专利名称：一种吴茱萸总生物碱新的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提取的植物中草药中活性成分的药物用途，具体地说是一种吴茱萸总生物碱新的医药用途。
背景技术：
吴茱萸系芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、疏毛吴茱萸Evodiarutarecarpa(Juss.)Benth.vat.bodinieri(Dode)Huang、石虎Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalia(Dode)Huang的干燥近成熟果实。味辛、苦，性热，有小毒。归肝、脾、胃、肾经。具有温肝暖胃、散寒止痛、降逆、燥湿等功效。分布于安徽、浙江、福建、湖南、湖北、广东、广西、云南、贵州等省区。
目前，从吴茱萸果实中已经分离出100余种化合物，包括生物碱、苦味素、挥发油、氨基酸等。(1)生物碱为吴茱萸主要的活性成分，根据结构可分为吲哚喹啉类生物碱和喹诺酮类生物碱，前者主要有吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸因碱、羟基吴茱萸碱、二氢吴茱萸次碱、去甲吴茱萸酰胺、14-甲酰二氢吴茱萸次碱等；后者有吴茱萸卡品碱、二氢吴茱萸卡品碱、1-甲基-2-十五烷基-4-喹诺酮等，吴茱萸总生物碱具有重要的药用价值，有些已在临床得到广泛的应用。(2)苦味素类主要包括吴茱萸苦素、吴茱萸内酯醇、黄柏酮、柠檬苦素、吴茱萸苦素乙酸酯、格罗苦素甲等，苦味素类化合物能减少胃酸分泌、改善局部血液循环等功能。(3)挥发油类通过气相色谱从吴茱萸中分离出月桂烯、柠檬烯、石竹烯、别香橙烯等。(4)氨基酸天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸、丝氨酸等18种氨基酸。此外，吴茱萸中还含有少量的黄酮类化合物、甾体类、脂肪酸及微量元素。
吴茱萸具有多种药理学活性，具有较高的药用价值和应用前景。资料显示吴茱萸生物碱能增强晶体停博液对离体豚鼠心脏的保护作用，并具有强效降压和舒张血管效应；吴茱萸提取物、吴茱萸碱、吴茱萸内酯对家兔有很好的镇痛作用；吴茱萸煎剂及水浸剂对霍乱弧菌、絮状表皮癣菌及致病皮肤真菌等具有抑制作用；吴茱萸次碱有抗血小板活性、抑制血栓素的形成、抑制激动剂引起的血小板聚集时细胞内钙的运动；吴茱萸水提物对大鼠离体子宫由5-羟色胺引起的收缩有拮抗作用，其兴奋子宫成分为去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱及芸香胺；吴茱萸碱还具有支气管收缩作用；此外实验还显示吴茱萸生物碱对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒活性。
肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理学基础，表现为肝脏内纤维结缔组织异常增生，同时也是肝硬化的早期及向肝硬化转变的必经阶段。病因学上认为肝纤维化的发生和发展是许多不同因素作用的结果，其中包括化学品和药物(如乙醇、氨甲蝶呤、砷化物异烟肼、羟苯吲哚、甲基多巴、聚氯乙烯和二氧化钍等)，肝脏的各种感染(如病毒、细菌、螺旋体及寄生虫感染)等均可诱导肝内外源性及内源性物质的非正常沉积。我国现有各类型肝病患者已达2亿人之多，而肝炎、脂肪肝、酒精肝等在内的大部分肝病都可能导致肝纤维化的发生，不仅给无数患者和家庭带来了巨大的痛苦，也对社会造成沉重的经济负担。
