抑制beta分泌酶酶切作用的多肽及其应用的制作方法

专利名称：抑制beta分泌酶酶切作用的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备治疗阿尔茨海默病药物 中的应用。
背景技术：
阿兹海默病Alzheimer’ s Disease，以下简称AD，俗称老年性痴呆，是由无毒性的 β-淀粉样蛋白单体分子(β-AmyloicKA β 40/42以下简称Αβ))聚集形成具毒性作用的 寡聚体引起的老年人主要以记忆力下降和脑部形成老年斑为特征的神经退行性疾病。医学 统计表明，我国和欧美国家中60岁以上老年人有5 6%患有阿兹海默病。该病已被列为 导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。我国现有60岁以上人口约一亿，按照 60岁以上人口中老年性痴呆患病率为5%估算，全国可能有老年性痴呆患者约500万。该 病已给家庭和社会带来巨大的负担。研究人员估计，如果防治措施得不到改善，原处于死亡 病因第4位的老年性痴呆症将成为21世纪老年人健康的头号杀手，将会有三分之一的65 岁以上老人患老年性痴呆症。目前，对AD的临床治疗只是应用一些神经营养和消炎类药物 进行对症治疗，尚没有任何特异性治疗AD的药物面世。基于Αβ的致病机理，目前对AD治疗制剂的研究主要从三个方面入手通过抑制 酶促反应降低Αβ产生、抑制Αβ的凝聚和加快Αβ的清除。Αβ主要由39-42个氨基酸 残基组成，其中A β 42聚集较快、细胞毒性较大，为主要的AD致病因素。它来自于分子量为 110-135KD 的前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)。APP 经 β 分泌酶的作用产生 Αβ的氨基端，经胞膜内Y分泌酶作用产生Αβ的羧基端。在正常情况下，在β分泌酶作 用之前，α分泌酶在Αβ中间的1^816-1^1117处将4 裂解为4 8(1和嵌在膜上较短的 羧基片段C83(如图1所示)。APPsa具有生长调节和神经营养的作用，能延长神经元的存 活，稳定和加强突触的结构，增强神经元的功能等。在机体异常的情况下，β、Y分泌酶活 性增强，或α分泌酶活性降低，将会产生较多量的Αβ，而引起AD的发生。于是，降低β或 Y分泌酶酶切作用或增强α分泌酶酶切作用的研究成为近十余年来AD研究领域的热点之 一。目前，人们对这三类酶的分子生物学特性、作用机理和组成成分等的认识研究有了较大 突破。Y分泌酶是由多个组分组成的多酶复合体，除能裂解APP产生Αβ外，还参与产生 其他30余种具有重要生理功能的I型膜蛋白的产生。因此，单纯抑制这类酶的活性来减少 Αβ的产生必将会影响其它许多相关蛋白的正常功能。同样地，抑制β分泌酶的抑制剂的 有效性和副作用问题也一直没有得到解决。人们至今尚未找到可应用于临床的抑制β或 Y分泌酶酶切作用的有效药物。研究表明，β分泌酶酶切位点氨基酸保守性很强。2005年Arbel等人以APP肽链 中β分泌酶酶切位点作为靶点，制备出抗该酶切位点的特异性抗体。该抗体可以与APP有 效结合，阻止β分泌酶的酶切作用，从而降低细胞A β的产生。这表明某些物质与APP肽 链中β分泌酶酶切位点的结合，可以阻遏β分泌酶的酶促作用，这将成为降低Αβ产生的 有效途径之一。然而，抗体分子较大，不易通过血脑屏障，并且抗体本身具有较好的抗原性，易引起变态反应等副作用。

发明内容
本发明的目的在于针对抗APP上β分泌酶酶切位点的特异性抗体分子较大，不易 通过血脑屏障，且抗体具有抗原性，易引起变态反应的缺陷，提供一种多肽，其氨基酸序列 为His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr，或由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或 几个氨基酸，且具有抑制β分泌酶酶切作用、抑制Αβ聚集以及抑制Αβ细胞毒性作用的 多肽。在本发明的具体实施例中，将本发明所述多肽的N端乙酰化、缺失丙 氨酸(序列为=His-Asp-Pr0-Pr0-Rrg-Thr)、丙氨酸置换成甘氨酸(序列为 His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)或插入组氨酸且在C末端连接亮氨酸(序列为His-Asp-Pro-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)，检测其与APP的β分泌酶酶切位点及A β 42的特异性结 合，结果显示，本发明所述多肽经过置换、缺失或插入氨基酸后仍保留与APP上的β分泌酶 酶切位点和Αβ 42同时结合的能力。