引起或诱导免疫应答的方法

专利名称：：引起或诱导免疫应答的方法
技术领域：
：本发明涉及引起或诱导受试者，特别是人体受试者中的免疫应答的方法，且更具体地说，本发明涉及使用无针给药途径的方法，由此为更传统的疫苗注射给药途径，诸如皮下和肌内途径提供了可替代选择。
背景技术：
：许多年来，已经进行了各种尝试以使用呼吸道作为递送非活疫苗抗原的方式。这种途径被看作在疫苗可接受性(避免"针头恐怖症")，诱导局部免疫应答的机会和假定粘膜免疫系统的一致性在远端粘膜部位上诱导应答的潜能方面提供了优点。对在人和动物中通过鼻内途径递送疫苗给予了更多的关注。迄今为止的结果表明这种途径需要极高的抗原剂量和/或使用专门递送技术以确保抗原摄入和免疫诱导。类似地，通过肺内或肺部途径递送疫苗在过去一般需要专门递送技术，诸如微嚢化(例如，参见0yaAlpa等，2005)，以便优化免疫应々合。在导致本发明的工作中，本发明人已经观察到通过鼻内途径递送疫苗非常无效，致使甚至在高抗原剂量下极差的局部免疫性。因此，本发明人已经研究了保留避免"针头恐怖症"的优点的疫苗给药的可替代途径。令人意外的是，本发明人已经证实疫苗递送至肺部优于通过鼻内途径递送作为诱导免疫应答的方式。他们还已证实在通过肺与佐剂一起递送时可以使用极少量的抗原诱导强烈的全身免疫应答。特别地，本发明人已经证实合并抗原和佐剂的简单疫苗组合物无需专门摄入技术就可在肺内递送时诱导强烈的全身免疫应答。重要的是，已经证实肺内递送导致肺粘膜免疫应答，甚至在通过肺与佐剂一起递送极少量的抗原时，它们也可以多达高于通过常规非肠道免疫接种诱导的免疫应答的100倍(100x)。Griffith等(1997)描述了在脂质体中，使用氢氧化铝或在PBS中配制的蓖麻蛋白类毒素的气管内递送。脂质体配制的组表现出最佳保护作用；氢氧化铝对保护作用的改善未超过PBS。W02005/110379描述了颗粒痴疾疫苗的肺部递送。将该制品作为颗粒制品递送并且能够緩释抗原。在本说明书中对任何在先出版物(或来源于其中的信息)或任何已的信息)或已知材料构成组本说明书所涉及的致力领域中的一般性常识的一部分的承认或许可或任何形式的提示。除非在上下文中另有需要，否则在本说明书和随后的权利要求书中的措辞"包含"和或变化形式，诸如"包括"或"含有"可以理解为暗示包含所述的整体或步骤或整体或步骤组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤组。发明概述本发明提供了用于引起或诱导人或动物受试者中的免疫应答的方法，包括对所述的受试者给予包含抗原和佐剂的组合物，其中通过肺内或肺部途径将该组合物给予受试者。优选配制适合于肺内或肺部给药的組合物。另一个方面本发明提供了包含抗原和佐剂的组合物在或在制备用于对人或动物受试者肺内或肺部给药以引起或诱导该受试者中的免疫应答的药物中的应用。另一个方面，本发明提供了用于通过肺内或肺部途径引起或诱导人或动物免疫应答的药剂，其中该药剂为包含抗原和佐剂的组合物。附图简述在图2，3,4,6,9和10中水平条=中位值空心条=中间值50%垂直线=10和9Q百分位数值图1为例证相当于上肺和下肺(或深部)肺区域的绵羊肺(由Nickel等，1979修改的肺示意图)。图2和3为在初步实验中获得的结果的示意图。通过皮下(s/c)或肺内(肺)途径使用三次剂量的单独的流感病毒抗原(流感抗原)或是使用100|LigISCOMATRIX顶佐剂(IMX=ISCOMATRIXtm佐刑)配制的抗原在三周间隔时免疫接种绵羊组。在第一次剂量前l周，在第一次剂量后2周和第二和第三次剂量后1周取血液(血清)和肺(支气管-肺泡灌洗液-BAL)样品。图2表示抗体应答[在1，2和3次剂量(l。，2°和3。)的由15pg单独的流感病毒抗原组成的制品(相当于单价剂量的目前可得到的流感疫苗)和减量的使用100|ugISCOMATRIXtm佐刑配制的流感抗原后的酶免疫测定(EIA)中的流感-特异性终点滴度。对血清和BAL(肺)样品进行IgG和IgA测定。('使用Mann-Whitney分析具有显著性差异)图3表示使用与图2相同免疫接种和取样方案和测定操作的抗原应答，其中通过皮下和肺内途径，使用极低剂量的流感抗原(0.04pg)与和不与ISCOMATRIXTM佐剂进行免疫接种。(#，'，A,§，^9使用Mann-Whitney分析具有显著性差异)就图4，6,7，9，IO而言，在对数据进行log转换后进行统计学分析并且通过方差分析(ANOVA)与Dunnett"因果分析，应用SPSS软件版本13比较各组。图4表示在使用三次剂量的为递送至上或下肺而用lOOjLigISCOMATRIXtm佐刑配制的0.04pg流感抗原免疫接种后各组绵羊中的抗体应答(图1)。在第三次剂量后1周收集血清和BAL(肺)样品。图5为在与NHS-活化的HP柱偶连的gB-特异性58-15单克隆抗体的亲和柱上纯化蛋白质后纯化的巨细胞病毒(CMV)厶gB蛋白的考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶。泳道1-4表示纯化自4种不同亲和稠合试验的AgB。图6表示三次剂量的使用lOOpgISCOMATRIXTM佐剂配制的通过皮下或肺内途径递送的CMVAgB后8只绵羊组中的CMVAgB-特异性抗体应答。测定血清和BAL样品中的抗体应答并且使用厶gB-特异性EIA测定IgG和IgA的终点滴度。该示意图表示第一次剂量后2周(初次后)和第二次剂量后1周(二次后)和第三次(第三次后)的抗体应答。('使用ANOVA的显著性差异)。图7表示对来自与图6中相同组绵羊的各只绵羊的CMV的个体百分比中和滴度。对使用lOOjagISCOMATRIXtm佐刑配制的CMV△gB的第一次剂量前l周(免疫前)，第一次剂量后2周(二次)和第二次(二次)和第三次(第三次)剂量后1周从放出的血液中取血清样品，对其测定CMV中和活性。