近年来，随着对肝纤维化发生机制的认识不断深入特别是对细胞外基质的合成与降解的调控有了更多的了解。人们逐渐认识到由于肝纤维化的发生机理非常复杂，很难用单一作用靶点的药物来达到抑制肝纤维化的目的。目前，临床上使用的抗肝纤维化化学药物及生物制剂主要有以下几类 1、抑制肝脏炎症主要有秋水仙碱、干扰素、糖皮质激素、拉米夫定、马洛替酯、PGE、IL-10、特异性受体拮抗药(如IL-受体拮抗药、可溶性TNF-α受体)等。
2、抑制肝星状细胞活化与增殖肝星状细胞活化是肝纤维化发生的重要因素，激活的肝星状细胞具有增殖、纤维生成、致炎和收缩等功能，因此，抑制该种细胞的活化与增殖就成为抑制肝纤维化的重要策略。目前，水飞蓟宾、磷脂酰胆碱、维生素E和S-腺苷蛋氨酸等，在动物实验中均显示出对肝星状细胞的活化及胶原合成有抑制作用。
3、抗纤维化细胞因子白细胞介素10能促进胸腺细胞和B细胞增殖，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化实验中，白细胞介素10能阻断炎症反应，促进胶原的溶解，使得肝纤维化发生逆转。肝细胞生长因子能刺激肝细胞DNA合成，促进肝细胞增殖，减少肝细胞的坏死与损伤，减轻炎症刺激，抑制甚至逆转肝纤维化的发展。
4、诱导肝星状细胞凋亡资料显示曲霉菌素和胶毒霉素能不同程度的诱导肝星状细胞凋亡，减少胶原的合成，从而起到阻断或延缓肝纤维化的作用。
5、促进细胞外基质降解研究较为成熟的有不饱和卵磷脂和松弛素，体外实验证实其不饱和卵磷脂能抑制肝星形细胞转变为纤维母细胞，从而抑制细胞外基质分泌，促使已经形成的胶原分解。松弛素在体内外实验中均可促使胶原合成减少，细胞外基质降解增加。
尽管研究人员对肝纤维化的形成机制进行了深入的研究，但到目前为止，临床上还缺乏疗效确切、副反应小、毒性低的抗肝纤维化西药。由于化学药物及生物制剂在抗肝纤维化治疗中的种种不足，近几十年来国内外研究人员也致力于抗肝纤维化的中医药研究。传统中药的有效部位、单味制剂及复方成分复杂，对肝纤维化能进行多方位、多靶点治疗，较其他药物显示出明显的优势。
发明内容
本发明旨在提供一种抗肝纤维化的药物，所要解决的技术问题是自植物中草药中遴选疗效确切、毒性低、副反应小的活性成分。
齐贺彬等基于传统中医理论，认为肝纤维化的主要病因是湿热疫毒入侵和正气不足；肝血瘀阻是其病理基础，该病属本虚标实之证，病位在肝，表现为湿、热、毒、瘀、虚。申请人结合长期的中草药基础研究，利用吴茱萸所具有的温肝、散寒、止痛、降逆、燥湿等属性，对防治肝纤维化进行了深入的研究，结果发现吴茱萸有很好的预防和治疗作用，具有良好的临床应用前景。
本发明所称的吴茱萸总生物碱新的医药用途就是吴茱萸总生物碱在制备抗肝纤维化药物中的应用。
所述的吴茱萸总生物碱是自吴茱萸中提取、分离得到的吲哚喹啉类和喹诺酮类等生物碱的总称，以生物碱计，总生物碱含量20～60％。
所述的吴茱萸总生物碱的提取、分离如下 取吴茱萸生药，酸性乙醇回流提取，提取液合并，回收部分乙醇后调整pH值上树脂柱，水洗后收集40-95％乙醇洗脱部分，回收乙醇，减压浓缩，干燥后得到的提取物即是吴茱萸总生物碱。其主要成分总生物碱含量以生物碱计20～60％。
总生物碱可加入药学上允许的相应辅料，制成片剂、胶囊、缓释片、滴丸、冲剂、微粒剂，并进一步纯化制成针剂。
根据动物实验的结果，吴茱萸总生物碱临床推荐剂量300～1200mg/天，口服，一日三次。
本发明有以下的优点和效果 1、本发明发掘了吴茱萸总生物碱新的药用前景，开拓了一个新的药用领域； 2、本发明的吴茱萸总生物碱采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害； 3、本发明吴茱萸总生物碱的原药资源非常丰富，具有良好的社会和经济效益； 4、本发明的吴茱萸总生物碱对肝纤维化的疗效确切； 5、本发明为将吴茱萸总生物碱进一步开发成新药提供了强有力的基础。
