专利名称：淫羊藿苷抗缺氧新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及淫羊藿苷抗缺氧作用的应用，具体涉及淫羊藿苷在抗缺氧诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用。
背景技术：
缺氧是特殊环境生理、临床等领域经常涉及的病理生理现象。作为ー种应激因素，缺氧可份致呼吸系统、心血管系统、神经系统及内分泌系统的功能损伤。其中，神经系统对缺氧尤为敏感，其损伤机制比较复杂。临床上常用的抗缺血缺氧的西药主要有钙通道阻滞剂、自由基清除剂和ー些中枢抑制药，这此药物虽然具有较明显的作用，但是这此药物毒副作用较大。近年来，中药在抗缺氧损伤方而的作用逐渐被人们所关注，具有良好的应用和开发前景。
淫羊藿是ー种传统的补益中药，为小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimediumpubescens Maxim.)、或朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanumNakai)的干燥叶。性辛、甘，温。归肝、肾经。具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种功效。初步确定淫羊藿总黄酮在给药剂量900mg/ (kg · d)时,对常压密闭缺氧条件下小鼠，可延长存活时间，减轻脑水肿及肺水肿的程度。(张汝学，淫羊藿总黄酮对缺氧模型小鼠的抗缺氧作用，中药材，2009，32 (11)，1737)淫羊藿总黄酮给药剂量大，而且组成成分复杂，作用机理不明确，不适合患者长期服用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是淫羊藿苷对血管缺氧损伤的保护，主要是对淫羊藿苷在缺氧诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用。所述药物可通过ロ服、经皮或静脉途径给药；所述药物以ロ服剂、注射剂及局部给药制剂形式存在；所述ロ服剂包括胶囊剂、ロ服液、片剂、颗粒剂；所述注射剂包括注射液、注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括贴剂。本发明人通过系列实验证实了淫羊藿苷具有显著的抗缺氧作用，尤其抑制缺氧引起的血管内皮细胞减少；尤其是抑制缺氧引起的血管内皮细胞凋亡；尤其是抑制缺氧引起的LDH活力降低；尤其是抑制缺氧条件下MDA产生；尤其是提高缺氧条件下SOD活力。本发明人采用实验证实淫羊藿苷能抑制缺氧引起的血管内皮细胞減少，降低LDH活力，并抑制缺氧条件下MDA生成，提高SOD活力；缺氧能诱导血管内皮细胞凋亡，表现为细胞核浓縮，沿核膜排列成块状，DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型“梯形条帯”，流式细胞仪分析呈现典型凋亡亚二倍体峰。淫羊藿苷能显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡。结果证实，本发明的淫羊藿苷具有显著的保护缺氧诱导的血管内皮细胞损伤的作用，其作用机制与抗脂质过氧物产生、提高SOD活力以及抗细胞凋亡有夫。
图I是荧光显微镜下血管内皮细胞的细胞核变化图(Nucleus changes of VECsunder fluorescent microscopy)图2是衰老血管内皮细胞的超微结构图(Ultrastructure of senescent VECs)图3 是流式细胞仪检测亚 Gl 峰图(Sub-Gl peak was detected by flowcytometry)a)对照组(a) control)b)缺氧的细胞显不典型的亚 Gl 峰(b)hypoxia cells displayed a typicalsub-Gl peak)c) 35mol/L淫羊藿苷处理的血管内皮细胞组(c) VECs treated with ICA 35mol/L)d) 70mol/L淫羊藿苷处理的血管内皮细胞组(d) VECs treated with ICA 70mol/L)e) 150mol/L淫羊藿苷处理的血管内皮细胞组(e) VECs treated with ICA150mol/L)图4 是 DNA 片段的琼脂糖凝胶电泳图(Agarose gel electrophoresis of DNAfragmentation)I.