每一循环点为在标定剂量点采集的各绵羊血清的中和百分比。就肺内和皮下递送而言，2和3次剂量的所述制品后的血清CMV-中和滴度显著高于免疫前血清。('使用ANOVA的显著性差异)。图8表示与厶gB蛋白孵育后外周血单核细胞(PBMC)的体外再刺激结果。在给予使用lOOjagISCOMATRIXTM佐剂配制的第三次剂量的CMVAgB后1周从与实施例7相同的绵羊外周血液中采集PBMC。在使用△gB刺激后，通过测定掺入细胞的氚标记胸普测定细胞增殖。将刺激指数(SI)计算为掺入使用AgB刺激的细胞的氖与掺入对照组未刺激细胞的氚之比。SI24被视为阳性增殖应答。图9表示使用用各种佐剂配制的流感抗原免疫接种的绵羊组(4只绵羊在FluNo佐剂组中；在各佐剂组中7只绵羊)中的抗体应答。免::接仲和取样方案与图l相同。('使用ANOVA的显著性差异)。图IO表示对与图9相同组绵羊的血细胞凝集素抑制测定(HAI)结果。通过火鸡红细胞上的终点抑制测定各样品的HAI滴度。('使用ANOVA的显著性差异)。发明详述本发明在一个方面中提供了用于引起或诱导人或动物受试者中的免疫应答的方法，包括对所述的受试者给予包含抗原和佐剂的组合物，其中通过肺内途径将该组合物给予受试者。优选所述的受试者为人，然而，本发明的方法还扩展至引起或诱导动物受试者的免疫应答，诸如家畜类动物(例如绵羊，母牛或马)，实验室试验动物(例如小鼠，大鼠，兔或豚鼠)，陪伴动物(例如狗或猫)或野生动物。本文所用的涉及的组合物的"肺内"或"肺部"递送是指将组合物递送至肺粘膜表面，其中组合物的活性成分(即抗原和佐剂)可以接触肺和/或粘膜免疫系统中的毛细管系统。这些术语包括组合物的"深部肺"或"下肺"递送，即将组合物递送至肺的深部支气管，细支气管和/或肺泡。优选作为气溶胶或以干粉形式将包含抗原和佐剂的本发明组合物递送入受试者肺部，其中使用喷雾器或类似装置递送所述的气溶胶或干粉。用于药物活性产品的肺内或肺部递送的标准装置或产品为本领域技术人员众所周知的。如上所述，本发明在另一个方面中提供了包含抗原和佐剂的组合物在或在制备用于对人或动物受试者肺内给药以便引起或诱导该受试者中的免疫应答的药物中的应用。本发明在另一个方面中提供了用于通过肺内途径引起或诱导人或动物免疫应答的药剂，其中该药剂为包含抗原和佐剂的组合物。答的抗原，所述的病原体诸如流感，肺炎衣原体(C/"历7心apie咖o/2/ae)，呼吸道合胞病毒，肺炎球菌等。不过，应理解还可以选择所述的可以以便引起或诱导对其它病原体的免疫应答，包括其它粘膜部位的病原体，例如幽门螺杆菌(#e7/co々acfe/";^/oW);沙门菌属(Sa7迈o/7e"a),大肠杆菌(Aco7/),霍乱，HIV或性传播疾病生物体等。按照本发明给予的抗原具有高度接受者可接受性的优点(避免了"针头恐怖症，，且易于给药)。特别地，它产生强的粘膜和全身免疫应答，表明它用于所有疫苗接种，包括在全身免疫应答时可信赖的那些。抗原还可以为肿瘤特异性或肿瘤相关抗原。优选所述的肿瘤与粘膜部位相关。与粘膜部位相关的肿瘤包括，但不限于肺部肿瘤，胃肠道肿瘤和生殖道肿瘤。抗原可以为任意的化学本体，它可以引起或诱导人或动物的免疫应答，包括，但不限于全细胞灭活的细菌或其亚单位，全灭活病毒或其亚单位，蛋白质或肽，糖蛋白，碳水化合物，神经节苷脂，多糖，脂多糖或脂肽；或它可以为上述任意的组合。还优选所述的佐剂为免疫刺激佐剂，更优选基于皂苷的佐剂，且甚至更具体地说为免疫刺激复合物(或ISC0M),诸如ISCOMATRIXtm佐剂。然而，本发明还包括其它免疫剌激佐剂，无论是单个的还是与另一种佐剂的组合的应用，所述的另一种佐剂诸如免疫刺激复合物，包括，例如脂质体；水包油型佐剂，诸如MF59;铝盐佐剂，诸如氢氧化铝和磷酸铝；脂多糖佐剂，诸如脂质A和单磷酰脂质A(MPL);寡核苷酸佐剂，诸如CpG寡核苷酸佐剂；和粘膜佐剂，诸如霍乱毒素。合适的免疫刺激佐剂由Cox和Coulter，1997作为实例描述。可以使用现存技术和那些处于研发中的技术中的任意一种将本发明的组合物递送至肺部。存在能够将药物或蛋白质制品递送至肺的机械装置的大量实例，并且喷雾器和气溶胶装置已经在治疗津喘中使用了数十年(参见Gonda，2000)。一般而言，预期这些装置通过口服吸入将物质递送至肺部。在本领域中近期的发展(参见Edwards和Dunbar,2002)包括3MCorporation(Shoyele和Slowey，2006)和InhaleTherapeuticsSystems,Inc.(Kuo和Lechuga-Ballesteros，2003)制备的那些。将本发明的组合物以免疫有效量给予人或动物受试者。本文所用的免疫有效量是指至少并非荻得期望的免疫应答或延緩所治疗的特定疾患发作，抑制其发展，或完全阻止它发作或发展所必须的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况，所治疗个体的分组，个体免疫感受态，期望防护的程度，疫苗制品，医疗状况评价和其它相关因素的不同而改变。预计该量落入可以通过常规试验测定的相对宽的范围。然而，注意到本发明特别重要的优点包括如下事实已经发现包含抗原和佐剂的疫苗的肺内给药不仅产生对抗原的全身抗体应答和粘膜应答，而且在引起或诱导这类全身和粘膜应答所需的抗原剂量显著下降的可能性。此外，本发明疫苗组合物的有效肺内给药避免了复杂的递送系统的必要性，诸如微嚢化或粘膜粘着剂或其它促进疫苗在粘膜部位摄入的技术。此外，诱导显著改善的粘膜抗体应答表明肺内免疫接种可以提高疫苗对粘膜感染的功效，并且能够减少病原体从免疫接种/感染的人中传播。特别地，粘膜抗体在改善对流感攻击的保护性免疫性方面具有巨大价值。近期WHO咨询报告(Cassetti等，2006)中描述"在小鼠模型中，粘膜IgA与对攻击的保护相关，并且在使用活的减毒流感疫苗在人中的研究中，粘膜IgA的存在与病毒脱落和对实验性感染的抗性相关。