氨基酸脂质及其用途的制作方法

专利名称：氨基酸脂质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型药物递送增强剂，包括可用于将各种分子递送至细胞的 脂质。本发明提供了一系列的化合物、组合物、制剂、方法、这些增强剂的 用途，最终意在药物的递送、疗法以及疾病和病症的诊断和治疗，包括对受 试者基因表达或活性调控产生响应的那些疾病和病症的诊断和治疗。更具体
地说，本发明涉及化合物、脂质体、层状囊泡(lamdlar vesides)、乳剂 (emulsions)、胶束(micelles)、悬浮齐U(suspensions)、颗粒、溶液和其它形式的 递送增强组合物和制剂，以及这些递送物质的治疗方法和用途。
背景技术：
治疗性化合物向患者的递送会因为受限于化合物到达靶细胞或组织的能 力或受限于细胞内化合物的进入或通行而受到阻碍。治疗性物质的递送通常 受限于细胞膜。针对递送的这些屏障和限制导致需要使用比实现预期结果更 高的化合物浓度，这样就带来了毒性作用和副作用的风险。
一种递送策略是利用脂质或聚合物载体分子来改善化合物向细胞内的运 输。这些物质可以充分利用为选择性进入细胞而显现的机制，但不包括外源 分子，如核酸和蛋白。例如，阳离子脂质可以与药物试剂相互作用，并与细 胞膜接触。还可以将脂质分子并入作为药物试剂载体的脂质体或颗粒。脂质 体药物载体可以保护药物分子免受降解，同时改善细胞对其的吸收。而且， 脂质体药物载体通过静电和其它相互作用可以包裹或结合某些化合物，且可 以与带负电荷的细胞膜相互作用以开始跨膜运输。
其中，对调节性RNA的了解和RNA干扰(RNAi)、 RNAi治疗、RNA药 物、反义治疗和基因治疗的开发已经加大了对将活性核酸试剂引入细胞的有 效手段的需要。通常，核酸仅在有限的时间内在细胞或血浆内保持稳定。但 是，基于核酸的试剂能够在组合物和制剂中保持稳定，其随后可以被分散以 用于细胞递送。
本发明提供了用于改善药物和生物活性分子全身和局部递送的化合物、
10组合物、方法和用途。其中，本发明提供了新型的化合物和组合物，其用于 制备和利用能够增强生物活性分子递送效率的递送结构和载体。

发明内容
本发明提供了用于细胞内和体内递送最终作为治疗剂的药物的新型化合 物、组合物和制剂。本发明的化合物和组合物可用于递送药物至选定的细胞、 组织、器官或隔室以改变疾病状态或表型。
在一些方面中，本发明提供了递送RNA结构至细胞的化合物、组合物 和方法以便产生RNA干扰应答、反义效应或调节基因组表达。
本发明提供了一系列的氨基酸脂质，其是用于药剂的递送和给药并用于 药物递送系统中的亲脂性化合物。本发明的氨基酸脂质是包含氨基酸歹戋基和 一个或多个亲脂性尾的分子。
在一些方面中，本发明提供了如式I所示一系列的氨基酸脂质化合物及
其盐
R3-(C=0)-Xaa-Z-R4 式I
其中
Xaa是具有式-NRN-CRW-(CK))-的任意D-或L-氨基酸残基，或具有式 -(NRW-CE^R2-0^O)k的n = 2-20个氨基酸残基的肽，其中 Ri各自独立地是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链； RS各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20 个碳原子的有机基团、或C(l-5)烷基、环烷基、环垸基烷基、C(3-5)烯基、 C(3-5)炔基、C(l-5)烷酰基、C(l-5)烷酰氧基、C(l-5)垸氧基、C(l-5)烷氧基-C(l-5) 烷基、C(l-5)烷氧基-C(l-5)烷氧基、C(l-5)烷基-氨基-C(l-5)烷基-、C(l-5)二 烷基-氨基-C(l-5)垸基-、硝基-C(l-5)垸基、氰基-C(l-5)烷基、芳基-C(l-5)烷 基、4-联苯-C(l-5)烷基、羧基、或羟基；
RW各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20 个碳原子的有机基团，或C(l-5)烷基、环垸基、环烷基垸基、C(3-5)烯基、 C(3-5)炔基、C(l-5)烷酰基、C(l-5)垸酰氧基、C(l-5)垸氧基、C(l-5)垸氧基-C(l-5) 烷基、C(l-5)烷氧基-C(l-5)烷氧基、C(l-5)垸基-氨基-C(l-5)垸基-、C(l-5)二 烷基-氨基-C(l-5)烷基-、硝基-C(l-5)垸基、氰基-C(l-5)垸基、芳基-C(l-5)烷基、4-联苯-C(l-5)烷基、羧基、或羟基；
RS独立地是衍生自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾，
其中所述尾可以包含类固醇；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环垸基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
W独立地是衍生自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾，其中所述尾可以包含类固醇；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)垸基；
其中W和W中任一是如上定义的亲脂性尾，而另一个是氨基酸末端基团、或113和^都是亲脂性尾；所述氨基酸末端基团是氢、羟基、氨基、或有机保护基团；
Z是NH、 O、 S、 -CH2S-、 -CH2S(0)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些方面，本发明提供了其如式I所示的一系列氨基酸脂质化合物及其盐
R3-(C=0)-Xaa-Z-R4 式I
其中，
Xaa是具有式-NRW-CR^-(CO)-的D-或L-氨基酸残基，其中
R1是取代或未取代的氨基酸碱性侧链；
R2是氢，或C(l-5)垸基，
W是氢，或C(l-5)垸基，R"独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；R"独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；Z是NH、 0、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的l-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，所述氨基酸脂质化合物可以含有选自下述的Xaa:精氨酸、高精氨酸、正精氨酸(norarginine)、正-正精氨酸(nor-norarginine)、鸟
12氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶丙氨酸、天冬酰胺、N-乙基天冬酰胺、谷氨酰胺、4-氨基苯丙氨酸、其N-甲基化变体、和其侧链修饰性衍生物。在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以包括选自半胱氨
酸和丝氨酸的Xaa。
在一些实施方式中，W和I^可以是C(6-22)垸基，且可以相同或不同。
在一些实施方式中，113和114可以是(:(6-22)烯基，且可以相同或不同。在一些实施方式中，Xaa可以是2-20个氨基酸残基的肽。在一些实施方式中，Xaa可以具有含pKa为5-7.5的官能团的侧链。在一些方面中，氨基酸脂质化合物可以是交联的两种或多种氨基酸脂质
化合物的多聚体。
在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以是具有与氨基酸残基侧链缀合的肽的缀合物。
在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以与寡聚或聚合骨架结合。在一些实施方式中，氨基酸脂质化合物可以与药物化合物结合。在一些方面中，本发明提供了如式I所示的一系列氨基酸脂质化合物及其盐；
R3-(C=0)-Xaa-Z-R4 式I
其中
Xaa是具有式-NT^-CR^-(C^)-的D-或L-氨基酸残基，其中
R1是取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(l-5)烷基，
RW是氢，或C(l-5)烷基，W独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；R4是氢；
Z是NH、 O、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的l-40个原子组成的有机接头。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种治疗性核酸的组合物。治疗性核酸可以是基因沉默剂、RNAi诱导剂、双链RNA或mdRNA，或可以包含修饰的核苷。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种其它非氨基酸脂质或聚合脂质的组合物。在一些实施方式中，组合物可以包括胆固醇琥珀酸单酯。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种能与氨基酸脂质形成复合物的核酸的组合物。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物，其形成脂质体。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物，其形成乳剂。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物，其形成胶束分散体。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物和一种或多种药剂或生物活性试剂的组合物。
在一些方面中，本发明涵盖通过制备包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和用所述组合物处理细胞来将治疗性核酸递送至细胞的方法。
在一些实施方式中，本发明涵盖通过制备含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和用该组合物处理细胞来抑制基因在细胞中表达的方法。
在一些方面中，本发明涵盖抑制基因在哺乳动物中表达的方法，该方法包括制备含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和给哺乳动物施用该组合物。
在一些实施方式中，本发明涵盖治疗人类疾病的方法，所述疾病选自风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、包括肝炎和流感的病毒性疾病和癌症，该方法包括制备包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物和给人类施用该组合物。
在一些方面中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物在制备治疗包括风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、包括肝炎和流感的病毒性疾病和癌症的疾病的药物的用途。
在一些实施方式中，本发明涵盖包含一种或多种氨基酸脂质化合物的组合物在治疗选自风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨l斤、心脏病、包括肝炎和流感的病毒性疾病和癌症的疾病中的用途。 '
本发明概述和本发明详述以及附图、实施例和权利要求书整体上都作为本发明的公开内容。


图1:图示本发明的脂质体实施方式，其中氨基酸脂质与其它脂质一起形成双分子层状囊泡IO。在该实施方式中，脂质体外层用与一个脂质头基结合的聚乙二醇链20进行保护。脂质体外层还有用于特异性靶向细胞或组织的
配体30。在该实施方式中，脂质体囊泡包括活性干扰性RNA组分的负载，其包括浓縮的認A纳米颗粒40、双链RNA双螺旋肽缀合物50、三链mdRNA60、 dicer底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA、和具有平末端90的siRNA，其合并入本实施方式中。
图2:在JEOL 1230 TEM上获得的本发明的脂质体实施方式的透射电子显微照片，显示用氨基酸脂质C12-正Arg-C12形成的球型脂质双分子层囊泡颗粒。显微照片的长度标记是0.5微米，样品用3%乙酸铀酰染色。脂质体制剂的脂质部分是[C12-正Arg(NH3+Cr)-C12/DSPC/胆固醇/DSPE-PEG-2000]，以总脂质的摩尔百分数表示的量分别为[30%/20%/49%/1%]。脂质体包括抗流感-活性的dicer底物dsRNADX3030。
图3:图3显示了从A549细胞体外试验获得的PPIB基因敲除活性的实施例。将对干扰性-RNA的两种氨基酸脂质制剂在25、 10、 l和O.lnMRNA下的浓度应答的标准化PPIB mRNA表达值与RNAIMAX的标准化PPIBmRNA 表达值进行比较。制剂 1 是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DOPE/CHOL(50/32/18)]禾卩制齐U 2 是 [C12- 正Arg(NH3Cl)-C12/CHEMS/DLPE (50/32/18)]。通过在本发明的氨基酸脂质组合物中的干扰性-RNA获得的PPIB基因敲除可以超过用RNAIMAX。
图4:图4显示了 9L/LacZ细胞体外试验获得的LacZ基因敲除活性的实施例。将对干扰性-RNA的两种氨基酸脂质制剂在25、 10、 l和O.lnMRNA下的浓度应答的标准化(3-半乳糖苷酶表达值与RNAIMAX的标准化P-半乳糖苷酶表达值进行比较。制剂 1 是[C12-正Arg(NH3Cl)-C12/DOPE/CHOL(50/32/18)]禾B 制齐[J 2 是 [C12- 正Arg(NH3Cl)-C12/CHEMS/DLPE(50/32/18)]。通过在本发明的氨基酸脂质组合物中的干扰-RNA获得的LacZ基因敲除可以超过用RNAIMAX。
15图5:图5显示了 HepG2细胞体外试验获得的ApoB基因敲除活性的实 施例。显示了对干扰性-RNA的三种氨基酸脂质制剂在25、2.5和0.25 nM RNA 下的浓度应答的标准化ApoB mRNA表达值。制剂1是[非氨基酸阳离子脂质 /DSPC/chol./DMPE-PEG2k(40/10/48/2)]。制齐U 2和3都是[C18:l-正 Arg-C 16/CHEMS/DLPE/DMPE-PEG2k(50/32/l 6/2)]。
发明详述
本发明一般地涉及用于递送药物试剂的新型化合物、组合物和其用途。 本发明的化合物和组合物可用于将治疗剂递送至所选的细胞、组织、器官或
患^"。
本发明一般地涉及脂质的化学和脂质样结构和物质的有效药物递送的用途。
本发明的化合物和组合物可用于递送治疗剂、预防剂和诊断剂，如核酸、 多核苷酸、肽、蛋白、和小分子化合物和药物。
本发明的化合物和组合物可以下述形式用于递送治疗剂，如脂质体、层 状囊泡、乳剂、胶束、悬浮剂、颗粒和溶液。这些形式可以包括各种直径的 纳米颗粒。
在一些方面中，本发明的化合物和组合物可用于递送脂质体中的治疗剂。 在这些实施方式中，治疗剂可以称作负载。例如，图l显示了本发明的脂质 体实施方式，其中氨基酸脂质与其它脂质一起形成双分子层囊泡10。在该实 施方式中，脂质体外层通过使一个脂质头基结合聚乙二醇链20而得到保护。 脂质体外层还有特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，脂质体 囊泡包括负载分子活性干扰性RNA组分，其包括浓縮的RNA纳米颗粒40、 双链RNA双螺旋肽缀合物50、三链mdRNA60、 dicer底物RNA 70、具有 长突出端80的dsRNA和具有平末端90的siRNA，其合并入本实施方式中。 其它形式的治疗剂负载可以包括微小RNA或发夹RNA形式。
在一些方面中，本发明的化合物和组合物可以以可释放形式或组合物递 送治疗剂。可释放形式和组合物包括结合并释放活性试剂的分子、结合活性 试剂并能将帮助释放该试剂的部分放出的分子、结合活性试剂并随后在生物 隔室内调节从而帮助该试剂释放的分子，和含有与释放中间介质化合物混合的活性试剂结合的分子。 氨基酸脂质
本发明提供了一系列的氨基酸脂质，其是用于药物试剂递送和给药以及 用于药物递送系统的亲脂性化合物。本发明的氨基酸脂质是含有氨基酸残基 和一种或多种亲脂性尾的分子。
在一些实施方式中，氨基酸脂质是具有亲水性部分和亲脂性部分的分子。 该亲水性部分可以由氨基酸残基来提供。亲脂性部分可以包含一种或多种亲 脂性尾。
在一些实施方式中，氨基酸脂质是含有疏水性氨基酸残基和一种或多种 亲脂性尾的亲脂性分子。 '
在一些实施方式中，氨基酸脂质提供了相对低的细胞毒性，和相应地相 对某些其它脂质而言的细胞保护效应。在一些实施方式中，氨基酸脂质是药 学上可接受的、生物可降解的或生物相容的脂质。
氨基酸脂质可以通过在氨基酸的N-端或C-端或两端取代递送增强或脂 质样尾来形成。在一些实施方式中，氨基酸核心可以包括一种或多种氨基酸， 或可以是2-20个氨基酸残基的肽。
氨基酸脂质可以是阳离子或非阳离子，其中非阳离子包括中性和阴离子。
在本文中，物质的物理状态或离子性是针对pH约为7的环境，除非另有说明。
本发明的氨基酸脂质可以显现低细胞毒性。在一些实施方式中，本发明 的氨基酸脂质相对其它结构的脂质可以提供细胞保护效应。
在一些方面中，本发明的氨基酸脂质可以可释放形式提供治疗剂的递送。 设计的可释放形式和组合物能够提供细胞对试剂的充分摄取，从而提供治疗 效力。
可释放形式包括结合和释放活性试剂的氨基酸脂质。在一些实施方式中， 活性试剂的释放可以由酸不稳定性接头来提供。
酸不稳定性接头的实例包括含原酸酯基团、腙、顺式-乙酰甲基、縮醛、 縮酮、甲硅垸基醚、硅氮垸、亚胺、柠檬酸酐、马来酸酐、冠醚、氮冠醚、 硫代冠醚,二硫苯甲基、顺式-乌头酸、顺式-羧酸三烯烃、甲基丙烯酸、和其
17混合物的接头。
酸不稳定性基团和接头的实例在美国专利号7,098,032、 6,897,196、 6,426,086、 7,138,382、 5,563,250禾卩5,505,931中给出。
本发明的化合物和组合物的可释放形式包括这样的分子，其结合活性试 剂且能将帮助该试剂释放的部分放出。在一些实施方式中，氨基酸脂质可以 包括释放小分子(如帮助递送试剂至细胞的乙醇)的基团。氨基酸脂质可以 结合活性试剂，且随后与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的 生物隔室内运输，在酸性环境中水解以释放帮助递送试剂的乙醇。在一些实 施方式中，小分子如帮助递送试剂的乙醇可以结合到脂质组分。
在一些实施方式中，氨基酸脂质可以与释放小分子如帮助递送试剂至细 胞的乙醇的化合物混合。
本发明的化合物和组合物的可释放形式包括氨基酸脂质，其可以结合活 性试剂，随后与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室 内运输，在酸性环境中调节成阳离子形式从而帮助释放试剂。
在一些实施方式中，氨基酸脂质可以结合活性试剂，且可以与在酸性环 境中可被调节成阳离子形式从而帮助释放活性试剂的分子混合。
可水解和可调节的基团实例在美国专利号6，849，272; 6,200,599;以及 Z. H. Huang禾口 F. C. Szoka, "Bioresponsive liposomes and their use for macromolecular delivery," in: G. Gregoriadis (ed.), Liposome Technology, 3rd ed. (CRC Press 2006)中给出。
在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物的可释放形式包括能结合 活性试剂的氨基酸脂质，且可以与在酸性环境中能调节为中性形式从而帮助 释放活性试剂的脂质或化合物混合。可以随后进入酸性环境以与细胞接触， 或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输。
可从阴离子调节至中性形式的脂质的实例包括胆固醇琥珀酸单酯 (CHEMS)，如美国专利号6,897,196、 6,426,086和7,108,863中所述。
在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物的可释放形式包括能结合 活性试剂的氨基酸脂质，其可与pH-敏感性聚合材料混合。
pH-敏感性聚合材料的实例在美国专利号6,835,393中给出。
在一些实施方式中，活性试剂的释放可以通过酶可裂解肽来提供。在一些方面中，本发明提供了如式I所示的一系列的氨基酸脂质及其盐
R3-(C=0)-Xaa-Z-R4 式I
其中
Xaa是具有式-M^-CI^R2-(CK))-的任意D-或L-氨基酸残基，或具有式 -(NRW-CRiR2-(CO)L-的n = 2-20个氨基酸残基的肽，其中 W各自独立地是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链； W各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20 个碳原子的有机基团、或C(l-5)烷基、环垸基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、 C(3-5)炔基、C(l-5)烷酰基、C(l-5)垸酰氧基、C(l-5)烷氧基、C(l-5)垸氧基-C(l-5) 烷基、C(l-5)烷氧基-C(l-5)垸氧基、C(l-5)垸基-氨基-C(l-5)垸基-、C(l-5)二 烷基-氨基-C(l-5)垸基-、硝基-C(l-5)垸基、氰基-C(l-5)烷基、芳基-C(l-5)垸 基、4-联苯-C(l-5)垸基、羧基、或羟基；
RW各自独立地是氢、或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20 个碳原子的有机基团、或C(l-5)烷基、环垸基、环垸基烷基、C(3-5)烯基、 C(3-5)炔基、C(l-5)垸酰基、C(l-5)垸酰氧基、C(l-5)垸氧基、C(l-5)烷氧基-C(1-5) 垸基、C(l-5)垸氧基画C(l-5)烷氧基、C(l-5)烷基-氨基画C(l-5)垸基画、C(l-5)二 烷基-氨基-C(l-5)烷基-、硝基-C(l-5)垸基、氰基-C(l-5)烷基、芳基-C(l-5)垸 基、4-联苯-C(l-5)烷基、羧基、或羟基；
