专利名称：：抗病毒剂的马来酸单盐及包含其的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及下式(1)的3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基]环丙基}氧基)甲基]_8，8-二曱基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯马来酸单盐，以及包含其的药物组合物
背景技术：
：式(l)化合物的相应游离碱，即，不与酸组合的化合物是在韩国专利0441638和WO02/057288中披露的新的抗病毒化合物。当前该游离碱还处于临床研究中。其具有有效的抗病毒效果，特别是抗乙型肝炎(HBV)病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)。但是，该游离碱在加热和潮湿环境下是不稳定的，当将该化合物开发成为药品时就成为了问题。
发明内容本发明人研究了各种方法来解决该游离碱的问题。研究的结果是，他们发现，本发明的式(l)的马来酸单盐具有晶体特征和优良的溶解性，不吸湿，并且在加热下是高度稳定的。因此，本发明的目的是提供式(l)的马来酸单盐。本发明还提供一种药物组合物，其包含式(1)的马来酸单盐作为活性成分。图l显示的是本发明的3-[((l-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3A5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯马来酸单盐的一个实施方案的粉末X-射线衍射图。图2显示的是本发明的3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基〗环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯马来酸单盐的一个实施方案的差示扫描量热法的结果。图3显示的是3-[((l-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4,6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯游离碱及其马来酸单盐的一个实施方案的含量(％)随时间和温度的改变图4显示的是3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯游离碱及其马来酸单盐的一个实施方案的抗乙型肝炎病毒的体外活性和细胞毒性结果。具体实施例方式本发明提供下式(1)的3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯马来酸单盐在本说明书中，除非另有说明，术语"式(l)的马来酸单盐"是指其中1倍当量的相应游离碱[即，式(l)的马来酸单盐的游离碱]与0.7-1.3倍当量、优选0.9-1.1倍当量、更优选l倍当量的马来酸形成的盐。可以通过下列方法制备式(l)的马来酸单盐，其包括用有机溶剂将游离碱和马来酸混合的步骤，这种方法是本领域公知的(参见PharmaceuticalSalts,/<〃/77<s/o尸？力ar鹏cew〃cWiWe/ce^,DonaldC.Monkhouse等人，1,66(1)，1977和Saltselectionforbasicdrugs,/"fer/7"/0/7a//ow/77a/o尸尸力ar/z/acew〃"，PhilipL.Gould,201,33，1986)。具体地，制备式(l)的马来酸单盐，包括以每ml溶剂50-1000mg游离碱的比例将游离碱溶于有机溶剂，加入(优选滴加)下述量的马来酸，并搅拌以产生固体。有机溶剂的选择并不限于可以用于形成盐的常规有机溶剂，但是优选选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙腈、氯仿、丙酮、曱醇、乙醇、丙醇、异丙醇、四氢^^喃、曱乙酮、乙酸异丙酯、二噁烷、正己烷、环己烷、乙醚、叔丁醚及其混合物。所加入的马来酸的量并不限于特定量，但优选相对于1倍当量的游离碱，为0.7-1.3倍当量、更优选为0.9-1.2倍当量，最优选为1.0-1.1倍当量。所得的固体经常规的操作方法处理，例如过滤、洗涤、干燥等等。通过上述方法制备的式(1)的马来酸单盐优选是以结晶固体获得的。也就是说，本发明的马来酸单盐能够具有特征性的晶体结构，其在粉末X-射线衍射图中在26-5.6，12.1，17.5和20.9°(26,+/-0.2)处显示显著的峰。