推定粘膜IgA看起来在对流感病毒感染的防护方面起作用并且更多的研究应评价疫苗诱导粘膜免疫应答的能力……"。因此，本发明的肺内递送途径在疫苗对其它感染的方面具有潜在价值，并且对需要主要全身抗体应答的疫苗提供了可替代选择的递送途径。此外，按照本发明给予的抗原诱导强的细胞免疫应答。通过肺内途径递送的抗原与佐剂刺激特异性增殖作为对抗原应答的外周血小板产生。这些细胞属于CD4+和CD8+类T细胞，它们在促进抗体应答和进行效应器官能方面起作用，诸如杀伤病毒感染的细胞。诱导细胞免疫应答和抗体应答的能力在抗病原体，特别是HIV，庖渗病毒和包括其生命周期的胞内期的细菌，诸如分枝杆菌属(/T7/co6ac^er/a)，衣原体属(c力"/z;^")和利斯特氏菌属(h'WeWa)的疫苗接种中具有潜在价值。在下列实施例中更完整地描述本发明的更多的特征。然而，应理解包括这一详细描述仅用于例证本发明的目的，并且不应以任何方式理解为对如上所述的本发明的宽泛描述的限制。实施例实施例1背景通过本发明的背景，本发明者在插套管的绵羊模型中检验了疫苗递送模式。插套管能够使局部引流淋巴结流出得到相当详细的研究。使用ISCOMATRIXTM佐剂流感疫苗作为疫苗模型在绵羊中进行这项工作。从这项工作中的主要发现在于鼻内递送非常无效，导致甚至在高抗原剂量下诱导的局部免疫性极差。这些发现提示了通过肺内途径，经将疫苗深部递送入肺的一叶中来研究疫苗在未插套管绵羊中的递送结果的计划方向的改变。实验方法血液采集束缚绵羊并且使用10mL注射器和.18G针头从颈静脉釆集10mL血液。免疫接种用于这些研究的流感抗原为蔗糖梯度纯化的A/NewCaledonia20/99H1N1病毒，已经将其灭活和洗涤剂破坏(Coulter等，1998)。抗原浓度基于血细胞凝集素含量并且通过和单径向免疫扩散测定。通过上述方法限制的CSL制备GMP级ISCOMATRIXtm佐刑(Pearse和Drane，2005)。在免疫接种前，通过混合适量的抗原与ISCOMATRIX佐剂制备疫苗制品。为了进行肺内免疫接种，用吊带谨慎束绰绵羊并且通过左侧鼻孔插入支气管镜至左肺尾叶。然后以5mL的总体积输注疫苗制品，随后输注10mL空气以确保完全递送。为了进行皮下免疫接种，使用1mL注射器和25G针头在大腿内侧递送总体积为200juL的疫苗制品。支气管肺泡灌洗液(BAL)采集为了采集支气管肺泡灌洗液(BAL)样品，将支气管镜插入束缚的绵羊以便进行疫苗接种并且使用与支气管镜连接的肺叶递送注射器10mLPBS(磷酸緩沖盐水pH7.2)。然后将相同的注射器用于通过支气管镜抽取BAL流体。通过EIA评价抗体应答通过EIA(酶免疫测定)按照一式两份评价BAL和血清样品至的抗流感抗体。简言之，用在pH9.6的碳酸盐緩冲液中的50pL10ng/mL流感抗原将96孔Maxisorp平底平板(匪C,Roskilde，Denmark)包被过夜。然后用1°/。酪蛋白钠封闭平板，此后添加1Q0iliL按照1/5的顺序样品稀释液，一式两份进行。使用缀合了马辣根过氧化物酶的兔抗绵羊总Ig(Dako，Denmark)或抗牛/羊IgA(Serotec，Oxford),随后使用兔抗小鼠马辣根过氧化物酶(Dako)检测特异性抗流感抗体结合。通过添加TMB底物(Zymed，SanFrancisco)显色，通过添加2MH2S04终止。使用Bio-TekELx800平板读出器测定450nm处的光密度并且计算抗体终点滴度。血细胞凝集抑制活性评价还检验了通过ELISA得到抗原特异性抗体应答的血清和BAL样品的血细胞凝集抑制活性(HAI)。该测定法通过测定流感病毒对红细胞聚集的抑制测定了功能性抗体滴度。使用火鸡红细胞测试样品抗卵生长的A/NewCaledonia/20/99病毒(證l)的HAI。将HAI滴度测定为抑制红细胞的流感聚集的终点稀释度。由WHOCollaboratingCentreforReferenceandResearchonInfluenza,Melbourne,Australia进行HAI测定。外周血单核细胞的体外抗原再刺激将使用注射器和18G针头从颈静脉釆集的血样(50mL)放入含1005000U/mL肝素的50mL试管。然后以800g将细胞不停止地离心20分钟，将血沉棕黄层采集入15mL试管并且用PBS稀释至8mL。使用转移用移液管将3.5mL菲科帕克加入到细胞混悬液底部，并且以1000g将样品不减速地离心30分钟。然后从Ficoll-PBS界面上采集外周血单核细胞，用PBS洗涤并且以5xl07mL重新悬浮于完全培养基(补充了10%FCS,L-谷氨酰胺，青霉素(100U/mL)，链霉素(100|ug/mL)和50jiM2-巯基乙醇的Dulbecco改良的Eagles培养基)中。为了进行抗原再刺激测定，将10QiliL细胞(5xl07孔)等分入96-孔组织培养平板，向其中一式三份加入100iliL单独的培养基或含10或20|ug/mLA/NewCaledonia流感抗原的培养基(终浓度5或10Hg/mL抗原)。在37。C下增湿孵育箱内5天培养后，用20pL1pCi氚标记胸苷将所有孔脉沖24小时。然后使用Packard采集器将细胞采集在玻璃滤膜上，放入具有Microscint闪烁液的胶巻暗盒内并且使用自动化微量培养板闪烁计数器测定P-放射。上肺和下肺免疫接种的评价接种进行有效性检验。图1(来自Nickel等，1979)例证了用于递送至上和下肺的绵羊肺的部位。使用光导纤维支气管镜将递送至'上肺，的疫苗-递送入上肺。将疫苗导入经过主气管杈lcm的主支气管。使用光导纤维支气管镜将递送至'下肺，的疫苗-深部递送入肺近尾部。导入疫苗，其中尾部支气管连接经过主气管杈10cm的尾部段支气管。如对其它实验所述进行免疫接种，放血，BAL采集和ELISA测定。绵羊接受三次剂量的0.04jtig流感抗原与lOOpgISCOMATRIXTM佐剂。结果通过经肺内途径免疫接种的抗体诱导在3次独立的实验中，通过肺内途径给绵羊免疫接种。