体外试验表明，本发明所述多肽可特异性结合APP上β分泌酶酶切位点，其氨 基酸序列为Glu-val-Lys-Met-Asp-Gla-Glu-Phe，抑制β分泌酶酶切作用，可明显抑制 Αβ 40禾Π Αβ 42的产生，并且可通过结合Αβ的N端多肽片段(结合的N端多肽序列为 Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser)来抑制A β 42的聚集，保护SH-SY5Y神经母细胞瘤细 胞免受Αβ42毒性的影响。将该多肽注射到AD转基因小鼠(APP和PSl双转基因)的脑侧 室进行动物记忆实验，结果表明，本发明所述多肽可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少 脑内老年斑的数量及Aβ 40和Αβ42的产量。本发明还提供所述任一项多肽作为β分泌酶抑制剂的应用。本发明还提供所述任一项多肽作为A β聚集抑制剂的应用。本发明还提供所述任一项多肽在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。本发明所述多肽分子量小，易穿过血脑屏障，并且相比其它大蛋白分子如抗体等 抗原性较差，副作用较小，在阿尔茨海默病的预防和治疗方面具有广泛的应用前景。


图1. Pbssl与APP上的β分泌酶酶切位点及A β结合的ELISA测定；图2.经置换、缺失或插入氨基酸了的Pbssl与APP上的β分泌酶酶切位点及A β 结合的ELISA测定；Pbssl-ΔΑ 为缺失丙氨酸的多肽(序列为His-Asp-Pro-Pro-Rrg_Thr)；Pbssl-Ac为N端乙酰化的多肽；Pbssl-A4G为丙氨酸置换成甘氨酸的多肽(序列为 His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)；
Pbssl-HL为插入组氨酸且在C端连接亮氨酸的多肽(序列为=His-Asp-Pr0-Ala-Hi s-Pro-Rrg-Thr-Leu)；图3. ThT荧光测定Pbssl抑制A β 42的聚集；图4. Pbssl抑制A β 42聚集的显微镜观察；
图5. Pbssl抑制A β 42的细胞毒性；图6. Pbssl抑制A β 40的细胞外产生；图7. Pbssl抑制A β 42的细胞外产生； 图8.注射Pbssl多肽的AD转基因小鼠的水迷宫实验；图9.注射Pbssl多肽的AD转基因小鼠在目标象限的时间；图10.注射Pbssl多肽的AD转基因小鼠穿台次数；图11.注射Pbssl多肽的AD小鼠脑组织内老年斑定量测定。
具体实施例方式本发明公开了一种可特异性结合APP上β分泌酶酶切位点的多肽及其应用，本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产 品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和 范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。根据阿兹海默病AD的发病原理，治疗AD的根本方法应是减少β淀粉样蛋白 (Αβ)的产生、抑制Αβ的聚集或加快Αβ的清除。本发明的发明人应用噬菌体显示技术， 以含有APP上β分泌酶酶切位点和Αβ部分氨基端序列为一筛选底物，将IX IO8种七肽 进行了四轮淘选，应用噬菌体ELISA从中筛选出了一条可同时与APP上的β分泌酶酶切位 点禾ΠΑβ42 明显结合的多肽 Pbssl。Pbssl 的序列为His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg_Thr。研究显示，Pbssl在体外可以明显降低Αβ产生，且可以抑制Αβ的聚集及细胞毒 性。应用AD转基因动物进行的体内实验结果表明，Pbssl可以明显改善小鼠的空间记忆能 力，减少脑内老年斑的数量及Αβ40和Αβ42的产生。Αβ分子量很小，易穿过血脑屏障发 挥疗效，并且抗原性较差，副作用较小，是一条极具AD治疗潜力的多肽。本发明所述多肽Pbssl为一七肽，可由按常规方法合成制备。我们用以实验的 Pbssl多肽纯度为大于或等于95%。Pbssl保存于_20°C，避免反复冻融。本发明所有的实验数据都是通过至少3次独立的实验获得的，实验数据表示为平 均数加减标准差。