更优选地，该马来酸单盐具有晶体结构，其在粉末X-射线衍射图中在26=5.6,10.0，12.1，13.1,17.5,18.8，20.9,22.8，24.3，25.1和26.5。(26,+/-0.2)处显示特征峰(参见图1)。这种晶形在差示扫描量热法(l(TC/分钟)中显示熔点开始吸热的峰为129°C(参见图2)。式(1)的马来酸单盐是不吸湿的，并且与相应的游离碱或其他盐相比，在加热和潮湿下具有更好的溶解性和更好的稳定性。它也是结晶固体的形式。因此，式(l)的马来酸单盐的物理-化学性质使得它适合开发为药品。如下列实验所更详细解释，发展作抗病毒剂的游离碱在加热和潮湿下是非常不稳定的，因此，难以用作药品的原料。因此，将游离碱开发成药物是非常困难的。本发明试图通过制备数种药学可接受的盐来解决游离碱的问题。在制备过程中，我们发现，一些盐并不易于获得结晶固体。本发明人成功地用马来酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、或乙磺酸获得了作为结晶固体的盐。本发明人在应激条件下进行了游离碱和以结晶固体获得的数种盐的热稳定试验。该试验表明，游离碱和马来酸单盐以外的盐在加热下是非常不稳定的。在60。C的高温下该马来酸单盐在高达8周内保持基本上完整而不分解，而游离碱会完全分解，在8周后只剩下约1%。其他晶体盐也会在2周内几乎完全分解。因此，与游离碱或其他有机盐相比，本发明的马来酸单盐显示了优越的热稳定性。此外，由其他盐并不易于得到结晶固体，但是，根据上述方法很容易即可得到马来酸单盐的结晶固体。也就是说，该马来酸单盐可以容易地用于工业规模的生产。根据pH的水平，本发明的马来酸单盐也显示了改善的溶解性。具体地，游离碱在2以下的pH水平下显示了36mg/ml以上的高溶解性，但是随着pH的升高，溶解性会急剧降低，即，在pH6以上时溶解度为1mg/ml。由于这些特性，游离碱会在胃中完全溶解和吸收，但是风险在于，当该化合物运输到具有更高pH水平的内脏器官时，它会沉淀出来。但是，在2~6.5的pH范围内，本发明的马来酸单盐显示了约7~3mg/ml的相对恒定的溶解度。实际上，在pH6.5时，该马来酸单盐的溶解性比游离碱高3倍。这显示，在药物有效性方面，该马来酸单盐将会被更多地吸收到体内，甚至杜绝了随着pH改变而在吸收后沉淀的危险。也就是说，与游离碱相比，本发明的马来酸单盐甚至在不同pH水平下都显示了优良的溶解性。基于上述物理、生理性质，使用本发明的马来酸单盐预防或治疗病毒感染具有极大的优点。因此，本发明提供预防或治疗病毒感染的药物组合物，其包含治疗有效量的式(l)的马来酸单盐和药学可接受的载体。本发明最有效治疗的病毒选自HBV和HIV。口服是施用包含式(1)的马来酸单盐作为有效成分的药物组合物的最优选形式，特别是片剂或胶嚢。作为有效成分的式(l)的马来酸单盐的"治疗有效量，，会随着受体患者的性别、年龄和饮食、要治疗的疾病的严重程度等等而不同，而这是本领域技术人员很容易即可在临床上确定的。分别披露了相应的游离碱及其效果的韩国专利0441638和W002/057288描述了药理学效果、有效剂量范围、包含式(l)的马来酸单盐作为有效成分的药物组合物的给药方法。通过意欲说明本发明的下列实施例和实验来更具体地解释本发明，但是它们并不是限制本发明的范围。HPLC条件通过高效液相色谱法(HPLC)测定3-[({1-[(2-氨基-9H-噤呤-9-基)甲基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯的游离碱及其盐的含量。具体的测定条件如下所列柱WatersSymmetryShieldC18(4.6X250mm,5卿)柱温30°C流速1.0m纟/分钟检测波长UV309nm洗脱液A.四氢呋喃/水=3/7B.四氢呋喃/水=8/2(v/v，梯度洗脱)随着时间洗脱液的混合比例时间(分钟)洗脱液A洗脱液B010001610003001003201003410004510007曲线。通过在氮气流下，在25-250。C的温度范围内，以10。C/分钟的加热速率在铝样品盘中加热2-5mg的样品。样品盘盖具有针孔，以避免样品盘内压力累加。X-射线衍射的条件将样品(约20fflg)固定到样品架上，然后置于Philipsx-射线发生器(PW1710)中。在3~40°/26的范围内获得了样品的衍射图。