在1。剂量后2周和2°和3。剂量后1周取血。实验1给绵羊免疫接种l，5或15^ig抗原+100)igISCOMATRIXTM佐剂。间隔三周给予三次免疫接种。在开始前和每次疫苗接种之后采集血清样品。在肺内递送的lpg佐剂流感抗原与15)Llg具有同样有效的令人意外的发现后，第二次实验检验了抗原剂量的进一步减小。实验2给绵羊免疫接种0.04，0.2，1，5或15ng抗原+100pgISCOMATRIXTM佐剂。间隔三周给予三次免疫接种。在开始前和每次疫免疫接种之后采集血清样品。这些实验证实所有抗原剂量在接受动物中均诱导显著性抗体应答-甚至在低至0.04pg抗原剂量下。较低的抗原剂量在1次剂量后诱导极少的抗体。然而，在接受动物中的免疫性与2和3次剂量后的较高抗原剂量等效。这些抗体应答包括功能性血细胞凝集(HAI)。使用0.04iug抗原和100|ugISCOMATRIX顶佐剂肺内免疫接种的绵羊中的血清IgG和IgA水平与在使用15网单独抗原(目前的疫苗剂量)皮下免疫接种获得的那些等效。低剂量肺内免疫接种在肺内产生了极为良好的特异性IgA和IgG水平(BAL-支气管肺泡灌洗液)，它优于通过皮下注射的较高剂量诱导的特异性IgA和IgG水平。实验3第三次实验评价了(i)对用低抗原剂量诱导显著免疫性的佐剂的要求，(ii)直接比较了肺内递送的低抗原剂量(O.04jLig)与皮下递送的剂量，(iii)检验了甚至较低的抗原剂量(O.008iug抗原)。第三次实验；(a)重复前两次中进行的观察；(b)证实佐剂是诱导对极低剂量抗原的免疫性必不可少的；(c)发现佐剂化肺内递送的低剂量抗原诱导类似血清抗体和超过经皮下递送的相同低抗原剂量疫苗或目前疫苗剂量的肺抗体；(d)发现经皮下注射的2次剂量以上的在第3次剂量后表现出诱导作为血清抗体的耐受或抑制作用的佐剂化极低剂量抗原减少。这种抑制作用在肺部递送后为出现；(e)发现尽管使用0.04pg抗原与ISCOMATRIXTM佐剂诱导程度较低，但是甚至使用0.008ng抗原与100pgISCOMATRIXTM佐剂共同给药的肺内免疫接种诱导显著性抗体诱导。将实验1-3的合并数据概括在图2和表1中。表1使用减少剂量的流感抗原和ISCOMATRIXtm佐刑的肺内免疫接种诱导的血细胞凝集抑制(HAI)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表l图例从3次独立的实验中合并数据。绵羊组(n-8/组，但15jLigflu组(n-12)和0.04网flu+IMX组(n=16))在左側肺免疫接种减少剂量的分裂病毒体流感抗原+100jugISCOMATRIXtm佐刑(IMX)。经皮下(S/C)给疫苗绵羊对照组免疫接种等剂量的目前的人流感疫苗的1种菌林(15ng单独的流感抗原)。绵羊间隔3周接受3次免疫接种。在初次剂量前和之后2周和二次和第三次剂量后1周从所有绵羊中采集左肺洗涤液(BAL)。然后确定抑制流感介导的血细胞凝集的这些样品的滴定。所有预先免疫接种的样品对HAI活性而言均呈阴性(未显示)。'与皮下免疫接种的对照组相比具有较高的HAI滴度(MannWhitney;p<0.004)。实验3的数据如表2和图3中所示。表2佐剂和递送途径对使用极低剂量的流感抗原免疫接种诱导的血细胞凝集抑制活性的要求<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2图例给绵羊组(n-8)的左肺免疫接种极低剂量(0.04pg)的分裂病毒体流感抗原与或不与100pgISCOMATRIXtm佐刑(IMX)。其它组接受相同的经皮下(S/C)注射的疫苗。给1个对照组绵羊经皮下免疫接种相当剂量的目前的人流感疫苗的1种菌林(15|ag单独的流感抗原)。绵羊间隔3周接受3次免疫接种。在初次免疫接种前和之后2周和二次和第三次剂量后1周从所有绵羊中采集左肺洗涤液(BAL)。然后确定抑制流感介导的血细胞凝集的这些样品的滴定。所有预先免疫接种的样品对HAI活性而言均呈阴性(未显示)。并与皮下免疫接种的对照组相比具有显著较低的HAI滴度(MannWhitney;p<0.002)。'与皮下免疫接种的对照组相比具有显著较高的HAI滴度(MannWhitney;p<0.028)。A与未佐剂化的组相比具有显著较高的HAI滴度(MannWhitney;p<0.01)。在图1和2中水平条-中位值空心条=中间值50%垂直线-1Q和9Q百分位数值IMX=ISCOMATRIXtm佐刑所述的条表示如上所述的首次(1。)，第二次(2。)和第三次(3。)免疫接种后的流感特异性终点抗体滴度。在图1中'显著高于15jugs/c组(Mann—Whitney;p<03)。在图2中#显著寸氐于15|ugs/c组(Mann-Whitney;p<0.01)。'显著高于15pgs/c組(Mann-Whitney;p<0.038)。A显著高于未佐剂化的通过相同途径递送的疫苗(Mann-Whitney;p<0.038)。§皮下，显著高于肺内递送的相同疫苗(Mann-Whitney;p<0.028)。^肺内，显著高于经皮下递送的相同疫苗(Mann-Whitney;p<0.021)。实验4本实验评价佐剂化流感抗原递送至上肺与用于上述实验的递送至下肺相比的有效性。2组8只绵羊接受含0.04|ig流感抗原和lOO)iigISCOMATRIXTM佐剂的制品至上和下肺三次并且通过EIA检'臉血清和BAL抗体应答(图4)。这些结果表明在三次剂量后，尽管递送至上肺诱导血清和BAL应答，但是通过下肺递送诱导在血清和BAL中的IgG和IgA显著更好的应答。概述使用流感抗原抗原与100pgISCOMATRIXTM佐剂肺内免疫接种证实在诱导具有HAI活性的全身和粘膜(BAL)抗体应答方面高度有效。甚至在极低抗原水平下也观察到了强血清抗体应答(D.04pg流感抗原与ISCOMATRIXTM佐剂)。