数据的统计分析是应用One-wayANOVA软件进行，多组比较分析则应用 Duncan‘ s test0以下结合实施例，进一步阐述本发明实施例1. Pbssl与APP上的β分泌酶酶切位点及A β 42的特异性结合分别将PBS缓冲液配制的APP上的β分泌酶酶切位点多肽(上海吉尔多肽公司)、 A β 42 (American Peptide Co.)及阴性对照多肽以1 μ g/孔包被96孔高亲和力酶标板，4°C 过夜。以BSA封闭酶标板上未与多肽结合的空白位点，然后加入连接有6个组氨酸作为标 签的Pbssll μ g/孔，室温作用2h。洗涤后，加入能与组氨酸标签结合的偶联HRP的抗体， 室温作用lh。洗涤后，加入底物TMB，显色15分钟后，以多功能酶标仪测定450nm处的吸光 度。在相同的条件下重复三次，结果见图1，图中数据为三次的平均值，error bar为 SD,与阴性对照相比，*，P < 0. 01，表明Pbssl可与APP上的β分泌酶酶切位点和A β 42 同时结合。
实施例2. Pbssl的氨基酸经置换、缺失或插入仍与APP的β分泌酶酶切位点及 A β 42的特异性结合将本发明所述多肽Pbssl的N端乙酰化、缺失丙氨酸(序 列为His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr)、丙氨酸置换成甘氨酸(序列为 His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)或插入组氨酸且在末端连接亮氨酸(序列为=His-Asp-Pr o-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)，然后按照实施例1所述试验方法检测与APP的β分泌酶酶 切位点及A β 42的特异性结合，用ELISA方法测定OD值，结果见图2。表明Pbssl经过某些 修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留与APP上的β分泌酶酶切 位点和A β 42同时结合的能力(与阴性对照相比，P < 0. 01)。实施例3. Pbssl体外抑制A β 42的聚集1)将国外购买的 Αβ 42 (American Peptide Conpany, USA)六氟异丙醇(HFIP) 溶解至lmg/ml 室温超声波处理lOmin，分装到印idorf管中，于真空中挥发HFIP，然后 于-20°C保存。用前将HFIP处理过的Αβ 42在室温放置20min，然后加入二甲基亚砜 (DMSO)，使A β 42的浓度为lmg/ml，然后以0. 02M pH 7. 4的PBS缓冲液进行稀释至所需浓度。2)将Pbssl溶解于0.02M pH 7. 4的PBS缓冲液中，然后加入到Αβ 42溶液，使 Aβ 42终浓度为10 μ M和Pbssl的终浓度为10 μ M和100 μ Μ。并以不加Pbssl的Αβ42溶 液做为对照。将所有样品于37°C放置24小时。3)将硫黄素(ThT)溶解在pH 6. 5、50mM的磷酸盐缓冲液使其浓度为5 μ Μ。取放 置37°C 24小时后的样品20 μ 1加入到含有180 μ 1 ThT溶液的黑色酶标板中。混勻后在 多功能酶标仪上以450nm激发波长和482nm的发射波长测定ThT的荧光强度。该实验重复 三次，将各样品的荧光强度减去ThT本身的背景荧光，并分析样品之间的差异显著情况，结 果见图3。与单独的Αβ 42样品相比，*，Ρ<0. 05;**，Ρ< 0. 01，结果显示加入Pbssl 后的Aβ 42荧光强度显著低于单独Aβ 42的样品。由于ThT与Αβ 42聚集后的聚集物中的 β -片层结合后才可激发出荧光，荧光越强，表明A β 42聚集越多。将放置37°C 24小时后的样品应用透射显微镜进行形态观察。样品各10 μ 1滴加 到200目的铜网格中，20min后用滤纸吸干样品，再各取10 μ 1 2. 5%的戊二醛滴在网孔中 作用5min，用滤纸吸干戊二醛后，再用双氧铀染料10 μ 1滴在铜网上作用30s，吸干后，晾 干。在透射电镜下观察样品，电压80kV，放大倍数为40K。单独孵育的Aβ 42可聚集成许多 长纤维，如图4Α所示，而加入100 μ M Pbssl的Αβ 42不能够聚集成纤维状体，只形成了一 些寡聚体，如图4Β所示，标尺为1微米。实施例4. Pbssl体外抑制A β 42的细胞毒性用含10%胎牛血清的培养基(MEM，Invotrigen)将SH-SY5Y细胞配成单个细胞悬 液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100 μ L0细胞于37°C培养24 小时，培养箱C02浓度为5%。