分析条件的详情如下所列每步的时间0.5步长0.03扫描方式分步电压/电流40kV/30mA20/6反射Cu-靶(Ni-过滤器)光源缝1.0mm检测缝0.15mm,1.0mm比较例1:3-[(U-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基]环丙基)氣基)甲基]-8，8-二曱基-3，7-二氧代_2,4,6-三氧杂-3A5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯的游离碱根据韩国专利0441638和WO02/057288中所述的方法制备标题化合物。实施例3-[(U-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基)氡基)曱基]-8，8-二曱基-3,7-二氣代-2，4,6-三氣杂-3入5-磷杂壬-1-基-新戊酸酯马来酸单盐将比较例1中获得的游离碱(100mg)溶于乙酸乙酯(lml)。加入马来酸(leq)，并将该混合物搅拌1小时以产生固体。过滤所得到的固体，用乙酸乙酯洗涤，并干燥，得到呈结晶固体的111.4mg(收率91.3%)的马来酸单盐。含量99.3%差示扫描量热法129°C(吸热111J/g)^NMR(CD30D):58.64(s,1H),8.35(s，1H),6.30(s，2H),5.62(m，4H)，4.37(s,2H)，4.17(d，2H),1.20(s，18H)，0.99(m，4H)粉末X-射线衍射谗26-5.6，10.0，12.1,13.1，17.5，18.8,20.9,22.8，24.3，25.1和26.5。(26，+/-0.2)比较例2:3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氣基)曱基]-8，g-二曱基-3，7-二氧代-2，4,6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯马来酸三盐将比较例1中获得的游离碱(5g)溶于乙酸乙酯(50ml)。加入马来酸(3eq)。将该混合物搅拌12小时，并向其中加入正己烷(20ml)以产生固体。过滤所得到的固体，用正己烷洗涤，并干燥，得到6.52g(收率78.6%)的马来酸三盐。含量98.7%^NMR(CD3OD):58.70(s，1H)，8.46(s，1H)，6.31(s，6H),5.62(m,4H),4.38(s，2H)，4.17(d，2H)，1.20(s，18H)，0.99(m,4H)比较例3:3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基)氧基)曱基]-8,8-二甲基-3,7-二氧代-2,4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-1-基-新戊酸酯对曱苯磺酸单盐将比较例1中获得的游离碱(IOOmg)溶于乙酸乙酯(lml)。加入对曱苯磺酸(leQ)，并将该混合物搅拌1小时以产生固体。过滤所得到的固体，用乙酸乙酯洗涤，并干燥，得到106.4mg(收率78.2%)的对甲苯磺酸单盐。含量99.43%^NMR(CD30D):58.74(s，1H)，8.57(s，1H)，7.68(d，2H)，7.20(d，2H),5.59(m，4H)，4.37(s，2H),4.14(d,2H)，2.34(s，3H),1.13(s，18H)，0.98(m，4H)比较例4:3-[(U-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氧基)曱基]-8，8-二曱基-3，7-二氧代-2，4,6-三氧杂-3入5-磷杂壬-1-基-新戊酸酯对甲苯磺酸二盐将比较例1中获得的游离碱(5g)溶于乙酸乙酯(50ml)。加入对甲苯磺酸(2eq)，并将该混合物搅拌1小时以产生固体。过滤所得到的固体，用乙酸乙酯洗涤，并干燥，得到7.01g(收率81.5%)的对甲苯磺酸二盐。含量97.8%NMR线OD):58.77(s，1H)，8.61(s，1H)，7.71(d，4H)，7.23(d，4H)，5.62(m,4H)，4.40(s,2H),4.17(d,2H)，2.37(s，6H)，1.20(s,18H),0.99(m，4H)比较例5:3-[(U-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)曱基]环丙基)氧基)甲基]-8，8-二曱基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3入5-磷杂壬-1-基-新戊酸酯甲磺酸单盐将比较例1中获得的游离碱(IOOmg)溶于乙酸乙酯(lml)。滴加甲磺酸(leq)，并将该混合物搅拌1小时以产生固体。