RS是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、 鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未 取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环垸基-C(3-22)烷基、C(3-22) 烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意 其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾、或下文描述的任一的其它递送 脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
R"是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、 鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未 取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22) 烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)垸氧基、或C(6-12)垸氧基-C(3-22)烷基；或任意 其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾、或下文描述的任一的其它递送 脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
19Z是NH、 O、 S、 -CH2S-、 -CH2S(0)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原 子的l-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，113独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22) 烯基；R4独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基。
残基Xaa可以是D-或L-立构中心。
在一些实施方式中，氨基酸核心可以是在肽的N-末端和C-末端具有亲 脂性尾的2-20个氨基酸残基的肽。
在一些实施方式中，R'是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链，其中侧链 取代基是由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的l-40个原子组成的有机基团。
在一些实施方式中，Z是垸基或有机接头合成聚合物，如聚乙二醇链 (PEG)，或PEG共聚物，如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯。参见如J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质，
其中 Xaa是具有通式-NRW-CRW-(C二0)-的任意D-或L-氨基酸，其中 W是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链； W是氢，或C(l-5)垸基， RW是氢，或C(l-5)垸基，
RS是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、 鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未 取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)垸基、C(3-22) 烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)垸氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)垸基；或任意 其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾，或下文描述的任一的额外递送 脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
W是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、 鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未 取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环垸基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22) 烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意 其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾，或下文描述的任一的额外递送脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
Z是NH、 O、 S、 -CH2S-、 -CH2S(0)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原 子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质， 其中
Xaa是具有通式-NRW-CWie-(C二0)-的任意D-或L-氨基酸，其中 W是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链； R"是氢，或C(l-5)烷基， W是氢，或C(l-5)垸基， R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环垸基、C(6-12)环垸基-C(3-22) 烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)垸氧基、或C(6-12)垸氧基-C(3-22) 院基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22) 烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)垸氧基-C(3-22) 烷基；
Z是NH、 O、 S、 -CH2S-、 -CH2S(〇)-、或由选自氢、碳、氧、氮和硫原 子的1-40个原子组成的有机接头。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质， 其中
Xaa是具有通式-NRW-CRiie-(CK))-的任意的D-或L-氨基酸，其中 W是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链； R2是氢，或C(l-5)烷基， W是氢，或C(l-5)垸基， R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环垸基、C(6-12)环垸基-C(3-22) 烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)垸氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22) 焼基；
R"是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环垸基-C(3-22) 烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)垸氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基；
Z是NH。在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列氨基酸脂质， 其中
Xaa是具有通式-NRW-CR^-0^O)-的任意的D-或L-氨基酸，其中 W是非氢，取代或未取代的氨基酸的碱性侧链； R2是氢，或C(l-5)垸基， W是氢，或C(l-5)垸基， R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环垸基、C(6-12)环垸基-C(3-22) 烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基、或C(6-12)垸氧基-C(3-22) 院基；
R"是取代或未取代的C(3-22)垸基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22) 烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)垸氧基、或C(6-12)烷氧基-C(3-22)
烷基；
Z是O。
可以制备阳离子氨基酸脂质，其中例如Xaa具有碱性侧链。具有碱性侧 链的氨基酸实例包括精氨酸(Arg)、高精氨酸(高Arg)(侧链 -(CH2)4NH(C=NH)NH2)、正精氨酸(正Arg) @，KCH2)2NH(C=NH)NH2)、 正-正精氨酸(正正Arg)(侧链-(CH2)NH(C:NH)NH2)、鸟氨酸、赖氨酸、高 赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶基丙氨酸(Pal)、天冬酰胺、N-乙基 天冬酰胺、谷氨酰胺和4-氨基苯丙氨酸、和其侧链修饰性衍生物。
在本文中，术语"高"，当指氨基酸时，是指额外的碳添加到侧链，而术 语"正"，当指氨基酸时，是指碳从侧链减去。因此，高赖氨酸是指侧链 -(CH2)5NH2。
可以制备阴离子氨基酸脂质，其中例如Xaa是谷氨酸或天冬氨酸。 还可以制备阳离子和阴离子氨基酸脂质，其中氨基酸侧链含有电离基团 或取代基。
可以制备非"阳离子氨基酸脂质，其中例如Xaa是亮氨酸、缬氨酸、丙氨 酸或丝氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是N^甲基精氨酸、对称的或不对称的NG，NG-二甲基精氨酸、#-甲基-高精氨酸、对称的或不对称的N已N6-二甲基-高精氨 酸、NG-甲基-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二甲基-正精氨酸、或N^
22甲基-正-正精氨酸、对称的或不对称的n^ng-二甲基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是N^乙基精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二乙基精氨酸、ng-乙基-高精氨酸、对称的或不对称的ng,ng-二乙基-高精氨 酸、ng-乙基-正精氨酸、对称的或不对称的ng,ng-二乙基-正精氨酸、或n^ 乙基-正-正精氨酸、对称的或不对称的nG,nG-二乙基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-烷基精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二烷基精氨酸、N6-烷基-高精氨酸、对称的或不对称的N6,N6-二烷基-高精氨 酸、ng-垸基-正精氨酸、对称的或不对称的n6,ng-二垸基-正精氨酸、或n^ 烷基-正-正精氨酸、对称的或不对称的ng,ng-二垸基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是含胍-或含脒-侧链的氨基酸。例如，Xaa残基 的侧链可以包括如胍基、脒基、二氢咪唑、4-胍基-苯基、4-脒基-苯基、N-脒基-哌啶、N-脒基-哌嗪、4,5-二氢咪唑、2-(N-脒基)-吡咯烷基、或4-[(2-氨 基嘧卩定基)]乙基的基团。
Xaa侧链的实例包括以下结构，及其盐的形式
<formula>formula see original document page 23</formula>适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括pKa为约5 至约7.5，或约6至约7的释放官能团。通常，弱碱的释放官能团在局部pH 高于pKa时可以表现出显著的中性形式，且在局部pH低于pKa时可以表现 出显著的离子形式。弱酸的释放官能团在局部pH高于pKa时可以表现出显 著的离子形式，且在局部pH低于pKa时可以表现出显著的中性形式。参见，如P. Heinrich Stahl, Handbook of Pharmaceutical Salts, (2002)。
在一些实施方式中，Xaa可以具有含pKa为5至7.5的官能团的侧链。 适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括l-甲基组氨酸。
适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括3,5-二碘酪 氨酸。
适合释放形式的氨基酸脂质的氨基酸的取代侧链的实例包括以下结构<formula>formula see original document page 24</formula>
氨基酸脂质的实例包括以下结构: 化合物1
化合物2<formula>formula see original document page 24</formula>
适合可释放形式的氨基酸脂质的氨基酸侧链上的取代基实例包括衍生自下述的释放官能团3,5-二碘-酪氨酸、1-甲基组氨酸、2-甲基丁酸、2-邻-茴 香基丙酸、内消旋-酒石酸、4，6-二甲基嘧啶胺、对苯二甲酸、肌酸酐、丁酸、
A^V-二甲基-l-萘胺、戊酸、4-甲基戊酸、7V-甲基苯胺、1,10-邻二氮杂菲、3-吡啶羧酸、己酸、丙酸、4-氨基苯甲酸、2-甲基丙酸、庚酸、辛酸、环己烷 羧酸、喹啉、3-氨基喹啉、2-氨基苯甲酸、4-吡啶羧酸、壬酸、三聚氰胺、8-羟基喹啉、三甲基乙酸、6-甲氧基喹啉、4-(甲基氨基)苯甲酸、对甲基苯胺、 3-(甲基氨基)苯甲酸、苹果酸、TV-乙基苯胺、2-苯甲基吡啶、3,6-二硝基苯酚、 7V^-二甲基苯胺、2,5-二甲基哌嗪、对氨基苯乙醚、5-甲基喹啉、2-苯基苯并 咪唑、吡啶、吡啶甲酸、3,5-二碘酪氨酸，对茴香胺、2-(甲基氨基)苯甲酸、 2-氨基噻唑、戊二酸、己二酸、异喹啉、衣康酸、邻苯二甲酸、苯并咪唑、 哌嗪、庚二酸、吖啶、菲啶、琥珀酸、甲基丁二酸、4-甲基喹啉、3-甲基吡 啶、7-羟基异喹啉、丙二酸、甲基丙二酸、2-甲基喹啉、2-乙基吡啶、2-甲基 吡啶、4-甲基吡啶、组胺、组氨酸、马来酸、顺式-l，2-环己烷二胺、3,5-二甲 基吡啶、2-乙基苯并咪唑、2-甲基苯并咪唑、卡可基酸、伯啶、柠檬酸、异 柠檬酸、2,5-二甲基吡啶、罂粟碱、6-羟基-4-甲基蝶啶、丄-甲状腺素、3,4-二 甲基吡啶、甲氧基吡啶、反式-l,2-环己烷二胺、2,5-吡啶二胺、/-1-甲基组氨 酸、/-3-甲基组氨酸、2,3-二甲基吡啶、黄蝶呤、1,2-丙烷二胺、iV,二乙基 苯胺、阿脲酸、2，6-二甲基吡啶、丄-肌肽、2-氨基吡啶、iV-b-丙氨酰组氨酸、 毛果芸香碱、l-甲基咪唑、1H-咪唑、2,4-二甲基吡啶、4-硝基苯酚、2-硝基 苯酚、酪氨酰胺、5-羟基喹唑啉、l，l-环丙垸二羧酸、2,4,6-三甲基吡啶、佛 罗那、2,3-二氯苯酚、1,2-乙二胺、1-氨基异喹啉、和其组合物。 在一些实施方式中，对应式I的一系列氨基酸脂质的结构如下
<formula>formula see original document page 25</formula>
结构1A 禾口<formula>formula see original document page 26</formula>
结构IB
其中R1、 R2、 RN、 R3、和R4如上定义。
在一些实施方式中，W和W独立地选自脂质样尾，其赋予充分的亲脂 特性或亲脂性，如被水/辛醇分隔开，从而递送通过膜或被细胞吸收。当用于 氮基酸脂质结构中时，这些尾提供两性分子。脂质样尾可以衍生自磷脂、糖 脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、或神经节 苷脂等，且可以包括类固醇。
在一些实施方式中，W和R"可以独立地是具有甘油骨架的脂质样尾。
在一些实施方式中，113和114可以独立地是03垸基、C4烷基、C5烷基、 C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、Cll烷基、C12烷基、 C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18垸基、C19垸基、 C20烷基、C21烷基、或C22烷基。
在一些实施方式中，W和R"可以独立地为具有下述一种结构的亲脂性
<formula>formula see original document page 26</formula>
在上述结构中，x代表直接结合到氨基酸残基端的尾原子，且记作以数字指示的其一原子，例如"18:3"。在一些实施方式中，X可以是碳、氮或氧 原子。
在一些实施方式中，W和W可以独立地是具有下述一种结构的亲脂性
尾
其中X如上定义。
在一些实施方式中，113和W可以独立地选自脂质样尾，其可以包括胆
固醇、固醇、或类固醇，如甾烷、雌垸、雄垸、孕烷、胆垸、胆甾烷、麦角
甾垸、菜油甾垸、多孔甾垸、豆甾垸、gorgostanes、羊毛甾垸、环波罗烷、 以及前述的任何固醇或动物甾醇衍生物、和其生物中间体和前体，其可以包 括如胆固醇、羊毛固醇、豆甾垸醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、 链甾醇、7-脱氢胆固醇、和其混合物和衍生物。
在一些实施方式中，W和W可以独立地选自衍生自脂肪酸样尾，如衍 生自肉豆蔻酸(C14:0)烯基、棕榈酸(C16:0)烯基、硬脂酸(C18:0)烯基、油酸 (C18:l，碳双键在碳9)烯基、亚油酸(C18:2，碳双键在碳9或12)烯基、亚麻 酸(C18:3，碳双键在碳9、 12或15)烯基、花生四烯酸(C20:4，碳双键在碳5、 8、 11或14)烯基、和二十碳五烯酸(C20:5，碳双键在碳5、 8、 11、 14或17) 烯基的尾。其它的脂肪酸样尾的实例参见Donald Voet和Judith Voet, 5/oc/2ew^^7, 3rd Edition (2005)， p. 383。
在一些实施方式中，RS和R"可以独立地衍生自类异戊二烯。
在本文中，术语."氨基酸"包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。因 此本发明的氨基酸脂质可以由遗传编码的氨基酸、天然存在的非遗传编码的 氨基酸或合成氨基酸制的。
氨基酸的实例包括Ala、 Arg、 Asn、 Asp、 Cys、 Gln、 Glu、 Gly、 His、 Ile、 Leu、 Lys、 Met、 Phe、 Pro、 Ser、 Thr、 Trp、 Tyr禾QVal。
27氨基酸的实例包括吖丁啶、2-氨基十八烷酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二
酸、2,3-二氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2,3-二氨基丁酸、2,4-二氨基 丁酸、2-氨基异丁酸、4-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,2'-二氨基庚二酸、6-氨 基己酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、锁链素、鸟氨酸、瓜氨酸、N-甲基异亮 氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、苯甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、肌 氨酸、N-乙基甘氨酸、环己基甘氨酸、4-氧代-环己基甘氨酸、N-乙基天冬酰 胺、环己基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-氯丙氨 酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-卤代苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、 3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、2-噻吩基丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚 砜、高精氨酸、正精氨酸、正-正精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、4-氨基苯丙氨酸、 N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、正 缬氨酸、O-烯丙基-丝氨酸、O-烯丙基-苏氨酸、a-氨基己酸、ot-氨基戊酸、焦 谷氨酸、和其衍生物。
在本文中，术语"氨基酸"包括(x-和(3-氨基酸。
氨基酸残基的实例可参见Fasman, Ci C户rac"ca/ /fo"必ooA 5/oc/zew&^y A/o/ecw/ar jB/o/ogy, CRC Press, Inc. (1989)。
通常，化合物可以包括一种或多种手性中心。含一种或多种手性中心的 化合物可以包括被称为"异构体"、"立体异构体"、"非对映异构体"、"对映 异构体"、"光学异构体"、或"外消旋混合物"的那些。立体化学命名公约， 例如Cahn, Ingold和Prelog的立体异构体命名法，以及确定立体化学和分离 立体异构体的方法是本领域已知的。参见，例如Michael B. Smith禾B Jerry March, Marc/^ j(ivawce(i Oz-gam'c CTzemz'M^, 5th edition, 2001 。本发明的化合 物和结构意欲包括所有可能的异构体、立体异构体、非对映异构体、对映异 构体、和/或光学异构体，其应理解为以指定化合物或结构，包括其任何混合 物、消旋或其它形式存在。 氨基酸脂质的实例包括R3-(C=0)-Arg-NH-R4，其中Arg是D-或L-精氨 酸，且113和114独立地是烷基或烯基。
氨基酸脂质的实例包括以下结构氨基酸脂质的实例包括以下结构:
化合物5 NH2 OH
y........~Ji........(CH2)14CH3
O H H
氨基酸脂质的实例包括以下结构: 化合物7
29氨基酸脂质的实例包括R、CK))-正Arg-NH-R4，其中正Arg是D-或L-正 精氨酸，且RS和W独立地是垸基或烯基。 氨基酸脂质的实例包括以下结构 化合物10
o<formula>formula see original document page 31</formula>.O
-N^^^N HN、
Y 、 NH O
化合物17
化合物18
化合物19
化合物20
'o
N、zNH HN
I.