四
附图所示是受试大鼠肝组织切片光镜图，其中 图1是对照组(正常组)HE染色10×10倍。
图2是模型组HE染色10×10倍。
图3是吴茱萸总生物碱100mg·kg-1HE染色10×10倍。
图4是吴茱萸总生物碱50mg·kg-1HE染色10×10倍。
图5是阳性药组HE染色10×10倍。
五具体实施例方式 以下结合实施例对本发明作进一步地描述。
(一)吴茱萸总生物碱的制备 取吴茱萸生药6kg，用酸性乙醇回流提取4次，每次1.5h，提取液合并，回收部分乙醇后调整pH至2上阳离子树脂柱，水洗后收集80％乙醇洗脱部分，回收乙醇，减压浓缩，干燥即得吴茱萸总生物碱。以总生物碱计，生物碱含量为20～60％。
(二)动物实验 实验结果如下 1、实验目的 采用体积分数比为40％CCl4色拉油溶液给予大鼠背部或四肢下注射制备肝纤维化模型，测试吴茱萸总碱对肝纤维化的治疗作用。
2、受试药物 名称吴茱萸总碱 来源安徽省药物研究所 纯度总生物碱含量＞50％ 批号20090121 溶液用5‰CMC-Na溶液混悬溶解。
3、阳性对照药 名称复方鳖甲软肝片 来源内蒙古福瑞蒙药科技股份有限公司 批号20080604 规格0.5g/粒 4、实验动物 品系SD大鼠 体重180±20g 性别雌性 来源安徽医科大学实验动物中心 动物合格证号皖医实动准第01号 每组动物数12只 5、实验试剂 CCl4溶液分析纯，纯度≥99.5％，广东汕头西陇化工厂有限公司 AST、ALT试剂盒长春汇力生物技术有限公司 LN、HA和、PCIII放免试剂盒北京华英生物技术研究所 6、实验方法 实验设吴茱萸总生物碱大、小剂量组(100、50mg·kg-1)，模型组，复方鳖甲软肝片组(600mg颗粒·kg-1)和对照组。
采用体积分数比为40％CCl4色拉油溶液给予大鼠背部或四肢下注射制备肝纤维化模型，3ml·kg-1(首次剂量加倍)，一周2次，连续12周；正常组，皮下注射等量色拉油；阳性药和受试药均用5‰CMC-Na溶液混悬溶解，每天灌胃给药1次，连续10周。正常组和模型组给予等量5‰CMC-Na溶液。
实验12周末(给药10周)，3.2％水合氯醛(1ml·100g-1)腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，以3500r·min-1离心10min，取上清液按试剂盒说明测定血清肝功能生化指标AST和ALT活性(赖氏法)；肝纤维化指标HA、LN、PC-III放免法测定。处死大鼠，称肝、脾湿重，计算肝、脾重指数。肉眼观察大鼠肝脏情况并评分，取部分右叶肝脏以福尔马林浸泡，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。
7、实验结果 (1)吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠肝重、脾重指数的影 给药12周模型组大鼠体重明显低于正常组，肝重指数显著高于正常组，脾重指数与正常组无统计学差异；吴茱萸总生物碱100mg·kg-1组大鼠体重增长略快于模型组，肝重指数明显低于模型组(见表1)。
表1吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠肝重、脾重指数的影响
(2)吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠肝功能的影响 CCl4造模期间，模型组大鼠血清ALT和AST显著高于正常组(P＜0.01)，提示造模成功；给药2～10周期间，吴茱萸总生物碱高剂量组ALT呈进行性下降(P＜0.05～0.01)，吴茱萸低剂量组和阳性药组于给药10周后ALT和AST均明显下降(见表2、3)。