对照组(I. control)2.缺氧模型组(2. hypoxia)3. 35mol/L淫羊藿苷处理的血管内皮细胞组(3. VECs treated with ICA 35mol/L)4. 70mol/L淫羊藿苷处理的血管内皮细胞组(4. VECs treated with ICA 70mol/L)5. 150mol/L淫羊藿苷处理的血管内皮细胞组(5. VECs treated with ICA150mol/L)
具体实施例方式为了便于理解淫羊藿苷的抗炎效果，本发明进行了如下药效学实验实施例I :淫羊藿苷对缺氧诱导血管内皮细胞损伤的保护作用一、实验材料与方法I、材料人脐静内皮細胞株ECV-304引自美国组织培养库(ATCC CRI-1998)。淫羊藿苷由北大世佳研究中心提供。DMEM培养基，胰蛋白酶，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于美国GIBCO公司。胎牛血清为天津正江高科技有限公司产品。ニ甲基亚砜(DMSO)购于Amresco公司。RNA酶，PI为Sigma公司产品。培养胞荧光染色凋亡显示试剂盒为北京威格拉斯有 限公司产品。缺氧装置系统为法国BioM e rieux sa公司产品。酶标仪(Multiskan MK3)购于上海雷勃分析仪器有限公司。紫外可见分光光度计(UV-2501PC)为日本岛津公司产品。流式细胞仪为Becton-Dickinson公司产品。焚光显微镜为Olympus公司产品。2实验方法2. I内皮細胞培养ECV-304細胞培养于DMEM培养液中，其中胎牛血清10%，青霉素100U/ml链霉素100g/ml 37°C,5% CO2培养箱中培养。2. 2MTT法检测ICA对血管内皮细胞毒性试验參照文献[6]，(Kitazono M，iakebayasm Y, Ishitsuka K, et al. Prevention of hypoxia—inducedapoptos is bythe angiogenic thymidine phosphorylase. Biochem Biophys ResCommun. 1998 ；253(3)797-803)取ECV-304细胞5X 103，接种于96孔细胞培养板内，用DMEM培养液配制成不同浓度的ICA药液，实验时弃去细胞培养液，分别向孔中加入不同浓度的ICA药液200L，每个浓度组设重复孔6个，空白对照组每孔加入200L不含ICA的DMEM培养液。37°C CO2培养箱培养72h。终止培养前每孔加入MTT(最终浓度O. 5mg/ml) ,37°C,5% CO2孵育4h。弃去上清液，每孔内加入DMSO 2001，静置lOmin。在酶标仪570nm下测定各孔吸光度。2. 3建立体外培养的内皮细胞缺氧模型采用法国BioM e r ieux sa公司缺氧置系统。细胞在缺氧条件下培养48小吋。血气分析表明常氧和缺氧细胞培养液中氧分压分别为206mmHg和18. 3mmHg,达到所需要的缺氧条件。 2. 4实验分组正常细胞培养组，缺氧模型组，ICA 35，70，140mol/L组.2. 5MTT法检测ICA对缺氧损伤的内皮细胞活性的影响取6X IO3细胞，培养24小时后，将缺氧模型组细胞及ICA各浓度组细胞置于缺氧罐中培养48小吋。每组设8个重复孔。缺氧结束后，MTT法检测各组细胞吸光度值。2. 6MDA含量、SOD活力测定參照试剂盒说明书并略作改动，O. 25%消化6X IO5细胞，用PBS洗涤2次。将细胞充分裂解后离心，取IOOL细胞上清按试剂盒操作。2. 7LDH活力的测定将细胞接种于24孔培养板，取细胞培养上清，按试剂盒操作。2. 8细胞凋亡的荧光Hoechst33342染色(I)用无血清DMEM洗涤2次。(2)加入 Hoechst33342 染液，37。C孵育 lOmin。(3)紫外光激发，荧光显微镜观察凋亡细胞并拍片。2. 9透射电镜观察(I)将约I X IO7细胞轻轻刮下，1000 Xg离心IOmin弃上清；(2)PBS洗细胞2次，小心弃去上清，轻轻加入0.25%戊ニ醛固定细胞团。可放置