氨基酸脂质的实例包括R、00)-正正Arg-NH-R4，其中正正Arg是D-或 L-正-正精氨酸，且尺3和114独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十氨基酸脂质的实例包括以下结构: 化合物21
O
氨基酸脂质的实例包括R、(CO)-高Arg-NH-R4，其中高Arg是D-或L-高 精氨酸，且RS和RA独立地是垸基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。
氨基酸脂质的实例包括R、(CK))-4-吡啶基丙氨酸-NH-R4，其中吡啶基丙 氨酸是D-或L-吡啶基丙氨酸，且Fe和R"独立地是烷基，如庚基、辛基、壬 基、癸基和十一烷基。R^(CO)-吡啶基丙氨酸-NH-W氨基酸脂质的实例包 括药学上可接受的吡啶盐，如4-[N-甲基吡啶基]丙氨酸氯化物。吡啶基丙氨酸氨基酸脂质的实例包括以下结构: 化合物25<formula>formula see original document page 34</formula>
氨基酸脂质的实例包括R3-(C=0)-Lys-NH-R4，其中尺3和W独立地是烷 基或烯基。
氮基酸脂质的实例包括以下结构 化合物27<formula>formula see original document page 34</formula>
<formula>formula see original document page 34</formula>
化合物29化合物34
<formula>formula see original document page 35</formula><formula>formula see original document page 36</formula>
化合物39氨基酸脂质的实例包括R3-(C=0)-His-NH-R4，其中R 和W独立地是烷
基或烯基。His氨基酸脂质的实例包括以下结构
化合物41
化合物43氨基酸脂质的实例包括R3-(C=0)-Xaa-O-R4 ，其中R3是垸基且R4是鞘氨 基醇。
氨基酸脂质的实例包括以下结构
化合物44<formula>formula see original document page 38</formula><formula>formula see original document page 39</formula>
氨基酸脂质的实例包括R3-(C=0)-Xaa-NH-R4 ，其中R3和R4是烷基或烯
基。氨基酸脂质的实例包括以下结构
化合物47<formula>formula see original document page 39</formula>
氨基酸脂质的实例包括(CIO酰基)-Arg-NH-(ClO烷基)、(C12酰 基)-Arg-NH-(C12垸基)、(C14酰基)-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰 基)-Arg-NH-(C16垸基)、(C18酰基)-Arg-NH-(C18垸基)、(CIO酰基)-高 Arg-NH-(CIO烷基)、(C12酰基)-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-高 Arg-NH-(C14垸基)、(C16酰基)-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-高 Arg-NH-(C18烷基)、(CIO酰基)-正Arg-NH-(CIO烷基)、(C12酰基)-正 Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正 Arg-NH-(C16垸基)、(C18酰基)-正Arg-NH-(C18垸基)、(CIO酰基)-正正 Arg-NH-(CIO垸基)、(C12酰基)-正正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正正 Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正正 Arg-NH-(C18烷基)、(CIO酰基)-4-Pal-NH-(CIO烷基)、(C12酰 基)-4-Pal-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal-NH-(C14烷基)、(C16酰 基)-4-Pal-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-4-Pal-NH-(C 18烷基)、(C10酰 基)-4-Pal(Me)-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C16烷基)、和(C18 酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C18烷基)。
通常，名称"C14-正Arg-C14"例如是指(C13垸基)-(OO)-正Arg-NH-(C14 垸基)，其等同于(CM酰基)-正Arg-NH-(CM垸基)。
氨基酸脂质的实例包括(CIO酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(ClO垸基)、(C12酰 基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C14垸基)、 (C16酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C16垸基)、(C18酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C 18 烷基)、(C10酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(CIO垸基)、(C12酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C14垸基)、(C16 酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-高Arg-L-高 Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(CIO垸基)、(C12酰 基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C 12烷基)、(C 14酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C 14 烷基)、(C16酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(CIO垸基)、 (C12酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C12垸基)、(C14酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C16烷基)、 (C18酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C18垸基)。
氨基酸脂质的实例包括(CIO酰基)-His-Arg-NH-(ClO烷基
基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基 基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18垸基 基)-His-Arg-NH-(ClO烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12垸基 基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基 基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-(ClO烷基) 基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基 基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18垸基 基)-His-Arg-NH-(ClO烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基 基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基 基)-His-Arg-NH-(C18烷基)。
氨基酸脂质的实例包括(CIO酰基)-His-Asp-NH-(ClO烷基 基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C 14垸基
C12酰 C16酰 C10酰 C14酰 C18酰 C12酰 C16酰 C10酰 C14酰 C18酰
C12酰 C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰 基)-His-Asp-NH-(ClO烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰 基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰 基)陽His國Asp陽NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-(C 10烷基)、(C12酰 基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰 基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰 基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰 基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰 基)-His-Asp-NH-(C18烷基)。
氨基酸脂质的实例包括(CIO酰基)-Pal-Arg-NH-(ClO烷基)、(C12酰 基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰 基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰 基)-Pal-Arg-NH-(ClO烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰 基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰 基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-(CIO烷基)、(C12酰 基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰 基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰 基)-Pal-Arg-NH-(ClO烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰 基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰 基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)。
可以将氨基酸脂质制备成聚合体或多聚体，如二聚体、三聚体或四聚体。 聚合体或多聚体可以制备自一种或多于一种的氨基酸脂质。在一些实施方式 中，聚合体或多聚体氨基酸脂类可以通过在氨基酸侧链上提供巯基或其它可 交联基团，或提供连接的或锁链的(tethered)氨基酸结构如锁链素或瓜氨酸来 制备。在其它的实施方式中，聚合体或多聚体氨基酸脂类可以用生物缀合接 头化学方法来制备。
氨基酸脂质的实例包括以下结构
41<formula>formula see original document page 42</formula>化合物48
<formula>formula see original document page 42</formula>化合物49
氨基酸脂质可以制备成具有共价结合到氨基酸侧链的肽或聚合物链的缀 合物。肽或聚合物链可以利用氨基酸侧链反应基团来结合，例如分别利用半 胱氨酸或蛋氨酸的硫醇或甲基硫醇基团，或丝氨酸的醇基，或赖氨酸的氨基。 肽或聚合物链可以利用取代或修饰的氨基酸侧链的任何反应基团来结合。各 种接头基团，如NHS、马来酰亚胺基、和生物缀合技术和接头都可以使用。
氨基酸脂质可以制备成结合寡聚或聚合框架的结构物。例如，氨基酸脂 质可以与聚乙二醇、聚丙二醇、寡核苷酸网状物或网格、聚(氨基酸)、碳水 化合物、葡聚糖、水凝胶或淀粉结合。
氨基酸脂质可以制备成结合药物化合物或组合物，或生物活性试剂的结 构物。例如，氨基酸脂质可以与核酸药物如调节性或干扰性RNA缀合。
氨基酸脂质的实例包括以下结构其中R是任意的氨基酸侧链。
本发明的化合物和组合物可以引入包括聚合体结构的增溶或功能化基团
或结构。参见，如.R. L. Du皿禾t] R. M. Ottenbrite, Polymeric Drugs and DrugDelivery Systems, ACS Symp. Ser. 469 (1991)。可以对氨基酸脂质进行衍生化以便提高溶解性例如以结合二醇，制备季铵或带电基团，结合羟基或胺基团如醇、多元醇或聚醚，或结合聚乙烯亚胺、聚乙二醇或聚丙二醇。结合的聚合体组分如聚乙二醇的分子量可以是任何值，例如200、 300、 400、 500、 600、750、 1000、 1250、 1500、 2000、 3000、 4000、 5000、 7500、 10,000、 15，000、20,000、 25,000或30,000 Da或更大。例如，聚乙二醇链可以通过氨基酸侧链的氨基或其它反应基团来结合。
通常，在本文中，除非另外说明，常规的化学术语是指指定类型的所有基团，包括具有任何数量和类型的原子的基团。例如"烯基"广义上是指具有如下文定义的2-22个碳原子的烷基，其中(C18:1)烯基是指具有18个碳原子和一个双键的烯基。
在本文中，术语"烷基"是指饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的含有1-22个碳原子的脂肪族基团。这些定义可以应用于其它基团的烷基部分，例如垸氧基、垸酰基、芳垸基和下文定义的其它基团。在本文中，术
43语"环烷基"是指饱和的，取代或未取代的含3-12个碳原子的环烷基环。在
本文中，术语"C(1-5)烷基"包括C(1)烷基、C(2)烷基、C(3)垸基、C(4)垸基、和C(5)烷基。另外，术语"C(3-22)烷基"包括C(1)烷基、C(2)烷基、C(3)烷基、C(4)烷基、C(5)垸基、C(6)垸基、C(7)烷基、C(8)烷基、C(9)烷基、C(IO)烷基、C(ll)烷基、C(12)垸基、C(13)烷基、C(14)烷基、C(15)烷基、C(16)烷基、C(17)烷基、C(18)烷基、C(19)烷基、C(20)烷基、C(21)烷基、禾B C(22)
綜基o
在本文中，术语"烯基"是指不饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的具有2- 22个碳原子和至少一个碳碳双键的垸基或环垸基。在本文中，术语"炔基"是指不饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的具有2-22个碳原子和至少一个碳碳三键的垸基或环烷基。
在本文中，术语"烷氧基"是指共价结合氧原子的垸基、环垸基、烯基或炔基。在本文中，术语"烷酰基"是指-C^O)-烷基，其还可称作"酰基"。在本文中，术语"烷酰氧基"是指-O-C(K))-烷基。在本文中，术语"烷基氨基"是指基团-NRR，，其中R和R，是氢或垸基，且至少R和R，之一是烷基。烷基氨基包括如哌啶基的基团，其中R和R'形成环。术语"烷基氨基烷基"是指-烷基-NRR'。
在本文中，术语"芳基"是指各环中有4-12个原子的任何稳定的单环、双环或多环碳环系统，其中至少一个环是芳香族化合物。芳基的一些实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯。其中芳基取代基是双环，且一个环是非芳香族化合物，应该理解结合的是芳环。芳基可以是取代或未取代的。
在本文中，术语"杂芳基"是指任何稳定的各环有4-12个原子的单环的、双环的或多环的碳环系统，其中至少一个环是芳香族化合物，且含有1-4个选自氧、氮和硫的杂原子。杂芳基的一些实例包括吖啶基、喹喔啉基、吡唑基、卩引哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基和四氢喹啉基。杂芳基包括含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
在本文中，术语"杂环"或"杂环基"是指5-22个原子的芳香或非芳香环系统，其中l-4个环原子是选自氧、氮和硫的杂原子。因此，杂环可以是杂芳基或其二氢或四氢变体。羧酸的芳基基团，如取代的苯甲酸。术语"芳烷基"在本文中是指结合烷基的芳基，例如苯基。
在本文中，术语"羧基"表示式-C(K))OH或-C(-0)0—的基团。术语"羰基"和"酰基"在本文中是指氧原子与碳原子以双键结合的基团>00。在本文中，术语"羟基"是指-OH或-0—。在本文中，术语"腈"或"氰基"是指-CN。术语"卤素"或"靴"是指氟代(-F)、氯代(画CD、溴代(陽Br)和碘代(-1)。
在本文中，术语"取代的"是指原子具有一种或多种取代或取代基，其可以相同或不同，且可以包括氢取代基。因此，术语烷基、环垸基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基和芳烷基在本文中是指包括取代变体的基团。取代的变体包括线性的、分支的和环状变体，和具有代替一个或多个结合到该基团上任意碳原子的氢的取代基的基团。可结合到基团上碳原子的取代基包括烷基、环烷基、烯基、炔基、垸氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基、芳垸基、酰基、羟基、氰基、卤代、卤代烷基、氨基、氨基酰基、烷基氨基酰基、酰氧基、芳氧基，芳氧基烷基、巯基、硝基、氨基甲酰、氨基甲酰和杂环。例如，术语乙基包括但不限于-CH2CH3、 -CHFCH3、 -CF2CH3、 -CHFCH2F、 -CHFCHF2、 -CHFCF3、匿CF2CH2F、 -CF2CHF2、 -CF2CF3、和如上所述的其它变体。通常，取代基可以进一步被任何原子或原子基团取代。
本发明的氨基酸脂质或其变体可以通过本领域已知的方法来合成。