这些应答远强于通过皮下注射(s/c)单独的15网流感抗原诱导的应答(作为每次使用的目前疫苗)并且可与通过皮下0.04jag流感抗原与ISCOMATRIXTM佐剂诱导的那些比拟。通过肺内递送0.04|^g流感抗原与ISCOMATRIXTM佐剂诱导的粘膜抗体应答比皮下15jag流感抗原或皮下Q.04jig流感抗原与ISCOMATRIXtm佐刑明显升高。后两者均未诱导可检测到的粘膜(肺)应々合。实施例2通过肺内途径疫苗接种的细胞免疫性诱导绵羊接受4次0.04]ug单独的流感抗原或0.04jag流感+100pgISCOMATRIXTM佐剂的肺内免疫接种。在最后一次免疫接种后1周采集外周血液并且在具有单独的培养基(阴性对照)或5或10pg流感抗原(再刺激的)的96孔平板中培养单核细胞。在5天后，用氚标记胸苷将各孔脉冲24小时。然后测定放射性以计算细胞增殖。通过用再刺激组中每分钟的平均计数(cpm)处以单独培养基的对照组的平均cpm计算刺激指数。细胞增殖研究结果如表3中所示。当给绵羊肺内单独进行抗原接种疫苗时，在外周血液中可检测到增殖应答。然而，在接受抗原与ISCOMATRIXTM佐剂的绵羊中检测到了这类应答ISCOMATRIXTM佐剂。这要求,表3来自肺内免疫接种低剂量抗原与或不与ISCOMATRIXtm佐刑的绵羊的流感刺激的外周血单核细胞的增殖应答<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例3抗原与微流化水包油型佐剂的用于通过肺内途径的制品将适当浓度的抗原(产生终浓度，产生0.01-500)ig的单剂量)与5%v/v角鲨烷，0.5%v/vTween80，在PBSpH7.2中的0.5%v/vSpan85,0.G5。/。叠氮化钠混合。然后对该混合物在19-20，00G磅/平方英寸(psi)压力下进行高压微流化。将该微流化再重复7次。通过肺内途径，经上述方法递送该制品。实施例4使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的重组巨细胞病毒gB抗原通过肺内途径免疫接种诱导的全身和粘膜免疫性为了证实和扩展使用流感抗原和ISCOMATRIXtm佐刑的观察结果，在绵羊中进行研究，以便检验通过肺内递送重组病毒抗原诱导的免疫应答。通过肺内和皮下途径递送使用ISCOMATRIXtm佐刑配制的巨细胞病毒gB糖蛋白(CMVgB)的截短形式并且通过EIA评价血清和肺中的抗体应答。此外，通过血清中的CMV-中和抗体测定评价功能性抗体的诱导。还通过评价外周血单核细胞的gB-特异性细胞增殖检验了肺内递送的制品诱导T细胞应答的能力。实验方法截短的重组人CMVgB蛋白(AgB)的生产1.含编码AgB蛋白的DNA的质粒的产生编码造以便除去蛋白质的跨膜区的CMVgB的截短形式的DM由RajivKhanna富'J教授，QueenslandInstituteofMedicalResearch,Brisbane,Australia提供。这种DNA编码含具有框内融合的gB胞质外-和胞质结构域的组织纤溶酶原激活物(TPA)的蛋白质(NCBIP06473)。同样，该DNA在编码氨基酸460/461周围区的核苷酸处被点突变，以防止表达的蛋白裂解。将DNA克隆入pCEP4载体(Invitrogen)作为Kpnl/Notl片段。在大肠杆菌中扩增所得质粒(pCEP4AgB)并且使用QiagenMaxi试剂盒制备纯化的质粒。2.哺乳动物细胞中AgB蛋白的表达用pCEP4AgB,应用293fectin转染试剂(Invitrogen)转染在37°C下摇瓶中的FreeStyleTM表达培养基(Invitrogen)内生长的FreeStyle293-F细胞培养物。通过对细胞上清液样品进行SDS-PAGE凝胶分析测定在使用潮霉素B选择中分泌的蛋白质AgB的表达。收集细胞培养物上清液并且通过以2500rpm离心净化，且然后使其通过0.45um滤膜，此后进行色谱。3.AgB蛋白质的纯化使用亲和色谦法，通过使用gB-特异性单克隆抗体58-15(Singh和Compton,2000)俘获纯化AgB蛋白质。用Prosep-A(微孑L)蛋白质A柱纯化抗体。为了纯化AgB蛋白质，使纯化的抗体与HiTrapNHS-活化HP柱(Pharmacia-Amersham)在平衡緩沖液(O.2MNa跳/0.5MNaCl，pH8.3)中偶联。使用lOOmMBorate/150mMNaClpH8.5按照1:1稀释净化的细胞培养物上清液。使稀释的上清液上HiTrap柱，用平衡緩沖液平衡并且首次用0.1M甘氨酸-HC1pH2.5,随后用平衡緩冲液稀释并且再次洗脱，这次使用0.15M氢氧化铝pH10.5。使用3MTrispH8或1M甘氨酸pH2.5中和洗脱的级分。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶电泳(图5)检验蛋白质纯度。通过测定280nm处的OD估计蛋白质浓度。使用AgB对绵羊免疫接种采血方法与实施例1中所述的那些相同。免疫接种使用应用ISCOMATRIXTM佐剂配制的AgB蛋白免疫接种绵羊组。表4).如所述的制备来自巨细胞病毒的AgB蛋白。所有绵羊接受三种疫苗剂量，其详细内容，包括采血描述在实施例1中。表4.使用ISCOMATRXTM佐剂配制的(gB蛋白通过所示途径免疫接种绵羊组<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>BAL采集如实施例1中所述采集BAL样品。通过EIA评价抗体应答用于检测绵羊IgG和IgA的方法与实施例1中的那些类似。用在PBS中100pl/孔的2pg/mL纯化的(gB蛋白将平板(96孑L)包被过夜。使用以马辣根过氧化物酶缀合的家兔抗绵羊IgG(H+L)(SouthernBiotech)检测结合的绵羊IgG。就IgG和IgA而言，TMB过氧化物酶底物分别来源于KPLKirkegaard和PerryLaboratories。