过滤所得到的固体，用乙酸乙酯洗涤，并干燥，得到95.2mg(收率80.6%)的曱磺酸单盐。含量97.6%!HNMR(CD3OD):58.79(s，1H)，8.58(s，1H),5.60(m，4H)，4.38(s,2H)，4.14(d,2H)，2.70(s，3H)，1.17(s，18H)，1.01(m,4H)比较例6:3-[(U-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氣基)曱基]-8,8-二甲基-3,7-二氣代-2，4,6-三氧杂-3入5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯萘磺酸单盐将比较例1中获得的游离碱(5g)溶于乙酸乙酯(30ml)。将萘磺酸(1eq，1.97g)溶于水(5ml)后滴加入其中。在搅拌该混合物15小时后，减压完全除去溶剂。向残留物中加入乙醇和乙醚以沉淀出白色晶体。过滤所得到的沉淀，用乙醇和乙醚的溶剂混合物洗涤，并干燥，得到6.2g(收率90.0%)的萘磺酸单盐。含量91.4%^NMR(CD卿:58.48(s，2H)，8.44(s，1H)，7.95(d,1H),7.83(m，3H)，7.50(m，2H),5.63(m，4H),4.23(s,2H)，3.95(d,2H)，1.18(s，18H),1.01(ai，4H)比较例7:3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氣基)曱基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2,4,6-三氧杂-3X5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯乙磺酸单盐将比较例1中获得的游离碱(5g)溶于乙酸乙酯(30inl)。向其中滴加乙磺酸(leq,1.05g)并完全溶解。在搅拌该混合物l小时后，减压完全除去溶剂。向残留物中加入乙醇、乙醚和正己烷以沉淀出白色晶体。过滤所得到的沉淀，用乙醇和乙醚的溶剂混合物洗涤，并干燥，得到5.0g(收率82.8%)的乙磺酸单盐。含量90.0%'H醒(CDC13):58.60(s，1H)，8.51(s，1H)，5.63(m,4H)，4.32(s，2H)，4.00(d，2H)，2.92(m，2H)，1.29(m，3H)，1.19(s，卿，1.01(m，4H)实验l:加热和潮湿下稳定性的比较试验1将分别为30~70mg的实施例的马来酸单盐，比较例1-5的游离碱和盐分别置于玻璃瓶中，在40士2。C和75±5%RH下贮存。在1,4和8周后，分別取出5mg的各样品，溶于四氢呋喃/水(1/1，v/v)的溶剂混合物中，并通过HPLC分析。结果综合于下表l。表l在40°C/75%RH下的式(l)的马来酸单盐、其游离碱和其他盐的稳定性试验结果(剩余含量，％)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>0.0从表1的结果可以看出，式(l)的马来酸单盐显示了优越于相应的游离碱和其他盐的热稳定性。马来酸单盐和游离碱的稳定性结果如图3所示。实验2:加热和潮湿下稳定性的比较试验2将分别为约5~6mg的实施例的马来酸单盐，游离碱和比较例6-7的盐分别置于玻璃瓶中，在60'C的温度下]i!e:存。在1或2,4和8周后，分别取出玻璃瓶中的各样品，溶于四氢吹喃/水(1/1,v/v)的溶剂混合物中，并通过HPLC分析。结果综合于下表2。表2在6(TC下，式(l)的马来酸单盐、其游离碱和其他盐的稳定性试验结果(剩余含量，％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2的结果表明，在高温下，式(l)的马来酸单盐显示了优于相应的游离碱和其他盐的热稳定性。实验3:在各种pH下的稳定性试验将分别为523mg的实施例的马来酸单盐，比较例1的游离碱分别置于玻璃瓶中，向其中分别加入具有特定pH值的500ji1的各种磷酸盐緩冲液和磷酸溶液。将玻璃瓶置于水中维持25。C的恒温，并将该混合物搅拌1.5小时。在过滤后，通过HPLC分析滤液中的含量，并测定溶液的pH。所测定的pH值以及马来酸单盐和游离碱的溶解度如下表3所示。