每孔加入样品后(Αβ 42与Pbssl的混合物，AB 42alone及 PBS对照)，A β 42蛋白的终浓度是1 μ Μ, Pbssl的终浓度是4 μ M和10 μ Μ。细胞继续培养 48小时后，每孔加MTT溶液(5mg/mL) 10 μ L，37°C孵育3小时，终止培养，每孔加100 μ L晶 体溶解液(10% SDS和5%异丁醇溶解在0. OlM HCL中)，37°C孵育过夜，使结晶物充分溶 解。在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。减去本底后，以样品的吸光度除以不加样品的细胞的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著情况，与单独的Αβ42样品相比，*，P < 0.05 *，P < 0.01，结果如图5所示。实施例5. Pbssl体外抑制A β 42的产生应用A β 42禾口 A β 42试剂盒(Invotrigen，USA)测定细胞培养液中A β 40禾口 A β 42 的量，按照厂家说明书进行实验测试。简述如下1)将转染APP基因的人胚肾细胞(7ΡΑ2， 由美国哈佛大学医学院馈赠)在6孔板上培养至丰度为90%时，更换无血清培养基，加入 PBS和终浓度为3μΜ、100μΜ的Pbssl，继续培养15小时。2)收集培养液，离心除细胞碎片。3)应用200 μ 1 2%脱脂奶粉封闭ELISA微孔板，置37°C 2小时。4)加入100 μ 1(1 μ g/ml)各细胞培养液，置37°C 1小时。5)甩去样品溶液，以含0. 05%的TWeen-20PBS洗涤微孔板3次。6)加入100μ1(1 2000稀释)特异结合Αβ 42的鼠源单抗，置37°C 1小时。7)洗涤同步骤5)。8)加入100μ1(1 1000稀释)HRP标记的羊抗鼠二抗，置37°C 1小时。9)洗涤同步骤5)。10)加入100 μ 1 TMB显色，以IN的硫酸终止显色反应。11)应用酶标检测仪测定450nm处的光吸收值。结果显示，加入Pbssl多肽后细胞培养液中，Αβ40(见图6)和Αβ42(见图7)的 水平都明显降低，与加入PBS对照相比，*，P < 0.01。实施例6. Pbssl改善AD转基因小鼠的记忆能力实验方法1)脑侧室注射将12月龄大的转APP和PSl基因的小鼠随机分为注射多肽Pbssl 和PBS组，每组7只。同时以7只年龄相似的野生型小鼠(为非AD型)做为对照。脑内注 射前12h对小鼠禁食不禁水。首先将小鼠麻醉，麻醉剂量为25g小鼠腹腔注射0. ImL浓度 为10%的水合氯醛。将小鼠固定在立体定位仪上，参照标准图谱(AcademicPublish)进行 脑立体定位侧室注射给药。小鼠右侧脑室注射定位参数为前囱后0. 8mm，中线旁开0. 8mm, 硬膜下2. 5mm。用无菌水溶解Pbssl至lmg/ml，注射剂量为5 μ L。每只动物注射时间为 5min,留针lOmin。注射14天后，对小鼠进行水迷宫记忆能力检测。2)记忆力训练小鼠水迷宫训练之前放在室温25°C，湿度46%的环境适应3天。 所有行为学检测试验中均采用随机双盲的方式。训练前，除去平台，在水槽中央轻轻放入， 让其自由游动60s。测定每组小鼠游泳象限偏好，以选择将对面水槽的壁，作为该小鼠初始 释放位置。第一次训练前让小鼠站在平台(平台直径10厘米)上15s，让它记忆一下池(直 径1.1米)中台的空间位置。平台放在第二象限中部，并且平台的上表面距水面1.5厘米。 池水中加入奶粉，以增加动物的视觉反差，利于图像记录。每天按指定投放点，训练小鼠4 次。将小鼠面朝池壁，轻轻放入水中，让其在水槽中游泳60s。小鼠在台上站立2s就停止计 时，认为上台，训练时间每次最长为60s。期间应用软件(购自中国医科院药物所)记录其 轨迹以及从入水到爬上平台的时间，即潜伏期。如果小鼠在60s内找到平台则让其在平台 上停留20s。如果小鼠在60s内找不到平台，则在60s后由实验人员弓丨导其上平台，并让其 在平台上停留20s。
3)记忆力测试小鼠水迷宫训练8天，8天训练完后，撤掉水下平台。24h后，测定 记忆保持力。将小鼠放入池中游泳60s，以录像和软件系统记录实验结果。一天内进行3次 测定后，软件统计每组小鼠穿台次数、首次穿台所需时间及在各相限内的时间。随着训练时间的增长，野生组小鼠找到台的潜伏期逐渐缩短，6天后即达平衡状 态。注射Pbssl的小鼠找到台的潜伏期在训练到第6天时和8天时，与注射PBS的阴性对 照相比具有显著差异(与注射PBS组相比，*，P < 0. 05 ； * *，P < 0. 01)，结果见图8，表 明注射Pbssl后的小鼠的空间记忆能力明显好于注射PBS的对照组。 