制备各种有机基团和保护基团的方法是本领域已知的，且通常其应用和修饰也在本领域技术人员的能力范围内。参见如Stanley R. Sandler和WolfKaro, Organic Functional Group Preparations (1989); Greg T. Hermanson，Bioconjugate Techniques (1996); Leroy G Wade， Cpmpendium Of OrganicSynthetic.Methods (1980); examples of protective groups are found in T. W.Greene禾口 R G. M. Wuts， Protective Groups In Organic Synthesis (3rd ed. 1991)。
具有足够碱性的本发明的肽或蛋白组合物的药学上可接受的盐可以是与例如无机或有机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氯璜酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、醋酸、丙酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸或酒石酸，和烷烃-或芳烃磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、氯苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、萘二磺酸和樟脑磺酸的酸加成盐。
具有足够酸性的本发明的肽或蛋白组合物的药学上可接受的盐可以是碱金属盐例如钠或钾盐，或碱土金属盐例如钙或镁盐，或锌或锰盐，或铵盐，或可提供生理学上可接受阳离子的有机碱的盐，例如甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、'三乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺的盐，且包括氨基酸如精氨酸的盐，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐。参见如Berge等，J！ P/w，.66:1-19, 1977。
包含干扰性RNA制剂和脂质、肽或蛋白的本发明组合物的盐或药学上可接受的盐还可以包含干扰性RNA试剂和脂质、肽或蛋白的盐复合物。干扰性RNA试剂和脂质、肽或蛋白的盐复合物可以形成自干扰性RNA试剂的药学上可接受的盐，或形成自脂质、肽或蛋白的药学上可接受的盐。
本发明的某些化合物可以同时包括碱性和酸性官能团，这样就能将化合物制成碱或酸加成盐。
本发明的一些化合物、肽和/或蛋白组合物可以具有一个或多个手性中心和/或几何异构中心(E-和Z-异构体)，且应该理解本发明涵盖全部此类光学异构体、非对映异构体、几何异构体和其混合物。
本发明涵盖本文公开的任何和全部互变异构体、溶剂化物或非溶剂化物、水合或非水合形式、以及化合物的任何原子同位素形式、肽和/或蛋白组合物。
其它的递送脂质
在本发明的一些方面中，氨基酸脂质和其它的非氨基酸脂质可以用于递送和施用调节性RNA组分、RNA拮抗剂、干扰性RNA或核酸。更优选地，本发明的组合物可以包括一种或多种氨基酸脂质以及非氨基酸阳离子脂质和非氨基酸非阳离子脂质。
非氨基酸阳离子脂质可以是单阳离子或聚阳离子。 一些非氨基酸阳离子脂质包括中性脂质和在特定pH下大致具有零静电荷的脂质，例如，两性脂质。非氨基酸非阳离子脂质也包括阴离子脂质。
在一些实施方式中，组合物是RNA组分与氨基酸脂质和非氨基酸阳离
46子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物可以是一种或多种调 节性或干扰性RNA试剂与一种或多种氨基酸脂质和一种或多种非氨基酸阳 离子脂质的混合物或复合物。
本发明的化合物和组合物可以与各种用于递送活性试剂至有机体细胞、 组织、器官或区域的靶标配体或试剂混合或结合。靶向试剂的实例包括抗体、 受体配体、肽、蛋白、外源凝集素、(聚)糖类、半乳糖、甘露糖、环糊精、
核酸、DNA、 RNA、核酸适配子和聚氨基酸。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三 甲基氯化铵(DOTMA); 1,2-双(油酰氧基)-3-3-(三甲基铵)丙垸(DOTAP)、 1,2-双(二肉豆蔻氧基)-3-3-(三甲基氨)丙烷(DMTAP); 1，2-二肉豆蔻氧基丙基 -3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE); 二甲基二-十八烷基溴化铵(DDAB); 3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙垸)氨基甲酰)胆固醇(DC-Chol); 3卩-[N',N'-二胍基 乙基-氨基乙烷]氨基甲酰胆固醇(BGTC); 2-(2-(3-(双(3-氨基丙基)氨基)丙基 氨基)乙酰胺基)-AyV-二十四烷基乙酰胺(RPR209120);其药学上可接受的盐 和其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括1,2-二烯酰基""-丙三基-3-乙基胆碱磷 酸(EPCs)，如1，2-二油酰，-丙三基-3-乙基胆碱磷酸、1,2-二硬脂酰，-丙三 基-3-乙基胆碱磷酸、1,2-二棕榈酰-^-丙三基-3-乙基胆碱磷酸、其药学上可接 受的盐和其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基 丙烷(DSDMA)、 1，2-二油酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、 1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙垸(DLinDMA)禾Q 1,2-二亚油酰氧基 -^[^-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。
非氨基酸聚阳离子脂质的实例包括四甲基四棕榈酰精胺(TMTPS)、四 甲基四油烯基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四 肉豆蔻基精胺(TMTMS)、四甲基二油烯基精胺(TMDOS)、其药学上可接 受的盐和其混合物。
非氨基酸聚阳离子脂质的实例包括2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二十 八烷基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS); 2，5-双(3-氨基丙基氨基)^-(2-(二(2)-十八碳-9-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS-9-en); 2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(9Z, 12Z)-十八碳-9， 12-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DLinGS ); 3-(3-(N气(N^N8-二羰苯酰氧基亚精胺)氨基甲酰)胆固醇(GL-67 )、 (9Z,9，Z)-2-(2,5-双(3-氨基丙基氨基)戊氨基)丙烷-l，3-二基-二-十八碳-9-烯酸 酯(DOSPER); 2,3-二油烯氧基-N-[2(精胺羰氨基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙铵 三氟乙酸酯(DOSPA);其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括DS404-28BGTC (CAS 182056-06-0)、 DOSPER (CAS 178532-92-8)、 GL-67 (179075-30-0)、 RPR209120 (CAS 433292-13-8)、 DOGS (12050-77-7)、 DOGS (9隱en, C18:l )、 DLinGS (C18:2)、 和DOTMA (104162-48-3)。
非氨基酸阳离子脂质的实例描述于美国专利号4,897,355; 5,279,833; 6,733,777; 6,376,248; 5,736,392; 5,334,761; 5,459,127; 2005/0064595; 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5，283，185; 5,753,613;禾口 5,785,992中。
在一些实施方式中，组合物是RNA组分和氨基酸脂质和非氨基酸非-阳 离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物是一种或多种RNA 组分和一种或多种氨基酸脂质和一种或多种非氨基酸非阳离子脂质的混合物 或复合物。'
非氨基酸非阳离子脂质包括中性、两性和阴离子脂质。因此，非-阳离子 两性脂质可以包括阳离子头基。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括1,2-二月桂酰-sn-甘油(DLG); 1,2-二 肉豆蔻酰-sn-甘油(DMG); 1,2-二棕榈酰-sn-甘油(DPG); 1,2-二硬脂酰-sn-甘油(DSG); 1,2-二月桂酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DLPA); 1,2-二肉豆 蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DMPA); 1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酸
(钠盐；DPPA); 1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷脂酸(钠盐；DSPA); 1,2-二 arachidoyl-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DAPC); 1,2-二月桂酰-sn-丙三基-3-胆碱磷 酸(DLPC); 1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DMPC); 1,2-二棕榈酰 -犯-丙三基-0-乙基-3-胆碱磷酸(氯化物或三氟甲磺酸盐；DPePC); 1，2-二棕 榈酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DPPC); 1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸
(DSPC); 1,2-二月桂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DLPE); 1,2-二肉豆蔻酰 -sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DMPE); 1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺
(DPPE); 1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DSPE); 1,2-二月桂酰-sn-
48丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；DLPG); 1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油
(钠盐；DMPG); 1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸-sn-l-甘油(铵盐； DMP-sn-l-G); 1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐；DPPG); 1,2-二 硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸丙三基(钠盐；DSPG); 1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸-sn-l-甘油(钠盐；DSP-sn-l-G); 1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸-L-丝氨 酸(钠盐；DPPS); 1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(PLinoPC); 1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(POPC); l-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基 -3-磷酸甘油(钠盐；POPG); l-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(钠盐； POPG); l-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三基-3-磷酸甘油(铵盐；POPG); 1-棕榈酰 -2-40-3!1-丙三基-3-胆碱磷酸(P-lyso-PC); l-硬脂酰-2-lyso-sn-丙三基-3-胆碱 磷酸(S-lyso-PC);和其混合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合化合物和聚合物脂质缀合物或聚 合脂质，如含有分子量为300、 500、 1000、 1500、 2000、 3500或5000的PEG 范围的聚乙二醇化的脂质，包括聚乙二醇、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇 -2000)-1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-2000); N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠 盐；DMPE-MPEG-5000); N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕榈酰-311-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-2000); N-(羰基-甲氧基聚乙二醇 5000)-l,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-5000); N-(羰基-甲氧基聚乙二醇750)-1，2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐； DSPE-MPEG-750); N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂酰-sn-丙三基 -3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-2000 ) ; N-(羰基-甲氧基聚乙二醇 5000)-l,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-5000);胆 固醇硫酸酯钠盐(SCS);其药学上可接受的盐和其混合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如DOPE-PEG、 DLPE-PEG、 DDPE-PEG DLinPE-PEG、和二酰基甘油-PEG-2000或-5000。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如多支聚乙二醇化化合物， 例如DSPE-PTE020和DSPE-AM0530K。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如DSPE-PG8G甘油聚合 物脂质。非氨基酸非阳离子脂质的实例包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、 二植
烷酰磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、 1,2-二油酰""-丙三基-3-胆碱磷酸(DOPC)、 和1，2-二植烷酰-s"-丙三基-3-胆碱磷酸(DPhPC)。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括胆固醇、固醇、和类固醇，如甾烷、 雌垸、雄垸、孕烷、胆烷、胆甾垸、麦角甾烷、菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾 垸、gorgostanes、羊毛甾烷、环波罗垸、以及前述的任何固醇或动物甾醇衍 生物、和其生物中间体和前体，其包括例如胆固醇、羊毛固醇、豆甾垸醇、 二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇、和其混合