表3式(l)的马来酸单盐和游离碱的pH-依赖性溶解度(ing/inl)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验4:马来酸单盐和游离碱的药理学效果和细胞毒性1)细胞培养和化合物处理将产生乙型肝炎病毒的细胞抹HepG22.H5(M.A.Shells,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，1005(1987))在包含10%FBS(胎牛血清)，1%ABAM(抗生素-抗真菌素)和遗传霉素的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基；LifeTechnologies)中培养，其最终浓度经测定为400pg/ml。细胞培养至融合，用胰岛素处理，并以2xl0'个细胞/孔的密度分配到96孔板中。24小时后，更换培养基，以2天的时间，通过比较例1的游离碱和实施例的马来酸单盐的系列稀释来进行化合物的处理，通过三倍稀释，使得在20(^1的培养基中最终浓度是5()^iM8nM。每种受试样品一式两份。在第一次药物处理8天后，收集培养基，通过将细胞加热至IOO'CIO分钟来溶化细胞。为了最大程度地减少干扰DM扩增反应的物质，用水十倍稀释该培养基。以如上所述的相同方式处理对照组的未经药物处理的细胞培养基。2)药理学效果的确定使用实时PCR反应进行定量分析将如上所述预处理的培养基(6nl)加入到聚合酶/緩沖液混合物中。使用实时PCR设备(Rotor-gene2000实时循环装置C0RBETTResearch.),进4亍3分钟的95。C反应，然后将95°C/20秒-56°C/30秒-85°C/20秒反应重复45次。在85。C聚合反应时检测荧光。分别使用5'-TCAGCTCTGTATCGGGAAGC-3'和-CACCCACCCAGGTAGCTAGA-3'(Genotech)作为5'引发剂和3'引发剂，并使用5'-6-FAM-CCTCACCATACTGCACTCAGGCAA-BHQ-1-3'(Proligo)作为荧光探针。分析样品中HBVDNA的自动计算量，包括通过计算受体样品与未用药物处理的样品值的相对值，并使用统计程序PRISM(GraphPad软件公司)。3)细胞毒性确定确定药物的CCs。值，包括除去培养基，向残留物中加入lOOiiil的0.1mg/mlMTT(瘗唑兰Sigma)，在37。C下将残留物染色2小时，加入lOOjil的DMS0(二甲亚砜Sigma)，通过在室温下振荡2小时将所得混合物溶解，并在540nm处测定吸收值。由上述实验获得的比较例1的游离碱和实施例的马来酸单盐的ECs。和CC5。值如下表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从表4的结果可以看出，细胞内药理学活性的体外试验表明，比较例1的游离碱和实施例的马来酸单盐显示了类似的活性(约lmM)和细胞毒性(约7mM)。产业实用性本发明的3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基)氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3A5-磷杂壬-l-基-新戊酸酯马来酸单盐在潮湿和加热下显示了优良的稳定性，并在不同的pH水平下保持了恒定的溶解性。因此，本发明可以在很长时间内保持用于预防或治疗病毒感染，例如HBV或HIV感染的药物组合物中的活性成分的高品质。权利要求1.(3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3λ5-磷杂壬-1-基-新戊酸酯马来酸单盐。2.权利要求l的马来酸单盐，为结晶固体形式。3.权利要求2的马来酸单盐，其在粉末X-射线衍射图中在26=5.6，12.1，17.5和20.9°处具有峰。4.权利要求3的马来酸单盐，其在粉末X-射线衍射图中，在26=5.6，10.0，12.1，13.1，17.5，18.8,20.9,22.8,24.3，25.1和26.5°处具有峰。5.预防或治疗病毒感染的药物组合物，包含权利要求1-4任一项的马来酸单盐，和药学可接受的载体。6.权利要求5的组合物，其中病毒是HBV。7.权利要求5的组合物，其中病毒是HIV。全文摘要本发明涉及3-[({1-[(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基]环丙基}氧基)甲基]-8，8-二甲基-3，7-二氧代-2，4，6-三氧杂-3λ5-磷杂壬-1-基-新戊酸酯马来酸单盐，以及包含其的药物组合物。文档编号A61K31/52GK101616674SQ200880002539公开日2009年12月30日申请日期2008年1月11日优先权日2007年1月17日发明者尹祯敏,朴基淑,李芝蕙申请人:株式会社Lg生命科学