通过添力口50inl/孑L0.5MH2S04终止反应。对CMV的功能性活性评价使用基于MRC-5细胞的重组人巨细胞病毒感染的中和测定法评价疫苗诱导功能性血清抗体的能力。由RajivKhanna副教授和同仁，QueenslandInstituteofMedicalResearch,Brisbane,Australia使用表达绿色荧光蛋白的重组CMVAdl69wt86-EGFP进行测定(Marschall等，2000;Wang等,2004)。在使Adl69wt86—EGFP接触血清稀释液后，通过使用流式细胞计量术(FACS)对细胞核发荧光的百分比进行定量评价病毒感染人成纤维细胞(MRC-5细胞)的能力。操作如下所述1.将来自绵羊的血清在56。C下孵育30分钟；2.将来自绵羊的血清(纯净的和在100jaLDMEM在以2倍和4倍稀释)调配在96孔托盘上；3.将25|tiL(2.5x104PFU)Adl69wt86-EGFP病毒加入到每一血清样品中；4.将血清/病毒样品在37。C下和空气中7%C02中孵育2小时；5.预先制备含有通过在37"下和空气中7%C02中孵育生长在具有10%胎牛血清(DMEM-10)的DMEM上的MRC-5细胞的48孔平底托盘，并且在使用时处于80-90%融合率；6.从MRC-5细胞中除去细胞培养基。然后将50nL每一病毒/血清样品转入含MRC-5细胞的48孔平底托盘中的相应孔，加入50jLiLDMEM并且将48孔托盘在37。C下和空气中7%0)2中緩慢振摇孵育2小时；7.从48孔托盘中抽吸接种物，用DMEM-10将各孔洗涤3次，且然将500|uLDMEM-10加入到各孔，并且在37。C下和空气中7%C02中孵育过夜；8.接下来的1天从48孔托盘中收集培养基和细胞(使用胰蛋白酶)，并且通过离心沉淀细胞；9.将沉淀重新悬浮于PBS中并且通过离心再次沉淀；10.将沉淀重新强力地悬浮于含0.2|xLlmg/mL7-AminoctinmycinD的lOOpL低渗緩冲液(0.1%杵檬酸钠，0.1%(v/v)TritonX-100)并且在室温下和黑暗中保持20分钟；11.将各沉淀样品转入适合于FACS分析的试管并且加入含1%低聚曱醛的100nLPBS。将该混合物在冰上保持30分钟，此后进行FACS分析；12.用BectonDickinsonFACSCanto分析样品并且对样品中发荧光的核百分比进行定量；13.使用公式计算各样品的中和百分比%中和=[发荧光的核的百分比(不加入血清)-发荧光核的百分比(血清样品)/发荧光的核的百分比(不加入血清)]x100。外周血单核细胞的体外抗原再刺激将使用注射器和18G针头从颈静脉采集的血样(50mL)放入含100|iL5000U/mL肝素的50mL试管。然后以800g将细胞不停止地离心20分钟，将血沉棕黄层采集入15mL试管并且用PBS稀释至8mL。使用转移用移液管将3.5mL菲科帕克加入到细胞混悬液底部，并且以1000g将样品不停止地离心30分钟。然后从Ficoll-PBS界面上采集外周血单核细胞，用PBS洗涤并且以5xl07mL重新悬浮于完全培养基(补充了10%FCS，L-谷氨酰胺,青霉素(100U/mL)，链霉素(100pg/mL)和5QpM2-巯基乙醇的Dulbecco改良的Eagles培养基)中。为了进行抗原再刺激测定，将IOO|iL细胞(5xl07孔)等分入96-孔组织培养平板，向其中一式三份加入IOO^L单独的培养基或含5，10，20或40ng/mLgB蛋白的培养基(终浓度2.5，5,10或20jng/mL抗原)。在37。C下增湿孵育箱内5天培养后，用20|LiL1iuCi氚标记胸苷将所有孔脉沖24小时。然后使用PackardHarvester将细胞采集在玻璃滤膜上，放入具有Microscint闪烁液的胶巻暗盒内并且使用自动化微量培养板闪烁计数器测定P-放射。结果肺内和皮下免疫接种使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的重组CMVAgB抗原后的免疫应答绵羊接受三次皮下或肺内剂量，即间隔3周的使用ISCOMATRIXtm佐剂配制的CMVAgB抗原。在首次剂量前l周，首次剂量后2周和第二和第三次剂量后1周采集血清和BAL样品。就抗体EIA数据而言，扣除预先免疫抗体滴度。使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的AgB的这些实验结果(图6)广泛与使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的低剂量的流感抗原(0.04pg)的实施例2中所示的那些类似，其中肺内后的血清IgG和IgA应答与三次剂量后皮下递送的那些相当。然而，与使用流感抗原制品获得的结果相反，使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的通过肺内途径递送的AgB仅在两次剂量后就诱导了与皮下递送相当的血清IgG和IgA,并且在检验到一次剂量有应答时某些更高的血清IgG(图6a和b)。就肺内抗体应答而言，免疫接种使用ISCOMATRIXtm佐刑配制的AgB的免疫接种后的应答再次与使用应用ISCOMATRIXtm佐刑配制的低剂量流感抗原进行的观察结果类似。使用ISCOMATRIXtm佐刑配制的厶gB在肺内递送时3次剂量后在肺中诱导的抗体应答显著高于皮下递送相同制品时诱导的抗体应答(图6c和d)。就功能性抗体诱导而言，对血清进行的CMV中和测定结果与在EIA中对血清IgG应答获得的那些一致性(图7)。肺内和皮下递送使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的AgB的诱导的中和抗体应答显著高于预先免疫接种血清。中和应答在3次剂量后进一步增加。