物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚乙烯二醇化的胆固醇和胆甾烷3-氧 代(Cl-22酰基)衍生物，如胆固醇乙酸酯、胆固醇花生四烯酸酯、胆固醇丁酸 酯、胆固醇己酸酯、胆固醇辛酸酯、胆固醇正癸酸酯、胆固醇十二垸酸酯、 胆固醇肉豆蔻酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇山嵛酸酯、胆固醇硬脂酸酯、 胆固醇二十四酸酯、胆固醇壬酸酯、胆固醇正戊酸酯、胆固醇油酸酯、胆固 醇反油酸脂、胆固醇芥酸酯、胆固醇庚酸酯、胆固醇反亚油酸酯、胆固醇亚 油酸脂、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自植物固醇的化合物，包括植物 甾醇、p-谷甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇、菜子甾醇、S-7-豆甾醇、5_7-燕麦甾 醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括胆汁酸、胆酸、鹅胆酸、甘氨胆酸、 牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甲基石胆酸、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括糖皮质 激素、皮质醇、氢化可的松、皮质脂酮、AS-孕烯醇酮、孕酮、去氧皮质酮、 n-OH-孕烯醇酮、17-OH-孕酮、11-去氧皮质醇、脱氢表雄甾酮、硫酸脱氢 表雄甾酮、雄烯二酮、醛甾酮、18-羟基皮质甾酮、四氢化可的松、四氢化可 的松、可的松、强的松、6a-甲基强的松、9a-氟-16a-羟基波尼松龙、9a-氟-16a-甲强龙、9a-氟皮质醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括雄激素、 睾丸激素、二氢睾酮、雄(甾)烯二醇、雄(甾)烯二酮、雄(甾)烯二酮、3a,5a-雄(甾)烷二醇、和其混合物和衍生物。非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括雌激素、 雌三醇、雌素酮、雌二醇、和其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自光甾醇和维生素D化合物的化 合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括范围从C10:0至C22:6的具有尾的脂 质，例如DDPE(C10:0)(CAS 253685-27-7)、DLPE(C 12:0)(CAS 59752-57-7 )、 DSPE (C18:0) (CAS 1069-79-0)、 DOPE (C18:l) (CAS 4004-05-1 )、 DLinPE (C18:2) (CAS 20707-71-5)、 DLenPE (C18:3) (CAS 34813-40-6)、 DARAPE (C20:4) (CAS 5634-86-6)、 DDHAPE (C22:6) (CAS 123284-81-1)、 DPhPE (16:0[(CH3)4]) (CAS 201036-16-0)。
非氨基酸阴离子脂质的实例包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱、 血小板活化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL-甘油、磷脂酰肌醇、磷 脂酰肌醇(pi(4)p、 pi(4，5)p2)、心磷脂(钠盐)、溶血磷脂、氢化磷脂、鞘脂、 神经节苷脂、植物鞘氨醇、鞘氨醇、其药学上可接受的盐和其混合物。
调节性RNA和RNA干扰的应用
在一些方面中，本发明一般地涉及调节性RNA和RNA干扰、反义治疗 剂和RNA治疗剂的递送领域。更具体地说，本发明涉及核糖核酸的组合物 和制剂，和其用作药剂和用于递送治疗剂的用途。本发明一般地涉及在RNA 干扰中使用核糖核酸在细胞或在哺乳动物中进行基因表达的基因特异性抑 制，从而改变疾病状态或表型的方法。
RNA干扰是指通过称作短干扰性RNA (siRNA)的双链RNA (dsRNA) 来进行调节的序列特异性转录后基因沉默的方法。参见Fire等，T^^m 397:806, 1998,禾P Hamilton等，Sc/ewce 2S6:950画951, 1999。 RNAi为不同菌群 和门为共有，而且确信是抵抗外来基因表达的进化保守性细胞防御机制。参 见Fire等，7>ew& 75:358， 1999。
因此RNAi是普遍存在的内源机制，其利用小型的非编码RNAs来沉默 基因表达。参见Dykxhoom, D.M.禾口 J. Lieberman, ^wzw. i ev. &377-402, 2006。 RNAi可以调节参与细胞死亡、分化和发育的重要基因。 RNAi还可以防止基因组免受由转座子和病毒编码的遗传元件侵袭。当将siRNA导入细胞中时，它可以结合内源RNAi组织机构，从而破坏含具高度 特异性的互补序列的mRNA的表达。任何致病基因和任何细胞类型或组织都 可以潜在地被标靶。该技术已经快速用于基因功能分析和药物靶的发现和确 认。控制性RNAi也具有很大的治疗前途，虽然将siRNAs导入体内细胞还 存在着许多障碍。
虽然RNAi的机制尚未完全表征，但认为是通过切割耙mRNA。 RNAi 应答涉及称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物，其调 节互补于siRNA双螺旋反义链的单链RNA的切割。耙RNA的切割发生在 siRNA双螺旋反义链的互补中间区域中(Elbashir等，GW7es Dev. ":188, 2001)。
完成RNAi的一个方法是将siRNA引入细胞或在细胞中表达siRNA。另 外一个方法是利用称作dicer的内源核糖核酸酶III酶。dicer的一个活性是将 长dsRNA加工成siRNAs。参见Hamilton等，5We"ce 2S6:950-951, 1999; Berstein等，A/a&re 4W:363， 2001 。衍生自dicer的siRNA通常是全长约21-23 个核苷酸，并有约19个碱基对双螺旋化。参见Hamilton等，见上；Elbashir 等，Dev. ":188, 2001 。实质上，可以将长dsRNA作为siRNA的前体导 入细胞。
本发明提供了一系列的组合物、制剂和方法，其包括调节性RNA、干扰 性核酸或其前体与各种组分包括脂质、氨基酸脂质和天然或合成的聚合物的 组合。
在本文中，术语"dsRNA"是指任何核酸分子，其含有至少一个核糖核 苷酸分子且能抑制或下调基因表达，例如以序列特异性方式通过促进RNA 干扰("RNAi")或基因沉默。本发明的dsRNAs可以是适合Dicer的底物， 或是适合与RISC结合以通过RNAi来调节基因沉默的底物。dsRNA的一条 或两条链可以进一步包括末端磷酸基团，如5'-磷酸或5',3'-二磷酸。在本文 中，dsRNA分子，除了至少一个核糖核苷酸之外，可以进一步包括取代、化 学修饰的核苷酸、和非核苷酸。在一些实施方式中，dsRNA分子包括高至约 100%的核苷酸位置的核糖核苷酸。
dsRNA分子的实例可参见例如美国专利申请号11/681,725、美国专利号 7,022,828和7,034,009、禾n PCT国际申请公开号WO/2003/070897。
52修饰性核苷酸的实例参见美国专利号6，403，566、 6,509,320、 6,479,463、 6,191,266、 6,083,482、 5,712,378、和5,681,940。修饰性核苷酸可以具有以下 结构-
其中，X是0或CH2， Y是O，且Z是CH2; R^选自基团腺嘌呤、胞 嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和杂环，其中杂环是选自基团 取代的l,3-二嗪、未取代的1，3-二嗪和未取代的7H咪唑并[4,5]1,3-二嗪；且 R2、 R3独立地选自基团H、 OH、 DMTO、 TBDMSO、 BnO、 THPO、 AcO、 BzO、 OP(NiPr2)0(CH2)2CN、 OP03H、 二磷酸盐和三磷酸盐，其中R2和R3 同时可以是PhCH02、 TIPDS02或DTBS02。在本文中，缩写"Ac"是指乙 酰基；縮写"Bn"是指苯甲基；縮写"Bz"是指苯甲酰基；縮写"DMT"是 指二甲氧基三苯甲基；縮写"THP"是指四氢吡喃基；縮写"TBDMS"是指 叔丁基二甲基甲硅烷基；縮写"TIPDS"是指四异丙基二甲硅烷基；和缩写 "DTBS"是指二(叔丁基)甲硅垸基。
另夕卜，在本文中，术语"dsRNA"、 "RNAi诱导剂"和"RNAi制剂"与 用于描述能调节序列特异性RNAi的核酸分子，包括内消旋双螺旋RNA (mdRNA)、带切口的dsRNA (ndsRNA)、缺口的dsRNA (gdsRNA)、短干 扰性核酸(siRNA)、 siRNA、微小RNA (miRNA)、单链RNA、短发夹RNA (shRNA)、短干扰性寡核苷酸、短干扰性取代的寡核苷酸、短干扰性修饰的 寡核苷酸、化学修饰的dsRNA、和转录后基因沉默型RNA (ptgsRNA)、以 及上述任一的前体是同义的。
术语"大双链(ds)RNA"是指大于约40个碱基对(bp)至约100 bp或更 大，尤其是高至约300 bp至约500 bp的任意双链RNA。大dsRNA序列可以 代表mRNA片段或完整的mRNA。双链结构可以通过自身互补的核酸分子 形成或通过两种或多种明显的互补核酸分子链退火形成。
在一些方面中，dsRNA包括包含第一链(反义)和第二链(正义)的两 个分离的寡核苷酸，其中所述反义链和所述正义链是自身互补的(即各链含有与另一个链核苷酸序列互补的核苷酸序列，且两个分离的链形成双螺旋或
双链结构，例如，其中双链区是约15至约24个碱基对，或约26至约40个 碱基对)；反义链包括互补于靶核酸分子(如人mRNA)中的核苷酸序列的 核苷酸序列或其部分；且正义链包括对应于(即同源于)靶核酸序列(如对 应于靶核酸约15至约25个核苷酸或约26至约40个核苷酸的正义链或其部 分)中的核苷酸序列或其部分。
在一些实施方式中，dsRNA可以组装自单一寡核苷酸，其中dsRNA的 自身互补的正义和反义链一起通过核酸基接头或非核酸基接头相连接。在一 些实施方式中，dsRNA分子的第一 (反义)链和第二 (正义)链通过如本文 描述的和本领域所已知的核苷酸或非核苷酸接头共价连接。在一些实施方式 中，第一 dsRNA分子通过本领域已知的核苷酸或非核苷酸接头与至少一个第 二 dsRNA分子共价连接，其中第一 dsRNA分子可以与多个其它dsRNA分子 (相同或不同)或其组合物连接。在一些实施方式中，连接的dsRNA可以包 括与连接的dsRNA形成内消旋双螺旋的第三链。
在一些方面，本文所述的dsRNA分子形成内消旋双螺旋RNA(mdRNA)， 其具有三个或更多的链，例如'A'(第一或反义)链、'S1'(第二)链和'S2'(第 三)链，其中'S1'和'S2'链互补并形成具有'A'链的非重叠区的碱基对(bp)(如 mdRNA可以具有A:SlS2形式)。Sl、 S2或更多的链共同本质上含有'A'链的 正义链。通过'S1邻'A'链退火形成的双链区与通过'S2邻'A'链退火形成的双链 区不相同且非重叠。mdRNA分子是"缺口"分子，意思是范围为0个核苷 酸到高至约IO个核苷酸的"缺口"。在一些实施方式中，A:S1双螺旋与A:S2 双螺旋被从'A'链的至少一个非配对核苷酸(高至约10个非配对核苷酸)获 得的缺口分开，所述缺口位于A:S1双螺旋和A:S2双螺旋之间，而且不同于 一种或多种'A'、 'Sl'或'S2'链的3'-端的任何一个或多个非配对核苷酸。在一些 实施方式中，A:S1双螺旋与A:B2双螺旋被在A:S1双螺旋和A:S2双螺旋间 的零核苷酸缺口分开(即其中仅两个核苷酸间的磷酸二酯键是不完整的或缺 失多核苷酸分子的缺口)，其也称作带切口的dsRNA(ndsRNA)。例如，A:SlS2 可以由具有结合总共约14个碱基对至约40个碱基对的至少两个双链区的 dsRNA组成，且双链区被约O至约IO个核苷酸的缺口分开，任选地具有平 末端，或A:S1S2可以由被高至IO个核苷酸的缺口分开的具有至少两个双链
54区的dsRNA组成，其中至少一个双链区含有约5个碱基对至13个碱基对。 如本文所述，含有三条或更多条链的dsRNA可以被称作"内消旋双螺旋"
RNA (mdRNA)。 mdRNA分子的实例可以参见美国临时专利申请60/934,930
和60/973,398。 ，
dsRNA或大dsRNA可以包括取代或修饰，其中所述取代或修饰可以在
磷酸骨架键、糖、碱基或核苷中。所述核苷取代可以包括天然的非标准核苷 (如5-甲基尿苷或5-甲基胞苷或2-硫代胸腺嘧啶核糖核苷)，且所述骨架、
糖或核苷修饰可以包括烷基或杂原子取代或添加，如甲基、垸氧基烷基、卤
素、氮或硫、或本领域已知的其它修饰。
另外，在本文中，术语"RNAi"的意思等同于用于描述序列特异性RNA
干扰如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学的其它术语。例如，本发明
的dsRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平或其组合上通过表观遗
传学沉默基因。
在一些方面中，本发明提供了包括靶向一种或多种基因或靶转录物的一 种或多种RNAi诱导剂，以及一种或多种递送组分的组合物。递送组分的实 例包括脂质、肽、聚合物、聚合脂质和其缀合物。
本发明的组合物和制剂可以用于将RNAi诱导实体递送如dsRNA、 siRNA、 mdRNA、 miRNA、 shRNA或RNAi诱导载体递送至包括人在内的完 整的哺乳动物患者的细胞内，而且可以用于将这些制剂递送至培养中的细胞 内。
本发明还提供了将一种或多种RNAi诱导剂或实体递送至哺乳动物体内 的细胞、器官和组织的方法。在一些方面，可以通过不同的途径引入包含 RNAi诱导实体以使其在体内转运并被一种或多种器官或组织内的细胞吸 收，在此可以调控耙转录物的表达。
通常，本发明包括RNAi诱导剂，其是预防和治疗以各种异常途径为特 征的疾病或病症的有用治疗剂。例如，侵染哺乳动物的病毒可以通过控制宿 主细胞的细胞机制来进行复制。参见如Fields Virology (2001)。因此，dsRNAs 可用于破坏控制病毒产生或复制的病毒路径。
本发明包括通过利用具有广谱抵抗靶病毒株效力的一种或多种治疗性 RNAi诱导剂来治疗或预防患者病毒侵染的方法。本发明的RNAi诱导剂可
55以耙向已知的病毒变体株或病毒变体中的病毒基因序列，并且在这些变体内 表现出靶病毒基因的序列特异性基因沉默。例如，RNAi诱导剂可以靶向和 表现出抵抗流感病毒季节菌株以及流感变体菌株的效力。本发明的组合物和制剂可以用于递送药物制剂或生物活性试剂至各种体外细胞。体外递送的细胞实例包括表皮细胞如A549、永久细胞系如HeLa、 肝细胞瘤细胞如HepG2、犬胶质肉瘤细胞如9L/LacZ、人单核细胞如THP-1、 Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)、各种纤维原细胞系、和在存在和缺失各种 血清的培养基中的原代细胞等。本发明的组合物和制剂可用于递送药物试剂或生物活性试剂至各种体内 细胞，组织或器官。体内递送试剂的方法包括局部、肠内和肠胃外途径。旌 血递送试剂的方法实例包括颗粒或液滴吸入、鼻或鼻咽滴剂、颗粒、或悬浮 液递送、透皮和经黏膜途径、以及通过肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、心 脏内、脑脊髓膜内、骨内、腹膜内和硬膜外的注射或灌输途径。在一些实施方式中，试剂可以通过直接接触来源于哺乳动物患者的细胞， 组织或器官离体给药。利用本发明的组合物或制剂来递送的药物试剂或生物活性试剂可以是任 何形式，包括例如纯净形式、结晶形式、固体形式、纳米颗粒、浓縮形式、 复合物形式、或缀合物形式。本发明还提供了递送一种或多种RNAi诱导实体至哺乳动物体内的器官 和组织的方法。在一些实施方式中，可以通过不同的途径引入包含RNAi诱 导实体、 一种或多种氨基酸脂质、和一种或多种其它的脂质组分的组合物以 使其在体内转运并被一种或多种器官或组织内的细胞吸收，在此可以调控靶 转录物的表达。本发明提供了含有递送核酸和基因沉默RNA治疗剂的各种脂质的药学 上可接受的核酸组合物。具体地说，本发明提供了用于体外和体内递送 dsRNAs以降低、下调或沉默靶核酸序列翻译或基因表达的组合物和方法。 这些组合物和方法可用于预防和/或治疗哺乳动物中的疾病。在本发明的示例 性的方法中，将核糖核酸分子如siRNA或shRNA与氨基酸脂质接触以配制 成能施用于细胞或患者如哺乳动物的组合物。在一些实施方式中，本发明提 供了通过使含核酸的组合物与细胞接触来在细胞内递送siRNA或shRNA的方法。在示例性的实施方式中，本发明包括包含核酸分子如双链RNA (dsRNA)、短干扰性RNA (siRNA)或短发夹RNA (shRNA)的组合物， 所述核酸分子与氨基酸脂质和聚合脂质混合或复合以形成提高核酸分子细胞 内递送的组合物。在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包括dsRNA 和可以是阳离子或非阳离子的一种、两种或多种氨基酸脂质。在某些变例中， 递送组合物可以包含dsRNA、氨基酸脂质、和一种或多种聚合脂质。在一些 实施方式中，递送组合物可以包括dsRNA、氨基酸脂质、 一种或多种其它脂 质、和一种或多种聚合脂质。本发明的组合物可以形成稳定颗粒，其能引入 作为干扰性RNA制剂的dsRNA。本发明的组合物和制剂可以包括进一步的 递送增强组分或赋形剂。在一些实施方式中，本发明的组合物包括直径约5 nm至约400 nm的稳定 的RNA脂质颗粒。在一些实施方式中，颗粒可以具有约IO nm至约300 nm的 均匀直径。在一些实施方式中，颗粒可以具有约50 nm至约150 nm的均匀直 径。在本发明的示例性的组合物中，双链RNA可以与氨基酸脂质混合或复 合，以形成相比于使靶细胞与裸dsRNA接触能提高dsRNA细胞内递送的组合 物。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占脂质总量约0.5%至约 70%(摩尔％)的一种或多种氨基酸脂质，并包括任何聚合组分但不包括RNA 组分的递送增强组分。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约10% 至约55%的一种或多种氨基酸脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可 以包括约15%至约35%的一种或多种氨基酸脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占脂质总量约2%至约95% (摩尔％)的一种或多种非氨基酸非阳离子脂质，和包括任何聚合组分但不 包括RNA组分的递送增强组分。递送在一些实施方式中，本发明的组合物 可以包含约20%至约75%、或约45%至约75%、或约45%至约55%的一种或 多种非阳离子脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含约10%至 约50%的一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占脂质总量约0.2%至约5720% (摩尔％)的一种或多种聚合脂质，和包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。递送在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约0.5%至约10%的一种或多种聚合脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物 可以包含占组合物约1%至约5%的一种或多种聚合脂质。核酸治疗剂组合物和应用在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物患者疾病或病症的 方法。可以递送向患有与能被该组合物降低、减少、下调或沉默的基因表达 或过表达相关疾病或病症的患者施用包含干扰性RNA、氨基酸脂质、非氨基 酸非阳离子脂质、聚合脂质、和一种或多种递送增强组分或赋形剂的治疗有 效量的本发明组合物。