4°C保存。(3)经脱水、包埋、超薄切片后透射电镜下观察。2. 10流式细胞仪分析(I)制备细胞样品，约收集I X IO6个细胞，用0.25%胰酶/0.04% EDTA消化细胞，细胞悬液洗涤2次，充分吹散混匀。(2)用 500L PBS 充分混悬。(3)在15ml离心管中加入5ml 70%冷こ醇，_20°C预冷。(4)将细胞悬液逐滴滴入70%冷こ醇中，4°C固定过夜。(5)离心弃去こ醇后，留400L加入RNase A(终浓度50g/ml)，37°C温育30min，碘化丙唳(propidium iodide, PI,终浓度为 50g/ml), 4°C避光反应 30min。(6)300目尼龙网膜过滤后的细胞即可用于流式细胞测试用。2. IIDNA琼脂糖凝胶电泳(I)收集IO7细胞，PBS洗涤两次。
(2)加入细胞裂解液(IOmM Tris-HCl pH 8. O, IOOmM NaCl,O. 5% SDS,25mM EDTApH 8. 0,0. 5mg/ml 蛋白酶 Κ)0· 5mL，37°C作用 12h。(3) RNA 酶储存液(10mg/mL) 20L, 50°C作用 lh。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 I)，充分颠倒混匀，室温静置10分钟，12，OOOr. HiirT1离心10分钟，吸取上清液，转移入另ー EP管中。2倍体积的无水こ醇，-20°C放置4h。12，OOOr. mirT1离心10分钟，弃上清，取沉淀。用75%的こ醇洗涤沉淀一次，12，OOOr. mirT1离心10分钟，弃上清。将沉淀在空气中风干，溶于20LTE缓冲液中，再加入RNA酶储液5L，37°C水浴作用 Ih.电泳。电泳条件1. 5%琼脂糖凝胶，50V电压电泳3h。2. 12统计学分析所有数据以;±ぶ表示，以t检验进行显著性分析ニ、实验结果I、ICA对内皮细胞的体外毒性实验研究经MTT法检测，当ICA最高浓度为140mol/l时，与空白对照组相比，细胞抑制率为
I.2%，表明对细胞无毒性作用，可用于后续试验。2、ICA对缺氧损伤的内皮细胞活性、MDA含量、SOD活性、释放LDH的影响结果见表1，MTT法可反映细胞存活的数目。缺氧可引起内皮细胞減少，与正常对照组比较差异具有显著性(P < O. 01)，ICA能抑制缺氧引起的细胞減少，当浓度为35mol/L时即发挥作用(P < O. 05)，且随ICA浓度增加，细胞抑制率逐渐下降，并呈现一定的浓度依赖关系；缺氧能显著加剧细胞膜的脂质过氧化反应，与正常对照组比较，缺氧损伤的内皮细胞中MDA含量明显升高(P < O. 01)。当ICA的浓度为140mol/L吋，能显著抑制缺氧引起的MDA升高(P<0.01)。35mol/L、70mol/L ICA与缺氧模型组比较，有下降趋势，但经统计学分析，差异不具有显著性；缺氧模型组细胞SOD活性明显下降，与正常对照组比较，差异具有显著性(P
<O. 01)。加入不同浓度的ICA可剂量依赖地抑制SOD活性降低，当ICA浓度为70mol/L时与缺氧模型组比较差异具有显著性(P < O. 05)。表明ICA能通过提高内在的抗氧化酶活性，保护细胞膜免受自由基的攻击；与正常对照组比较，缺氧模型组细胞上清中LDH活力明显升高，差异具有显著性(P < O. 01)。ICA各剂量组均能显著减少缺氧引起的LDH释放(P
<O. 01)，且表现出明显的剂量依赖效应。表IICA对缺氧损伤的内皮细胞活性、MDA含量、SOD活力及释放LDH的影响