结果表明通过肺内和皮下途径递送在使用ISCOMATRIXtm佐刑配制抗原时的血清中的中和抗体诱导等效性。来自使用AgB再刺激外周血单核细胞的测定结果(图8)表明使用ISCOMATRIXTM佐剂配制的通过肺内或皮下途径递送的抗原在2-3次剂量后诱导T细胞应答(刺激指数为4或4以上)。两种递送途径均诱导了等效的T细胞应答。实施例5通过疫苗接种，经肺内途径使用不同佐剂技术诱导的全身和粘膜免疫性进行这些研究以便检验非ISCOMATRIXTM的佐剂在通过肺内途径递送时是否能够诱导抗原特异性粘膜和全身抗体应答。使用应用几种可替代选择佐剂配制的流感抗原对绵羊组进行免疫接种并且将应答与ISCOMATRIXTM佐剂制品比较(表5)。表5通过肺内途径免疫接种使用各种佐剂制品配制的流感抗原的绵羊组<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实验方法佐剂制品的制备A.通过下列方法制备脂质体緩冲溶液IR緩冲液:0.14MNaCl，3mMKCl，8mMNa2HP04,0.05mMCaCl2.2H20，1.5raMKH2P04pH7.2IVD緩冲液:0.14MNaCl，3.5mMNa2HP04，1.4mMNaH2PO"2H20pH7.21.制备11.4mg/mL胆固醇，12.4mg/mL二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和MegalO在IR緩冲液中的溶液(Chol/DPPC)。2.在30分钟内通过添加IVD緩沖液逐步按照1/40稀释Chol/DPPC。3.通过在40。C下使用ST200透析过滤柱(Nephral)超滤将稀释的溶液浓缩至原始稀释体积的1/40。4.通过使用25个体积的IVD緩沖液超滤洗涤浓缩溶液。5.通过进一步超滤将Chol/DPPC溶液浓缩2倍。6.在挤压液体前将Chol/DPPC在4(TC下孵育至少1小时。7.使用安装了在整个操作中维持在42。C下的lOmLThe函barrelExtruder的液体挤压机(T.001NorthernLipidsInc.,Canada)从Chol/DPPC中挤出脂质体。8.使用1400-200OkPa压力通过0.1PC盘式过滤器对10mL批量的Choi/DPPC进行挤压。9.重复该过程至所有Chol/DPPC溶液在系统中均通过了10次。10.测定所得脂质体的胆固醇和DPPC含量并且在电子显微镜下使用负染色法检验，以便评价大小和均匀性。B.MPL的制备将脂质A单磷酰基(MPL)(SigmaL6895)以2mg/mL重新悬浮于DMSO(SigmaD2650)并且维持在4'C下至使用。C.CpG的制备将CpG(Sigma-Genosys10624856-Oil)重新悬浮于10mMTris/lmMEDTApH8中并且维持在4°C下至使用。D.佐剂制品的制备通过使用PBS作为稀释剂将相关成分混合制备佐剂制品，此后添加流感抗原(表5)。此后，使含脂质体的制品在设定为4的使用1/8英寸探头的VirSonic超声处理器中进行超声处理。这些制品接受2次5秒的超声处理，间隔30秒，所有处理均在冰上进行。免疫接种给绵羊组免疫接种表5中所述的流感抗原和佐剂制品，并且使用实施例1中所述的方法取血。BAL采集如实施例1中所述进行BAL样品采集。通过ELISA评价抗体应答如实施例1中所述进行血清和BAL样品中对流感抗原的抗体应答测定。血细胞凝集抑制活性评价如实施例1中所述对血清和BAL样品中的HAI活性进行测定。结果流感抗原与各种佐剂的制品的肺内疫苗接种后的免疫应答评价绵羊接受3周间隔的三次剂量。在首次剂量前和2周和第二和第三次剂量后1周采集血清和肺(BAL)样品。就抗体ELISA数据而言，扣除预先免疫接种抗体滴度。这些实验的结果表明不同佐剂制品在与合并抗原并且通过肺内途径递送时诱导抗体应答的能力方面可变(图9和10)。所有佐剂均比单独的抗原在诱导血清中的抗体方面赋予了一定有益性。含ISCOMATRIXtm佐刑的制品在血清和BAL中诱导的应答显著优于三次剂量后单独的抗原，并且就此而言血清IgG在两次剂量后诱导优良的应答。特别注意到证实ISCOMATRIXTM佐剂制品在两次剂量后的血清中和在三次剂量后的BAL中诱导功能性(HAI)抗体的数据(图10)。数据(图9)还提示来自将MPL添加到ISCOMATRIXtm佐刑制品中的作用，即超过单独的佐剂在血清IgG和IgA抗体中的显著增加分别在免疫接种含抗原和ISCOMATRIXtm佐刑+MPL的制品的绵羊中的1和2次剂量后出现。参考文献Casetti,M,C.，efa/.Reportofaconsultationonroleofimmunologicalassaystoevaluateefficacyofinfluenzavaccines.InitiativeforVaccineResearchandGlobalInfluenzaProgramme,WorldHealthOrganization,Geneva,Switzerland,25January2005.Wccf"e(2006〉,24(5):5"-543,Coulter,A,Wa,.Studiesonexperimentaladjuvantedinfluenzavaccines:comparisonofimmunestimulatingcomplexes(Iscoms)andoil-in-watervaccines,Kac"'加(l柳)，16(11/12):1243-1253.Cox，J.C.andCoulter,A.R,Adjuvants—aclassificationandreviewoftheirmodesofaction,K"cc/"e(1997)，15(3):248-256.Edwards,D.A.andDunbar,C.Bioengineeringoftherapeuticaerosols,及ev五"g(2002)，4:93-107.Gonda,I.Theascentofpulmonarydrugdelivery.J/VwmSt/(2000)，89:940-5Griffith,G.D.