撤台测试实验结果表明，注射Pbssl的小鼠在目标象限(即有平台的象限)的时 间明显高于注射PBS对照组，与注射PBS组相比，*，P < 0. 05，结果见图9。并且注射Pbs si的小鼠穿台次数也明显高于注射PBS的对照组，与注射PBS组相比，*，P < 0. 05，结果 见图10。实施例7. Pbssl降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量免疫组化染色方法检测Pbssl降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量1)小鼠心脏灌流，取脑组织，进行石蜡包埋。切片后脱蜡处理，并修复切片。2)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3% H202，室温封闭5 lOmin，用水洗3次。3)滴加2% BSA, Ih后甩去多余液体。4)滴加一抗，6E10(1 1000) 37°C作用lh。然后以PBS洗三次，每次2min。5)滴加含有BSA的生物素化羊抗鼠(1 200) PBS溶液，37°C作用lh。PBC洗 3次，每次2min。6)滴加联接 HRP 的亲和素(1 100)，37°C 20min。PBS 洗 4 次，每次 5min。7)加入DAB显色(DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度))。8)蒸馏水冲洗。苏木素复染2min、盐酸酒精分化。9)脱水、透明、封片、镜检。检测结果注射缓冲液PBS的小鼠海马和皮层里的老年斑数量和面积明显多于注射多肽 Pbssl的海马和皮层)里的老年斑。应用软件系统(visiopharm)测定注射多肽(η = 7) 及对照小鼠(η = 7)海马和皮层(每只动物每个部位检测10-12张切片)的老年斑面积。 统计学分析表明，注射多肽Pbssl的小鼠老年斑面积明显减少(与注射PBS组相比，*，P < 0.01)，结果如图11所示。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
权利要求
如下(a)或(b)的多肽，(a)其氨基酸序列为His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr，(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制β分泌酶酶切作用的由(a)衍生的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其为(a)所示的多肽N端乙酰化。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为 His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为 His-Asp-Pro—Gly-Pro-Rrg-Thr。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为HiS-ASp-Pr0-Ala-HiS-Pro-Rrg-Thr-Leu0
6.根据权利要求1-5任一项所述多肽作为0分泌酶抑制剂的应用。
7.根据权利要求1-5任一项所述多肽作为A0聚集抑制剂的应用。
8.根据权利要求1-5任一项所述多肽在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种多肽，其氨基酸序列为His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr。本发明还提供所述多肽作为β分泌酶抑制剂、Aβ聚集抑制剂及在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。实验表明，本发明所述多肽可特异性结合APP上β分泌酶酶切位点，抑制β分泌酶酶切作用，抑制Aβ40和Aβ42的产生，抑制Aβ42的聚集和细胞毒性。将该多肽注射到AD转基因小鼠进行动物记忆实验，结果表明，可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量。本发明所述多肽分子量小，易穿过血脑屏障，并且相比抗体，抗原性较差，副作用较小，具有广泛的临床应用前景。
文档编号A61K38/08GK101863962SQ20101017206
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者刘瑞田, 杨世高 申请人:清华大学