本发明包括通过向患者施用治疗有效量的组合物来治疗肺部疾病，如呼 吸困难、哮喘、囊肿性纤维化、肺纤维化、慢性障碍性肺病、支气管炎或气 肿的方法。本发明包括治疗风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、病毒性疾 病(包括肝炎和流感)、或癌症的方法。制备脂质体的方法参见例如G. Gregoriadis, Liposome Technology (CRC Press 1984)， M. J. Ostro, Liposomes (Marcel Dekker 1987); Subhash C. Basu和 Manju Basu, Liposome Methods and Protocols (2002)。可以首先在适合的培养基如细胞培养基中将核酸组分、氨基酸脂质和任 何其它组分混合在一起，然后添加一种或多种其它脂质或化合物至该混合物。 可选地，可以首先在适合的培养基如细胞培养基中混合氨基酸脂质，然后添 加核酸组分。在本发明的一些实施方式中，将dsRNA与一种或多种氨基酸脂质、或一 种或多种氨基酸脂质和非氨基酸非阳离子脂质的组合物混合。在一些实施方式中，氨基酸脂质转染/递送制剂可以通过干燥制剂的再水 合来制备。脂质可以溶解在CHC13中，氮气中干燥，并在如pH 7.4下在10 mM HEPES、 5%葡萄糖中再水合，且经声波处理形成脂质体。脂质体可以在 HEPES葡萄糖中稀释。dsRNA可以在10mMHEPES、 5%葡萄糖(pH7.4) 中以0.0008 nmol/mL稀释。1体积的脂质体可以加入到1体积dsRNA中并58涡旋(自组装)，以提供终dsRNA浓度为100 nM至6.25 nM dsRNA。该混 合物可以在存在细胞培养基时稀释1-4份。干扰性RNA试剂可以与氨基酸脂质或聚合脂质复合或缀合，并与一种 或多种非氨基酸非阳离子脂质，或一种或多种非氨基酸非-阳离子和非氨基酸 阳离子脂质的组合物混合。干扰性RNA试剂和氨基酸脂质可以首先混合在一起，然后加入一种或 多种非氨基酸非阳离子脂质，或加入到适合培养基如细胞培养基中的非氨基 酸非阳离子和非氨基酸阳离子脂质组合。可选地，可以首先混合氨基酸脂质 和非氨基酸脂质组分，然后加入适合培养基中的RNA试剂。在一些实施方式中，本发明包括胶束分散组合物，其含有与氨基酸脂质 和分散剂混合和复合的药物或活性试剂，从而形成能提供细胞内递送药物或 活性试剂组合物。在一些实施方式中，本发明的分散组合物可以包括一种或多种药物或活 性试剂、 一种或多种氨基酸脂质、和一种或多种分散剂。在某些变化中，递 送组合物可以包括药物或活性试剂、分散剂、氨基酸脂质、和任选的聚合脂 质。本发明的分散组合物可以形成能引入药物或活性试剂的稳定颗粒。在一些方面中，本发明的分散组合物可以包含直径约5 nm至约400 nm的 稳定的核酸分散颗粒。在一些实施方式中，颗粒可以具有约10nm至约300nm 的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒可以具有约50 nm至约150 nm的均匀 直径。胶束分散体可以用于配制和改进包括RNAi治疗剂的药物或活性试剂的 生物利用率。而常规的脂质-药物复合物可以包括保持亲水性或水性核心的脂 质双分子层或脂质体结构，胶束分散体可以提供具有疏水性油样核心的分散 液滴或纳米颗粒。分散纳米颗粒可以悬浮在连续水相中。分散结构利用脂质 体结构来递送活性试剂可以避免固有的某些弱势，而且因为亲脂性核心而可 以提供递送优势。本发明提供了一系列的胶束分散组合物，其包含用于药物或药剂且用于 递送和施用RNA制剂的脂质和分散剂。分散剂的实例包括合成化合物，包括聚氧甘油酯，如聚乙二醇化的癸酰 基甘油酯、乙氧基二甘醇、聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯、二甘醇单乙醚和其混合物。分散剂的实例包括LABRAFIL、 LABRASOL、 ARLATONE、 TRANSCUTOL和其混合物。分散剂的实例包括合成的化合物，如烷基磷酸 -N-甲基乙醇胺和垸氧基肌氨酸(alkoyl creatine)。分散剂的实例包括FOS-MEA 和CRODAS腿C。在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包括药物或活性试剂、一 种或多种油、 一种或多种氨基酸脂质、和乳化剂和稳定剂脂质。在某些变化 中，递送组合物可以包括药物或活性试剂、油、脂质乳化剂、氨基酸脂质、 非阳离子脂质、和聚合脂质。本发明的组合物可以形成可以引入药物或活性试剂的稳定颗粒。在一些 方面中，本发明的组合物包括直径为约5 nm至约400 nm的稳定的药物或活 性试剂乳剂颗粒。在一些实施方式中，颗粒具有约IO nm至约300 nm的均 匀直径。在一些实施方式中，颗粒具有约50nm至约150nm的均匀直径。在本发明的示例性的组合物中，药物或活性试剂可以与油、乳化剂、氨 基酸脂质、和聚合体稳定化的脂质混合或复合，以形成能提高细胞内递送药 物或活性试剂的组合物。水包油乳剂可以用于配制和提高包括RNAi治疗剂的药物或活性试剂的 生物利用率。而常规的脂质-药物复合物可以包含保持亲水性或水性核心的脂质双分 子层或脂质体结构，水包油乳剂可以提供具有围绕疏水性油核心的脂质层的 乳剂液滴或纳米颗粒。乳剂液滴或纳米颗粒可以悬浮在连续水相中。利用脂 质体结构来递送活性试剂，乳剂结构可以避免固有的某些弱势，并且因为亲 脂性核心而能提供递送优势。本发明提供了一系列的新型乳剂组合物，包括新型组成和干扰性RNA 试剂与油、乳化剂和脂质组分的使用。油的实例包括合成的油、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇醚、甘油油、胆固醇 油、植物油、花生油、精油、矿物油、脂质可溶性化合物如生育酚和维生素 E、和其混合物。油的实例包括合成油，如CAPRYOL 90 (丙二醇单酯)、 CAPRYOL PGMC (丙二醇单酯)、LABRAFAC PC (丙二醇单酯)、LABRAFAC PG (丙二醇二酯)、LAUROGLYCOL 90 (丙二醇单酯)、LAUROGLYCOL FCC (丙二醇单酯)、PLUROL OLEIQUE CC 497 (丙二醇单酯)、LABRAFAC60LIPOPfflLE WL 1349 (甘油三酯)、PECEOL (甘油单酯)、MAISINE35-1 (甘 油单酯)、和其混合物。
RNA治疗剂组合物和方法
技术领域：
本发明提供了利用调节RNA如通过RNA干扰来调节基因表达的组合物 和方法。本发明的组合物可以递送核糖核酸试剂至能产生RNAi应答的细胞。
适合本发明的核酸试剂的实例包括双链核酸、修饰的或降解抗性的核酸、 RNA、 siRNA、 siRNA、 shRNA、 miRNA、 piRNA、 RNA拮抗剂、单链核酸、 DNA-RNA嵌合体、反义核酸和核酶。在本文中，术语siRNA、siRNA和shRNA 分别包括siRNA、 siRNA和shRNA的前体。例如，术语siRNA包括适合作 为dicer酶底物的RNA或双链RNA。
可用于本发明的核糖核酸试剂可以靶向各种基因。适合作为靶标的人基 因的实例包括TNF、FLT1、VEGF家族、ERBB家族、PDGFR家族、BCR-ABL、 和MAPK家族等。适合作为靶标的人基因的实例和其核酸序列包括描述于 PCT/US08/55333、 PCT/US08/55339、 PCTAJS08/55340、 PCT/US08/55341 、 PCT/US08/55350、 PCT/US08/55353、 PCT/US08/55356、 PCT/US08/55357、 PCT/US08/55360、 PCT/US08/55362、 PCT/US08/55365、 PCT/US08/55366、 PCT/US08/55369、 PCT/US08/55370、 PCT/US08/55371 、 PCT/US08/55372、 PCT/US08/55373、 PCT/US08/55374、 PCT/US08/55375 、 PCT/US08/55376、 PCT/US08/55377、 PCT/US08/55378、 PCT/US08/55380、 PCT/US08/55381 、 PCT/US08/55382、 PCT/US08/55383 、 PCT/US08/55385、 PCT/US08/55386、 PCT/US08/55505、 PCT/US08/55511 、 PCTYUS08/55515、 PCT/US08/55516、 PCT/US08/55519、 PCT/US08/55524、 PCT/US08/55526、 PCT/US08/55527、 PCT/US08/55532、 PCT/US08/55533 、 PCT/US08/55542、 PCT/US08/55548、 PCT/US08/55550、 PCT/US08/55551 、 PCT/US08/55554、 PCT7US08/55556、 PCT/US08/55560、 PCT/US08/55563 、 PCT/US08/55597、 PCT/US08/55599、 PCT/US08/55601、 PCT/US08/55603、 PCT/US08/55604、 PCT/US08/55606、 PCT/US08/55608、 PCT/US08/55611 、 PCT/US08/55612、 PCT/US08/55615 、 PCT/US08/55618、 PCT/US08/55622、 PCT/US08/55625、 PCT/US08/55627、 PCT/US08/55631、 PCT/US08/55635、 PCT/US08/55644、 PCT/US08/55649、PCT/US08/55651、 PCT/US08/55662、 PCT/US08/55672、 PCT/US08/55676、 PCT/US08/55678、 PCT/US08/55695、 PCT/US08/55697、 PCT/US08/55698 、 PCT/US08/55701、 PCT/US08/55704、 PCT/US08/55708、 PCT/US08/55709和 PCT/US08/55711中的那些。
本发明要递送的RNA可以具有互补于病毒基因区域的序列。例如，本 发明的某些组合物和方法可以用于调节感冒病毒的病毒基因组的表达。在一 些实施方式中，本发明提供了通过RNA干扰来调节流感的表达和传染活性 的组合物和方法。流感的表达和/或活性可以通过递送例如具有互补于流感的 RNA聚合酶亚单位区域的序列的短干扰性RNA分子至细胞来进行调节。靶 向流感病毒的RNA实例参见美国专利申请号20070213293 Al 。
在一些实施方式中，本发明提供了通过给患者施用含有效量的RNAi诱 导化合物，如短干扰性寡核苷酸分子或其前体，来抑制患者内靶转录物表达 的组合物和方法。RNAi利用小干扰性RNAs (siRNAs)来靶向信使RNA (mRNA)和削弱翻译。本发明使用的siRNA可以是dicer加工的前体，例 如加工成siRNA的长dsRNA。本发明提供了治疗或预防与靶转录物或由革巴 转录物编码的肽或蛋白活性表达相关的疾病或病症的方法。
基于RNAi的治疗策略可以通过切断病毒或微生物的生长或功能，以及 通过切断内源基因产物在疾病通道中的功能来治疗多种疾病。
在一些实施方式中，本发明提供了递送RNAi诱导实体如短干扰性寡核 苷酸分子和其前体的新型组合物和方法。具体地，本发明提供了包含靶向患 者细胞、组织和/或器官的一种或多种转录物的RNAi诱导实体的组合物。
siRNA可以是具有约19个核苷酸长度的互补性区域的两条RNA链。 siRNA任选包括一个或两个单链突出端或环。
shRNA可以是具有自身互补区域的单一 RNA链。单一 RNA链可以形成 具有茎和环和任选地在RNA的5'和/或3'部分的一种或多种非配对部分的发 夹结构。
活性治疗剂可以是具有体内核酸酶降解改良抗性和/或改善的细胞吸收 的化学修饰的RNA，其保留RNAi活性。
本发明的siRNA试剂可以是具有互补于靶基因区域的序列。本发明的 siRNA可以具有29-50个碱基对，例如具有互补于耙基因区序列的dsRNA。
62另外，双链核酸可以是dsDNA。
在一些实施方式中，活性试剂可以是能够调控基因产物表达的短干扰性
核酸(siRNA)、短干扰性RNA (siRNA)、双链RNA (dsRNA)、微RNA或 短发夹RNA (shRNA)。
提供了对比方法和组合物，其靶向与患者特定疾病状况相关的一种或多 种不同基因的表达，包括已知由于与所选疾病状况相关的因果或起作用的因 素使其表达异常增加的多种基因中的任意一个。
本发明的RNAi诱导化合物可以与其它已知疗法联合来治疗疾病。
在一些实施方式中，本发明涉及包含与递送增强化合物混合或复合或缀 合的小核酸分子，如短干扰性核酸、短干扰性RNA、双链RNA、微RNA或 短发夹RNA的组合物。
在本文中，术语"调节RNA"、"短干扰性核酸"、"siRNA"、"短干扰性 RNA"、"短干扰性寡核苷酸分子"和"化学修饰的短干扰性核酸分子"是指 通过以序列特异性方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默来调节、抑制或 下调基因表达或如病毒复制的任何核酸分子。调节性RNA包括单链RNA拮 抗剂。
在一些实施方式中，siRNA是含有自身互补的正义和反义区域的双链多 核苷酸分子，其中反义区含有互补于用于下调表达的靶核糖核酸分子中的核 苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且正义区包含对应于(即其在序列上实质 一致)靶核糖核酸序列的核苷酸序列或其部分。
在本文中，"siRNA"是指小干扰性核糖核苷酸，即相对短长度的双链核 酸或任选地其较长前体。在一些实施方式中，本发明中可用siRNA的长度优 选为约20至50 bp的长度。但是，在此对可用siRNA长度，包括siRNA没 有特殊限制。例如，siRNA可以最初以前体形式存在于细胞中，所述前体形 式与递送时或递送至靶细胞后表现和发挥基因沉默活性的siRNA的最终或 加工形式实质上不同。例如，siRNA的前体形式可以包括前体序列元件，所 述元件在递送时或递送后就会被加工、降解、改变或切割，以产生在细胞内 有介导基因沉默活性的siRNA。在一些实施方式中，使用的siRNA具有的前 体长度为例如约100-200个碱基对、或50-100个碱基对、或少于约50个碱 基对，其在靶细胞内会产生有活性的，加工过的siRNA。在其它实施方式中，
63可用的siRNA或siRNA前体长度约为10至49 bp、或15至35 bp、或约21 至30bp。
在本发明的一些实施方式中，增强递送多核苷酸的多肽可以用于促进递 送核酸分子包括siRNA的大核酸前体的递送。例如，本文的方法和组合物可 用于提高递送代表期望siRNA的"前体"的较大核酸的递送，其中前体氨基 酸可以在递送至靶细胞之前、期间或之后被切割或被加工，从而形成用于在 靶细胞内调节基因表达的活性siRNA。
例如，选择的dsRNA前体多核苷酸可以是环状的单链多核苷酸，其具有 两种或多种环结构和含有自身互补的正义和反义区的茎，其中所述反义区含 有互补于耙核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且所述正义区 具有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分，且其中所述环状多核苷酸可 以被在体内或体外加工，以产生能诱导RNAi的活性dsRNA分子。
本发明的siRNA分子，特别是非前体形式，可以是少于30个碱基对、 或约17-19bp、或19-21 bp、或21-23 bp。
siRNA可以在哺乳动物系统内调节选择性基因沉默。具有短环和茎内 19-27个碱基对的发夹RNA也选择性地沉默与双链茎内序列同源的基因的表 达。哺乳动物细胞可以将短发夹RNA转变为siRNA以调节选择性基因沉默。
RISC调节具有互补于siRNA双螺旋反义链的序列的单链RNA切割。靶 RNA的切割发生在互补于siRNA双螺旋反义链的区域内。21个核苷酸的 siRNA双螺旋通常在包含两个核苷酸3'-突出端时活性最高。
用脱氧核糖核苷酸代替具有2-核苷酸3'突出端的21-mersiRNA双螺旋的 3'-突出端片段可能对RNAi活性无副作用。将siRNA各末端的高至4个核苷 酸用脱氧核糖核苷酸代替是可以接受的。
可选地，siRNA可以作为单个或多个转录产物来递送，所述转录产物由 编码单个或多个siRNA且指向其在靶细胞内表达的多核苷酸载体所表达。在 这些实施方式中，欲在靶细胞内表达的siRNA终转录产物的双链部分可以是 如15-49 bp、 15-35 bp、或约21-30 bp长。
在本发明的一些实施方式中，两条链是配对的siRNAs的双链区可以包 括凸起或错配的部分，或凸起和错配的部分。两条链是配对的siRNA的双链 部分不限于完全配对的核苷酸片段，且可以包含由于如错配(相应的核苷酸不互补)、凸起(在一条链上缺失对应的互补核苷酸)或突出端引起的非配对
部分。在不干扰siRNA形成的情况下可以包含非配对部分。在一些实施方式 中，"凸起"可以包含1至2个非配对的核苷酸，且其中两条链配对的siRNA 的双链区可以包括约1-7、或约l-5个凸起。另外，包括在siRNA双链区内 的"错配"部分可以存在的数量是约1-7或约1-5个。错配情况中最常见的 是， 一个核苷酸是鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。所述错配可以归因于如在编码 正义RNA的对应DNA中C突变成T、 G突变成A、或其混合，但其它原因 也是可以预料的。
本发明的siRNA的末端结构可以是平末端或粘性(突出)末端，只要 siRNA保持其沉默耙基因表达的活性。粘性(突出端)末端结构并不限于3' 突出端，且包括5'突出结构，只要其保持诱导基因沉默的活性。另外，突出 核苷酸的数量并不限于2个或3个核苷酸，而可以是任意数量的核苷酸，只 要其保持诱导基因沉默的活性。例如，突出端可以包含1至约8个核苷酸或 2至4个核苷酸。
具有突出端结构的siRNA的长度可以表述为配对的双螺旋部分和各末 端的任意突出部分。例如，具有2-bp 3'反义突出端的25/27-mer siRNA双螺 旋具有25-mer正义链和27-mer反义链，其中配对部分长度为25 bp。
任意突出端序列都可以具有对靶基因的低特异性，而且可以与靶基因序 列不互补(反义)或相同(正义)。只要siRNA保持基因沉默活性，其就可 以在突出端部分包括低分子量结构，例如天然RNA分子如tRNA、 rRNA、 病毒RNA，或人工RNA分子。
siRNAs的末端结构可以具有茎-环结构，其中双链核酸的一侧末端通过 接头核酸例如接头RNA连接。双链区(茎部分)的长度可以是如15至49 bp、 或15至35bp、或约21至30bp。可选地，作为靶细胞中表达的siRNA的最 终转录产物的双链区长度可以是如约15至49 bp、或15至35 bp、或约21 至30bp。.