，Wfl/.Liposomally-encapsulatedricintoxoidvaccinedeliveredintratracheallyelicitsagoodimmuneresponseandprotectsagainstalethalpulmonarydoseofricintoxin.Faccf"e(1997)，15(17/18):1933-1939.Kuo，M.andLechuga-Bellesteros,D,USpatent#6518239.Marschall，M.，"fl/.Recombinantgreenfluorescentprotein-expressinghumancytomegalovirusasatoolforscreeningantiviralagents.爿w"';m'cro&to/々e她andCTiewofAera;;/(2000)，44(6):1588-1597.Nickel,R.，SchummerA.andSeiferleE.Eds.TheVisceraoftheDomesticAnimals.2ndedition.VerlagPaulParey，Berlin(1979).Pearse，M.J.andDr咖,D.ISCOMATRJXadjuvantforantigendelivery.Adv.Drug.Del.Rev.(2005)，57:465474.OyaAlpa，H.，"a/.BiodegradeablemucoadhesiveparticulatesfornasalandpulmonaryantigenandDNAdelivery.爿cfva"cecfZ>wgDe〃ve7(2005)，57:411-430,Shoyele，S，A,andSlovey,A.Prospectsforformulatingproteins/peptidesasaerosolsforpulmonarydrugdelivery,/wfer"a"o"a/Jbw/7ia〖o/尸Aw7nacewn'ay(2006),314:1-8,SinghJ.andComptonT.CharacterisationofapanelofinsertionmutantsinhumancytomegalovirusglycoproteinB.Jot/r"a/q/Tfro/og);(2000)74:1383-1392.Wang,Z.，a/.Developmentofanefficientfluorescence-basedmicroneutralisationassayusingrecombinanthumancytomegalovirusstrainsexpressinggreenfluorescentprotein.JowmWo/Wn^op'o^Me汰oA(2004),120:207.215.权利要求1.引起或诱导人或动物受试者中的免疫应答的方法，包括对该受试者给予包含抗原和佐剂的组合物，其中通过肺内途径对该受试者给予该组合物。2.权利要求l所述的方法，其中配制所述的组合物用于肺内给药。3.权利要求2所述的方法，其中所述的组合物为气溶胶或干粉形式。4.权利要求1所述的方法，其中通过口腔吸入对受试者递送所述的组合物。5.权利要求1所述的方法，其中将所述的组合物递送至受试者的下肺。6.权利要求1所述的方法，其中所述的组合物包含免疫刺激佐剂。7.权利要求6所述的方法，其中所述的组合物包含至少一种佐剂，其选自基于皂苷的佐剂，脂质体，水包油型佐剂，铝盐佐剂，脂多糖佐剂，寡核苷酸佐剂和粘膜佐剂。8.权利要求6所述的方法，其中所述的组合物包含免疫刺激复合物。9.权利要求8所述的方法，其中所述的组合物包含ISC0MATRIX佐剂。10.权利要求6所述的方法，其中所述的组合物包含与另一种免疫刺激佐剂组合的免疫刺激复合物。111.权利要求10所述的方法，其中所述的组合物包含与脂多糖佐剂组合的免疫刺激复合物。112.权利要求11所述的方法，其中所述的组合物包含与单磷酰脂质A(MPL)组合的ISCOMATRIXTM佐剂。13.权利要求1所述的方法，其中所述的抗原为引起或诱导针对粘膜病原体的免疫应答的抗原。14.权利要求13所述的方法，其中所述的粘膜病原体为流感病毒，肺炎衣原体(C力/諸/cT/a^e咖o"/ae),呼吸道合胞病毒或肺炎球菌。15.权利要求1所述的方法，其中所述的抗原为引起或诱导针对非粘膜部位的病原体的免疫应答的抗原。16.权利要求15所述的方法，其中所述的病原体为幽门螺杆菌(^"co6a"erp/7or/);沙门菌属(5W/z歸"a)，大肠杆菌(f.cW/)，霍乱，HIV或性传播疾病生物体。17.权利要求1所述的方法，其中所述的病原体为肿瘤特异性或肿瘤相关抗原。18.权利要求17所述的方法，其中所述的肿瘤与粘膜部位相关。19.权利要求18所述的方法，其中所述的肿瘤为肺部肿瘤，胃肠道肿瘤或生殖道肿瘤。20.包含抗原和佐剂的组合物在对人或动物受试者肺内给药以引起或诱导该受试者中的免疫应答中的应用，或者在制备用于对人或动物受试者肺内给药以引起或诱导该受试者中的免疫应答的药物中的应用。21.用于通过肺内途径引起或诱导人或动物受试者中的免疫应答的药剂，其中所述的药剂为包含抗原和佐剂的组合物。全文摘要引起或诱导人或动物受试者中的免疫应答的方法，包括对该受试者给予包含抗原和佐剂的组合物，其中通过肺内途径对该受试者给予该组合物。文档编号A61K39/02GK101522213SQ200780035181公开日2009年9月2日申请日期2007年8月31日优先权日2006年9月1日发明者J-P·Y·斯彻林克,M·J·派尔斯,P·苏顿,S·J·爱德华斯申请人:Csl有限公司;墨尔本大学