝log＜50％药物浓度C＝log稀释倍数③药物在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI)，按其对细胞毒性指标细胞病变(SI)计算 ④以t检验法计算各稀释度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm差别的统计学意义。
具体测定结果如图3所示。
权利要求
1.具有通式I的苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗乙肝病毒药物中的用途， 其中，R1至R10、R12和R13为氢、羟基、具有1～12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2，R11为氢或甲基或氧原子，R14和R15各自独立地为氢或甲基。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所包含的化合物和药物上可接受的盐类或载体作为制备抗乙肝病毒药物的组合物中的应用。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R5与R6或R15形成双键。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R14与R15形成双键。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R12和R13与相邻的N原子形成双键。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R1至R10相邻碳上取代基可为二噁茂结构。
7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于该药物上可接受的载体选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于该组合物制成口服给药形式或注射给药形式。
全文摘要
一种具有结构通式I的含有苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗乙肝病毒药物方面的新用途，该类生物碱具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，对这种病原体显示较强抑制活性，不仅具有抗病毒作用，而且还可望用于抗肝癌，其中，R
文档编号A61P1/00GK101084906SQ20071006599
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月26日 优先权日2007年6月26日
发明者左国营, 徐贵丽, 赵益斌, 张青, 何洪静, 余巍, 王根春, 唐斌 申请人:成都军区昆明总医院