siRNA可以包含具有互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列的 单链多核苷酸或其部分，其中单链多核苷酸可以包含末端磷酸基团如5'-磷酸 (参见如Martinez等，Ce〃， 〃0:563-574, 2002,和Schwarz等，Mo/ecw/w Ce〃 70:537-568, 2002)，或5'，3'-二磷酸。
65在本文中，术语siRNA不限于仅含天然存在的RNA或DNA的分子，但也包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方式中，本发明的短干扰性核酸分子缺少含2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在一些实施方式中，短干扰性核酸不需要存在用于调节RNAi等的具有2'-羟基的核苷酸，本发明的短干扰性核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(如具有2'-OH基团的核苷酸)。然而，不需要在siRNA分子中存在核糖核苷酸来维持RNAi的siRNA分子可以具有结合的接头或其它的结合的或连接的基团、实体、或包含具有2'-OH基团的一种或多种核苷酸的链。siRNA分子可以在至少约5、 10、 20、30、 40或50%的核苷酸位置包含核糖核苷酸。
在本文中，术语siRNA包括能调节序列特异性RNAi的核酸分子，例如，短干扰性RNA (siRNA)分子、双链RNA (dsRNA)分子、微RNA分子、短发夹RNA (shJRNA)分子、短干扰性寡核苷酸分子、短干扰性核酸分子、短干扰性修饰的寡核苷酸分子、化学修饰的siRNA分子、和转录后基因沉默RNA (ptgsRNA)分子等。
在一些实施方式中，siRNA分子包括分离的正义和反义序列或区域，其中正义和反义区通过核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、和/或堆集相互作用非共价连接。
"反义RNA"是具有互补于靶基因mRNA的序列的RNA链，其能通过结合耙基因mRNA来诱导RNAi。
"正义RNA"是具有互补于反义RNA的序列的RNA链，且与其互补的反义RNA退火而形成siRNA。
在本文中，术语"RNAi结构"或"RNAi前体"是指RNAi诱导化合物，如小干扰性RNA (siRNA)、发夹RNA、和其它RNA种类，其能在体内被切割而形成siRNA。本文的RNAi前体还包括表达载体(也称作RNAi表达载体)，其能产生在细胞内形成dsRNA或发夹RNA的转录物，和/或产生能在体内制备siRNA的转录物。
siHybrid分子是具有与siRNA相似功能的双链核酸。除了是双链RNA分子之外，siHybrid由RNA链和DNA链组成。优选地，该RNA链是结合革巴mRNA的反义链。通过将DNA和RNA链杂交而制成的siHybrid具有杂
66交互补部分，且优选具有至少一个3'突出端。
本发明所用的siRNA可以组装自两个分离的寡核苷酸，其中一条链是正
义链且另一条是反义链，其中反义和正义链是自身互补的(即各链含有互补
于另一条链中的核苷酸序列的核苷酸序列；如其中反义链和正义链形成双螺旋或双链结构，例如，其中双链区是约19个碱基对)。反义链可以包括互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且正义链可以包含対—应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。可选地，siRNA可以组装自单个寡核苷酸，其中siRNA的自身互补的正义和反义区是通过基于核酸的或基于非核酸的接头而连接。
在一些实施方式中，用于细胞内递送的siRNA可以是具有双螺旋、不对称双螺旋、发夹或不对称的发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的正义和反义区，其中所述反义区含有互补于分离的靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且所述正义区含有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。
可在siRNA中制造的化学修饰的实例包括硫代磷酸核苷酸间连键、2'-脱氧核糖核苷酸、2'-0-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代核糖核苷酸、"通用碱基"核苷酸、"无环"核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和末端甘油基和/或反向脱氧无碱基残基。
siRNA分子的反义区可以在所述反义区的3'-端上包括硫代磷酸核苷酸间连键。反义区可以在所述反义区的5，-端上包含约1至约5个硫代磷酸核苷酸间连键。siRNA分子的3'-端核苷酸突出端可以包括在核酸糖、碱基或骨架上可进行化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。3'-端核苷酸突出端可以包括一种或多种通用碱基核糖核苷酸。3'-端核苷酸突出端可以包括一种或多种无环核苷酸。
例如，化学修饰的siRNA可以在一个链内具有1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、8或更多个硫代磷酸核苷酸间连键，或可以在各链内具有1至8个或更多个硫代磷酸核苷酸间连键。硫代磷酸核苷酸间连键可以存在于siRNA双螺旋的一个或两个寡核苷酸链上，例如在正义链、反义链、或两条链上。
siRNA分子可以包括在正义链、反义链、或两条链上的3'-端、5，-端、或3'-和5'-端的一个或多个硫代磷酸核苷酸间连键。例如，示例性的siRNA分子可以包括在正义链、反义链、或两条链上的5'-端的1、 2、 3、 4、 5或更
多个连续的硫代磷酸核苷酸间连键。
在一些实施方式中，siRNA分子包括在正义链、反义链、或两条链上的1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或更多个嘧啶硫代磷酸核苷酸间连键。
在一些实施方式中，siRNA分子包括在正义链、反义链、或两条链上的1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或更多个嘌呤硫代磷酸核苷酸间连键。
siRNA分子可以包括环状核酸分子，其中siRNA在长度上是约38至约70个核苷酸，例如约38、 40、 45、 50、 55、 60、 65或70个核苷酸，具有约18至约23个碱基对，例如约18、 19、 20、 21、 22或23个碱基对，其中环状寡核苷酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃型结构。
环状siRNA分子可以包括2个环基序，其中siRNA分子的一个或两个环部分是生物可降解的。例如，环状siRNA分子的环部分可以在体内转化以生成具有3'-端突出端的双链siRNA分子，如包含约2个核苷酸的3'-端核苷酸突出端。
siRNA分子中的修饰性核苷酸可以在反义链、正义链或两者上。例如，修饰性核苷酸可以具有Northern构型(如Northern假回转环；参见如Saenger,Ww一/as o/iVwc/e/c爿c/(iSpringer國Verlag ed., 1984)。 具有Northern构型的核苷酸实例包括锁定核酸(LNA)核苷酸(如2'-0， 4'-。亚甲基-(0-核糖呋喃糖基)核苷酸)、2'-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2'-甲基-硫代-乙基2'-脱氧-2'-氟代核苷酸、2'-脱氧-2'-氯代核苷酸、2'-叠氮核苷酸和2'-0-甲基核苷酸。
化学修饰性核苷酸可以对核酸酶降解具有抗性，且同时保持调节RNAi的能力。
双链iRNA分子的正义链可以在正义链的3'-端、5'-端、或3'和5'-端上具有端帽实体，如反向的脱氧无碱基实体。
缀合物的实例包括描述于2003年4月30日提交的Vargeese等人的美国申请序列号10/427,160中的缀合物和配体，其包括附图整体引入本文作为参考。
在本发明的一些实施方式中，缀合物可以通过生物可降解的接头共价结合化学修饰性siRNA分子。例如，缀合分子可以与化学修饰的siRNA分子
68的正义链、反义链、或两条链的3，-端结合。
在一些实施方式中，缀合分子与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义 链、或两条链的5'-端结合。在一些实施方式中，缀合分子与化学修饰的siRNA 分子的正义链、反义链、或两条链的3'-端和5'-端、或其任意组合结合。
在一些实施方式中，缀合分子包括能递送促进化学修饰的siRNA分子递 送至生物系统如细胞内的分子。
在一些实施方式中，结合化学修饰的siRNA分子的缀合分子是聚乙二 醇、人血清白蛋白、或调节细胞吸收的细胞受体的配体。本发明期望的能结 合化学修饰的siRNA分子的特异性缀合分子的实例描述于Vargeese等，美国 专利公开号20030130186和20040110296中。
siRNA可以包含将siRNA的正义区和siRNA的反义区相连接的核苷酸、 非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头。在一些实施方式中，核苷酸接头 可以是3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10个核苷酸长。在一些实施方式中，核苷酸 接头可以是核酸适配子。在本文中，术语"适配子"或"核酸适配子"包括 特异性结合靶分子的核酸分子，其中核酸分子包含在其自然状态下被靶分子 识别的序列。另夕卜，适配子可以是结合非自然结合核酸的靶分子的核酸分子。
例如，适配子可以用于结合蛋白的配体结合域，从而可以防止天然存在 的配体与蛋白发生相互作用。参见例如Gold等，i ev.历oc/ze附.似:763, 1995; Brody和Gold,飾加/2"o/, 74:5， 2000; Sun， C匿(9—. M /. 77ze,. 2:100， 2000; Kusser, 乂 S/otec/zwo/. 74:27, 2000; Hermann禾口 Patel, 5Wewce 257:820, 2000;禾口 Jayasena, C7z'm'ca/ 45:1628， 1999。
非核苷酸接头可以是无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化 合物、脂质、聚烃或其它聚合化合物(例如，如那些具有2至100个乙二醇 单元的聚乙二醇)。具体的实例包括下述中描述的那些Seela和Kaiser, iVwc/e/d/^sL 7&6353, 1990和7Vwc/e/c^c/A i 仏75:3113， 1987; Cload禾口 Schepartz, ^4肌C7ze肌<Sbc. 773:6324, 1991; Richardson禾口 Schepartz, J ^肌 C/^肌& c. 773:5109, 1991; Ma等，M/c/efc爿czViy W仏":2585, 1993和 历oc/2ew^^ 32:1751, 1993; Durand等，7Vwc/e/c7&6353, 1990; McCurdy等,7Vwc/ms/cfe51 cfe A^c/eo"(ias1投287, 1991; Jaschke等,7fefra/2e<iraw
M:301-304, 1993; Ono等，祝oc/2e附z^ 7 30:9914, 1991; Arnold等，国际公开号WO89/02439; Usman等，国际公开号WO95/06731; Dudycz等，国 际公开号WO95/11910;和Ferentz和Verdine, / CTzem. Soc. /":4000, 1991。
"非核苷酸接头"是指能引入核酸链内代替一个或多个核苷酸单元的基 团或化合物，包括糖和/或磷酸取代，且使保留的碱基表现其酶活性。基团或 化合物可以是无碱基的，因为其在如糖的Cl位置上不含有常规公认的核苷 酸碱基，如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
在一些实施方式中，修饰的siRNA分子可以具有磷酸骨架修饰，包括一 种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰 胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基 磺酸酯、縮甲醛(formacetal)、硫代縮甲醛(thioformacetal)、和/或烷基甲硅 垸基取代。寡核苷酸骨架修饰的实例在Hunziker和Leumann, iVwc/ez'c 爿"fl/ogwesv 5y"^za^ /Voj^Wes, Mode;-" 5y ^/2幼'c Mef/zo成 FC7/， pp.331-417, 1995 禾口 Mesmaeker 等,7Vove/ 5acMo"e i^/ /acewewte /br Wgo,c/eo/7.(ias, Cor6o/^(ir她M。(i折c加'ora z'wi esearc/2，爿CS， pp. 24-39， 1994中给出。
可以化学修饰的siRNA分子可以通过下述方法合成(a)合成siRNA 分子的两条互补链；和(b)在适合获得双链siRNA分子的条件下将两条互 补链一起退火。在一些实施方式中，siRNA分子互补部分的合成是通过固相 寡核苷酸合成，或通过固相串联寡核苷酸合成来实现的。
寡核苷酸(如某些修饰的寡核苷酸或缺失核糖核苷酸的寡核苷酸部分) 是利用本领域熟知的方法来合成，例如，Caruthers等，MeAoA/"五"^ywo/ow 277:3-19， 1992; Thompson等，国际PCT公开号W099/54459; Wincott等， 7Vwc/e/c爿cz'A i 仏23:2677-2684， 1995; Wincott等，Mo/. 74:59, 1997; Brennan等，所otec/7"0/67:33-45, 1998;禾卩Brennan,美国专利 号6,001,311.中所描述的。RNA的合成，包括本发明的某些siRNA分子，根 据如下所述的方法进行，例如Usman等， /爿m. CAem. 5bc 7M:7845, 1987; Scaringe等，7Vwc/e/c Jcz.tfe 7&5433, 1990;禾口 Wincott等,iVwc/e/c^lc/(is i as1. Z3:2677-2684, 1995; Wincott等，AfeAo^y Mo/.及a 74:59， 1997。
在本文中，"不对称发夹"是线性siRNA分子，其含有反义区、可包含
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核苷酸或非核苷酸的环部分、和在正义区具有足够可与反义区碱基对互补的 核苷酸且形成具有环的双螺旋的前提下，包含少于反义区的核苷酸的正义区。
在本文中，"不对称的双螺旋"是具有两条分离的链的siRNA分子，其 含有正义区和反义区，其中在正义区具有足够可与反义区碱基对互补的核苷 酸且形成具有环的双螺旋的前提下，正义区包含少于反义区的核苷酸。
在本文中，"调控基因表达"是指上调或下调靶基因的表达，其可以包括
上调或下调细胞中存在的mRNA水平、或mRNA翻译、或由靶基因编码的 蛋白或蛋白亚基的合成。
术语"抑制"、"下调"或"减少表达"在本文中是指基因的表达，或编码一 种或多种蛋白或蛋白亚单位的RNA分子或相当的RNA分子的表达的水平， 或由耙基因编码的一种或多种蛋白或蛋白亚单位的水平或活性，降低到低于 在缺失本发明的核酸分子(如siRNA)时观察到的水平。
在本文中，"基因沉默"是指在细胞中部分的或完全的抑制基因表达，而 且可以称作"基因敲除"。基因沉默的程度可以通过本领域已知的方法来确定， 其中的一些总结在国际公开号W099/32619。
本文中，术语"核糖核酸"和"RNA"是指含有至少一个核糖核苷酸残基的 分子。核糖核苷酸是在(3-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。这 些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本 纯净的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、以及通过添加、删除、取代、 修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的和改变 的RNA。 RNA的改变可以包括例如向如siRNA的末端或如在RNA的一个 或多个核苷酸内部添加非核苷酸材料。
RNA分子中的核苷酸包括非标准的核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化 学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物。
"高度保守序列区域"是指靶基因中一个或多个区域的核苷酸序列在从一 代到另 一代或从一个生物体系到另 一个生物体系时没有显著变化。
"正义区"是指具有互补于siRNA分子的反义区的siRNA分子的核苷酸序 列。另外，siRNA分子的正义区可以包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序 列。
"反义区"是指具有互补于靶核酸序列的si脂A分子的核苷酸序列。另外，
71siRNA分子的反义区可以包括具有互补于siRNA分子的正义区的核酸序列。 "靶核酸"是指表达或活性被调节的任何核酸序列。靶核酸可以是DNA 或RNA。
"互补"是指核酸通过常规Watson-Crick或通过其它的非常规结合模式可 以与另 一个核酸序列形成氢键。
在本文中，术语"生物可降解接头"是指设计成作为生物可降解接头以将 一个分子与另一个分子连接(例如，生物活性分子与siRNA分子或siRNA 分子的正义和反义链连接)的核酸或非核酸接头分子。如此设计生物可降解 接头，使得其稳定性可以为特定目的如递送至特定组织或细胞类型而发生调 节。基于核酸的生物可降解接头分子的稳定性可以以不同的方式调节，例如， 通过核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、和化学修饰的核苷酸，如2'-0-甲基、2'-氟代、2'-氨基、2'-0-氨基、2'-C-烯丙基、2'-0-烯丙基和其它的2'-修饰性或碱 基修饰性核苷酸的组合。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚体、三聚体、 四聚体或较长的核酸分子，例如长度为约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包括 具有磷基键例如氨塞磷酸酯或磷酸二酯键的单核苷酸。生物可降解的核酸接 头分子还可以包括核酸骨架、核酸糖、或核酸碱基修饰。
对于如本文所述的2'-修饰的核苷酸，"氨基"是指2'-NH2或2'-0-NH2，其 可以是修饰的或未修饰的。所述修饰的基团描述于例如，Eckstein等，美国 专利号5，672,695和Matulic-Adamic等，美国专利号6,248,878中。
本发明使用的递送核酸分子的辅助或补充方法描述于，例如，Akhtar等, 7>e"<is Ce//_Sz'o. 2:139, 1992; "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics," ed. Akhtar, 1995, Maurer等，Afo/. JkfemZ^ B/o/. 16:129-140, 1999; Hofland and Huang, Haw必.Exp.尸/zwmaco/. 737:165 192, 1999;禾Q Lee等，XGS1 5y"^. &k 752:184-192, 2000。 Sullivan等，国际PCT公开号WO94/02595中 进一步描述了递送酶的核酸分子的常规方法。