表2吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠血清ALT的影响
表3吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠血清AST的影响
(3)吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠血清中LN、HA和PCIII的影响 采用CCl4造模12周后，模型组大鼠血清PCIII、HA和LN均显著高于正常组(p＜0.01)，提示肝组织中ECM大量沉积，TAE 50、100mg·kg-1组和阳性药组上述三指标均明显下降(见表4)。
表4吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠血清中LN、HA和PCIII的影响
(4)吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠病理组织学的影响 肉眼观察到正常组大鼠肝脏表面光滑，色泽鲜红；模型组大鼠肝脏颜色暗淡、偏黄，甚至肝脏表面呈颗粒状或细小结节状，肉眼观察平均分为2.8分，吴茱萸总生物碱高剂量组大鼠肝脏肉眼观察病变情况轻于模型组，平均分为1.8分，各组大鼠肝脏肉眼观察评分见表5。
表5吴茱萸总生物碱对CCl4致肝纤维化大鼠病理组织学的影响
评分标准0分表面光滑，色泽鲜红；1分肝脏表面光滑，色泽淡红； 2分肝脏表面光滑，黄色； 3分肝脏表面尚光滑，观之呈颗粒状，色泽黄； 4分肝脏表面不光滑，有细小结节，色泽黄。
光镜观察显示正常组大鼠肝小叶结构完整，汇管区结构正常，肝窦明显，肝细胞呈索状分布，排列整齐，体积正常，无脂肪变性坏死，无炎症细胞浸润。如图1所示。模型组肝小叶结构紊乱，肝细胞呈肿胀空泡样脂肪变性，汇管区有炎症细胞浸润，胶原纤维沿汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸，交联呈网状结构，部分大鼠形成完整的假小叶。如图2所示。吴茱萸高剂量组大鼠肝小叶结构明显改善，胶原纤维间隔减少，肝细胞坏死、炎性细胞浸润少见，汇管区结缔组织增生减轻。如图3所示。吴茱萸低剂量组和阳性药组肝组织灶性破坏，肝细胞变性、肝纤维化较模型组也减轻。如图4所示。说明吴茱萸总生物碱能有效的缓解CCl4诱导的大鼠肝纤维化。总体效果优于阳性药组。
(三)吴茱萸总生物碱制剂加工 吴茱萸总碱片剂的制备 实施例一 吴茱萸总碱100mg 淀粉100mg 淀粉浆(10％)适量 硬脂酸镁1％ 工艺 将主药和辅料混匀，以10％淀粉浆制粒、干燥、整粒，加入硬脂酸镁混匀，压片即得。
实施例二1000片 吴茱萸总碱100g 淀粉100g 淀粉浆(10％)适量 硬脂酸镁1％ 工艺同上。
权利要求
1.一种吴茱萸总生物碱新的医药用途，其特征在于吴茱萸总生物碱在制备抗肝纤维化药物中的应用。
全文摘要
一种吴茱萸总生物碱新的医药用途，即吴茱萸总生物碱在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用。吴茱萸总生物碱是自吴茱萸中提取、分离得到的吲哚喹啉类和喹诺酮类生物碱的总称，总生物碱含量20～60％。本发明在大鼠四氯化碳诱导肝纤维化的治疗作用实验中显示出一定的治疗作用，有较好的临床应用前景。说明吴茱萸总生物碱具有确切的抗肝纤维化作用，可与辅料结合制备抗肝纤维化药物。
文档编号A61K36/754GK101829218SQ201010171738
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者张毅, 杨冬梅, 李莉, 陈师农, 马玲, 钱利武 申请人:安徽省药物研究所