核酸分子可以在制剂中施用，所述制剂包括一种或多种其它组分，如药 学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、助剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂或防 腐剂。
在本文中，术语"载体"是指药学上可接受的固体或液体稀释剂、溶剂、
72填充剂或包封材料。载体的实例包括盐水、生物学上和药学上的缓冲系统、 和生物学上可接受的媒介剂。含水的液体载体可以包括药学上可接受的添加 剂，如酸化剂、碱化剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、 溶解剂、湿润剂、溶剂、悬浮剂和/或粘度增强剂、张力剂、润湿剂或其他生
物相容性材料。上述范畴的组分实例可参见t/.S. P/^mwco^^ Ato/om/ Fom7w/a^, 1990, pp. 1857-1859，以及Raymond C. Rowe等，ifa"必ooA: o/ P/za，acew"'ca/五x一/e她,5th ed., 2006， 禾口"Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 21st ed.， 2006, editor David B. Troy。
防腐剂的实例包括苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯、间甲酚、 硫柳汞、苯扎氯铵和其混合物。
表面活性剂的实例包括油酸、失水山梨醇油酸酯、聚山梨醇酯、卵磷脂、 磷脂酰胆碱、各种长链甘油二酯和磷脂、和其混合物。
磷脂的实例包括磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂 酰丝氨酸、和磷脂酰乙醇胺、和其混合物。
分散剂的实例包括乙二胺四乙酸。
气体的实例包括氮气、氦气、氯氟烃(CFC)、氢氟烃(HFC) 、 二氧 化碳、空气和其混合物。
在一些实施方式中，siRNA和/或多肽可以包封入脂质体、或存留在脂质 体内部或外部、或存在于脂质体层内、或通过离子电渗疗法施用、或加入到 其他载体，如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米胶囊、生物粘性微球、或蛋 白质的载体。参见，例如O' Hare和Normand， PCT国际公开号WO00/53722。 可选地，核酸组合物可以通过直接注射或通过利用输注泵来局部递送。本发 明核酸分子的直接注射，无论经皮下、经肌肉内、或经皮内，都可以利用标 准的针和注射器操作法，或采用无针技术，如Conry等，C//". Owcw 5:2330-2337,1999，和Barry等，国际PCT公开号W099/31262中所描述。
本发明的组合物可以有效地用作药物制剂。药物制剂预防，调节患者中 疾病状态或其它不良状况的发生或严重程度，或治疗(减轻一种或多种症状 至可检测或可测量的程度)患者中疾病状态或其它不良状况的发生或严重程 度。
在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物和方法，特征是存在或施用一种或多种多核酸，所述多核酸通常是与脂质结合、复合或缀合的一种或 多种siRNA，其可以进一步与药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂或缓冲 剂配伍。
通常地，siRNA会耙向以高水平表达的基因，该基因作为与患者疾病或 不良状况相关的因果或起作用的因素。在这种情况下，siRNA会有效地下调 该基因的表达水平，从而预防、减轻或降低一种或多种相关疾病症状的严重 性或复发。可选地，对于各种不同的疾病模型来说，靶基因的表达不一定会 随着疾病或其他不良症状的结果或结局而提高，通过降低基因表达(即降低 选定的mRNA的水平和/或靶基因的蛋白产物的水平)，下调靶基因将仍然会 获得治疗结果。可选地，本发明的siRNA可以靶向较低表达的一个基因，这 可以导致上调"下游"基因，该"下游"基因的表达被该靶基因的产物或活性负 性调节。
本发明的siRNA可以以任何形式给药，例如经透皮或通过局部注射(如 在银屑病斑块位点上局部注射以治疗牛皮癣，或局部注射入患银屑病或RA 患者关节内)。在更具体的实施方式中，本发明提供了制剂和施用治疗有效量 的直接抵抗TNF-a的mRNA的siRNA的方法，该siRNA有效下调TNF-a RNA，并因此降低或预防一种或多种TNF-a相关炎症。提供了对比方法和组 合物，其针对与动物患者中所选疾病状况相关的一种或多种不同基因的表达， 包括已知其表达随着与所选疾病状况相关的因果或起作用的因素会异常增加 的大量基因中的任何一个。
本发明的组合物还可以配制，并用作口服给药的片剂、胶囊或酏剂，直 肠给药的栓剂，无菌溶液，注射给药的悬浮液，以及本领域已知的其他形式。
药理学组合物或制剂是指适合给药的形式的组合物或制剂，例如全身给 药至细胞或患者，包括如人类。适合的形式部分依赖于用途或进入途径，例 如经口服、经透皮、经上皮、或通过注射。所述形式并不妨碍组合物或制剂 到达靶细胞(即带负电的核酸希望递送到的细胞)。例如，注入到血液中的药 理学组合物应该是可溶的。其它因素是本领域已知，且包括如毒性的考虑。
"全身给药"是指体内全身吸收或血液中药物的累积，随后分布到全身。 会导致全身吸收的给药途径包括但不限于经静脉、经皮下、经腹腔、吸入、 口服、经肺内和经肌肉内。
74适合与本发明的核酸分子配制的试剂的实例包括P-糖蛋白抑制剂(如
Pluronic P85 )，其能提高药物进入CNS( Jolliet-Riant和Tillement,」Fw"daw. C7f". 户/w^wco/. ":16-26, 1999);生物可降解的聚合物，如在脑内植入后用于缓 释递送的聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)微球(Emerich, D.F等，Ce// rrarap/a f &47-58, 1999, Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.);和载药纳米颗粒，如由聚氰 基丙烯酸丁酯制成的那些，其能递送药物穿过血脑屏障并能改变神经摄取机 制(尸rag. jVewra/w_yc/w_p/z<arm<3co/及o/.尸wc/^a^7 23:941-949, 1999)。用于本 发明核酸分子递送方法的其它实例包括描述于Boado等，J P/2^m. S7:1308-1315, 1998; Tyler等，i^5S丄故.W六280画284, 1999; Pardridge等， /WAS" L/SA 92:5592-5596, 1995; Boado， Jdv. Z>wg i ev. 75:73-107,
1995; Aldrian-Herrada等，7Vwcfe/c爿c/(ii " 26:4910-4916, 1998;和Tyler等， iWJS 96:7053-7058, 1999中的材料。
本发明还包括制备用于储存或给药的组合物，其包括在药学可接受的载 体或稀释剂中的药学有效量的期望化合物。治疗使用的可接受的载体或稀释 剂是药物领域所熟知的，且描述于，例如i emf"gto"^P/zawwcei^ca/^SWewcas, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed, 1985)中。例如，可以使用防腐剂、稳 定剂、染料和增味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外， 抗氧化剂和悬浮剂也可以使用。
药学有效剂量是预防，抑制疾病状态的发生，治疗或改善疾病状态的症 状到一定程度所需的剂量。活性核酸的给药量应该是每日每千克体重0.01mg 至50 mg。
水悬浮液可以包括与适合制备水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。所述 赋形剂是悬浮剂，例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、 海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以 是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂，或环氧垸与脂肪酸的縮合产物，例如聚 氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙垸与长链脂肪醇的縮合产物，例如十七烷基亚乙 氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖 醇的偏酯的縮合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自 脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合产物，例如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯。水悬 浮液还可以包括一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸
75正丙酯、 一种或多种着色剂、 一种或多种增味剂、和一种或多种甜味剂，如 蔗糖或糖精。
油性悬浮剂可以通过在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或 在矿物油如液体石蜡中悬浮活性成分来配制。油性悬浮剂可以包括增稠剂， 例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可添加甜味剂和增味剂以提供可口的口服制剂。 这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来进行保存。
适合通过加水制备水性悬浮剂的可分散粉剂和颗粒提供与分散剂或润湿 剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。也可以存在其它赋形剂， 例如甜味剂、增味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以是水包油乳剂型。油相可以是植物油或矿物 油或两者的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的橡胶，例如阿拉伯树胶 或黄芪树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖 醇、酸酐的酯或偏酯，例如山梨聚糖单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙垸的縮 合产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。乳剂还可以包括增甜剂和增味剂。
药物组合物可以是无菌注射的水性或含油的悬浮剂形式。该悬浮剂可以 按照本领域已知的方法，利用上文所述的适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来 配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的双亲可接受的稀释剂或溶剂中的无菌 注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。其中可以使用的可接受的
载体和溶剂是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常，无菌的不挥 发性油通常可用作溶剂或悬浮媒介物。为此，任何温和的不挥发性油都可以 使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，发现脂肪酸如油酸可用于制 备注射剂。
siRNA可以以栓剂形式给药，例如用于药物的直肠给药。这些组合物可 以通过将药物与适合的非剌激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下是固 体但在直肠温度下是液体，因此其能在直肠中溶解而将药物释放。所述材料 包括可可油和聚乙二醇。
siRNA可以通过核酸酶抗性基团如2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-0-甲基、2'-H的修饰来进行广泛地修饰，以提高稳定性。综述参见Usman和 Cedergren, T7AS" 77:34, 1992; Usman等，A^c/e/c^cWSjwp. &k 37:163， 1994。 siRNA结构可以利用常规方法通过凝胶电泳来纯化，或通过高压液相层析和在水中重悬浮来纯化。
包含修饰(碱基、糖和/或磷酸)的化学合成的核酸分子可以防止其被血
清核糖核酸酶降解，这可以增加其效力。参见，例如Eckstein等，国际公开 号WO92/07065;Perrault等，Atowe 3":565, 1990; Pieken等，5We"ce 314, 1991; Usman禾口 Cedergren, 7>*ewcfe 历oc/zem. 5W. 77:334， 1992; Usman等， 国际公开号W093/15187;禾B Rossi等，国际公开号W091/03162; Sproat， 美国专利号5,334,711;禾PGold等，美国专利号6,300,074。全部上述参考文 献都描述了能对本文描述的核酸分子的碱基、磷酸和/或糖实体进行的各种化 学修饰。
在现有技术中有许多实例描述了能够引入核酸分子的糖、碱基和磷酸修 饰，并且会显著提高其核酸酶稳定性和功效。例如，寡核苷酸通过用核酸酶 抗性基团，例如，2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-0-甲基、2'-0-烯丙基、 2'-H修饰，以提高稳定性和/或提高生物活性。综述参见Usman和Cedergren，
77:34, 1992; Usman等，M/c/dc爿c^^mp. &k 37:163, 1994; Burgin等， 5/oc/zem^岬35:14090, 1996。核酸分子的糖修饰已经被现有技术所广泛描述。 参见Eckstein等，国际公开PCT号WO92/07065; Perrault等，A^w^ 3 :565-568, 1990; Pieken等，Scz'e"ce Z53:314-317, 1991; Usman和Cedergren, 2>e"& /"历0c/2em. 77:334-339, 1992; Usman等，国际公开PCT号 WO 93/15187; Sproat，美国专利号5，334，711和Beigelman等， / 編. 270:25702, 1995; Beigelman等，国际PCT公开号WO97/26270; Beigelman 等，美国专利号5,716,824; Usman等，美国专利号5,627,053; Woolf等，国 际PCT公开号W098/13526; Thompson等，Karpeisky等，r^raAWra" iLe". 39:1131, 1998; Earnshaw禾口 Gait, 5z'o_po/_ywe/:s (7Vwc/ez.c 5b/ewca^ 4&39-55, 1998; Verma and Eckstein, j/ww. Aev.历oc/zew. (57:99-134, 1998;和Burlina等， 历oo/^.M^i C/zem. 5:1999-2010, 1997。这些出版物描述了确定将糖、碱基和/ 或磷酸修饰等引入核酸分子而不调节催化性的位点的常规方法和策略。在这 些指导下，如本文所述，类似的修饰可用于修饰本发明的siRNA核酸分子， 只要siRNA在细胞内促进RNAi的能力不被显著抑制。
虽然包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5'-甲基膦酸酯键的寡核苷酸 核苷酸间连键的化学修饰会提高稳定性，但是过度的修饰会导致某些毒性或
77降低活性。因此，当设计核酸分子时，应该最小化这些间连键的量。这些键 的浓度降低就会降低毒性，而使这些分子获得增加的效力和较高的特异性。
在一些实施方式中，本发明涉及具有磷酸骨架修饰的修饰性siRNA分
子，所述磷酸骨架修饰包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦 酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚
酰胺、磺酸酯、磺胺、氨基磺酸酯、縮甲醛(formacetal)、硫代縮甲醛 (thioformacetal)、和/或烷基甲硅烷基取代。寡核苷酸骨架修饰的综述参见 Hunziker禾口 Leumann, iV^c/e/c jc/d Jwa/ogwesv iSy"^zes^ aw<i尸ra/ eWes1， /" Mofifer"御to.c她Ao成rCi/, 1995, pp. 331-417，禾卩Mesmaeker等，"Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research," JCS*， 1994， pp. 24-39。
递送核酸分子的方法描述于Akhtar等，7>e"& Ce//历o. 2:139， 1992; "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics," ed. Akhtar， 1995;Maurer等，Mo/. Mew^: M: 129-140, 1999; Hofland和Huang, ￡x/ .尸/7w附ac0/. "7:165-192, 1999;禾QLee等，JGS^mp. &k 752:184-192， 2000。 Beigelman等，美国专利号6,395,713禾B Sullivan等，PCT WO94/02595 进一步描述了递送核酸分子的常规方法。这些指导方案可以用于递送几乎任 何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的各种方法来施用给细 胞，包括但不限于通过脂质体内部或外部包封、通过离子电渗疗法、或通过 引至其它载体，如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见如Gonzalez 等，历ocow)wgate Ozew. 70:1068-1074， 1999; Wang等，国际PCT公开号 WO03/47518和WO03/46185)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)禾口 PLCA微 球(参见如美国专利号6,447,796和美国专利申请公开号US2002130430)、 生物可降解纳米胶囊、和生物粘性微球，或通过蛋白质载体(O'Hare和 Normand，国际PCT公开号WO00/53722)。可选地，核酸/载体组合物可以 通过直接注射或采用输注泵来局部递送。直接注射本发明核酸分子，无论经 皮下、经肌肉内或经皮内，都可以利用常规针和注射器操作法，或采用无针 技术，如Conry等，Qz"ceri 仏5:2330-2337, 1999和Barry等，国际PCT
发明者凯茜·L·弗斯诺, 史蒂文·C·科伊, 沙古那·塞斯, 玛丽·G·普利弗, 皮埃罗·哈维, 罗格·C·阿达米, 迈克尔·E·休斯顿, 雷纳塔·法姆 申请人:Mdrna有限公司