注与正常对照组比较，*Ρ < O. 05，林P < O. 01 ;与缺氧模型组比较，ΛΡ < O. 05，ΔΔΡ < O. 01，3、ICA对缺氧诱导血管内皮细胞凋亡的影响3. lHochest33342荧光染色观察细胞核变化Hoechest33342是ー种DNA亲和染料，能特异地与DNA螺旋小沟富含AT重复序列结合。经荧光显微镜观察，缺氧模型组细胞核发生染色质凝聚，核边缘化，呈现明亮的荧光，偶见有核碎裂现象，有游离的凋亡小体出现(见图Ib)，正常细胞核呈现弥散均匀的蓝色荧光(见图Ia)。与模型组相比较，随药物浓度的升高，高荧光强度的细胞逐渐減少，当ICA浓度为140mol/L时，部分细胞呈均匀弥散的荧光，或仅表现为核玻珠化或波纹状等早期凋亡的变化(见图lc-e)。3. 2细胞核超微结构变化细胞核超微结构变化是凋亡细胞最富特征性的改变。与正常细胞对照组相比，缺氧模型组细胞出现典型的凋亡形态学变化，包括染色质高度浓缩，沿核膜排列形成大小不同的块状(见图2b)。而正常组细胞核膜光滑平整，染色质分布均匀(见图2a)。与缺氧模型组比较，ICA各剂量组组细胞超微结构逐渐改善，以140mol/L ICA组细胞最为明显(见图 2c_e)。3. 3流式细胞仪分析凋亡的标准特征之ー是基因组DNA以核小体为单位的断裂，除用常规的琼脂糖凝胶电泳检测外，可用凋亡细胞核PI标记后的流式细胞计量术来定量分析。流式细胞计量术结果可显示凋亡细胞在细胞循环图直方图的亚二倍体区出现。分析亚二倍体峰的比例能够表达细胞死亡的程度，但不能区分死亡的类型(凋亡与非凋亡)。PI是ー种阳离子染料，胞膜完整的细胞可对其拒染，只对晚期凋亡及坏死的细胞着色，细胞核呈现红色荧光。ICA对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响正常对照组细胞DNA大多处于G0/G1期(见图3a)，缺氧模型组细胞DNA在G0/G1前出现明显的凋亡亚二倍体峰(见图3b)，给予ICA作用的细胞凋亡峰明显减小，说明DNA断裂减轻。正常细胞平均凋亡率为1.41% ;缺氧组细胞平均凋亡率为38. 22%，与正常对照组比较有显著性差异。ICA 35，70，140mol/L组细胞凋亡率分别为13. 60%，9. 66%和4. 55%，与缺氧模型组比较，均有显著性差异(P < O. 01)。可见ICA能显著抑制由缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡。(见图3c，3d，3e)4DNA琼脂糖凝胶电泳检测
细胞发生凋亡吋，由于内源性核酸内切酶被激活，可选择性降解核小体间DNA，形成大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现规则的、间隔180-200bp的DNA梯带，SP“DNA ladder”。结果可见，缺氧模型组细胞在琼脂糖凝胶电泳上可见明显的DNA梯形条带，35,70mol/L组细胞有不規律的DNA断裂，140mol/L未见明显DNA的断裂。进ー步表明，缺氧可诱导细胞出现凋亡，而ICA能显著抑制缺氧引起的细胞凋亡，并呈现剂量依赖性。本实验发现，缺氧使内皮细胞的甲肷形成量減少，而缺氧的同时加入ICA可促进甲肷的形成，说明淫羊藿苷具有抗缺氧诱导的内皮细胞损伤的作用，可能与保护线粒体的功能有关。实验证实淫羊藿苷能抑制缺氧引起的血管内皮细胞減少，降低LDH活力，并抑制缺氧条件下MDA生成，提高SOD活力；缺氧能诱导血管内皮细胞凋亡，表现为细胞核浓缩，沿核膜排列成块状，DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型“梯形条带”，流式细胞仪分析呈现典型凋亡亚二倍体峰。淫羊藿苷能显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡。可见，淫羊藿苷具有显著的抗缺氧作用，尤其抑制缺氧引起的血管内皮细胞減少； 尤其是抑制缺氧引起的血管内皮细胞凋亡；尤其是抑制缺氧引起的LDH活力降低；尤其是抑制缺氧条件下MDA产生；尤其是提高缺氧条件下SOD活力。
权利要求
1.淫羊藿苷抗缺氧作用的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于抑制缺氧引起的血管内皮细胞減少。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于抑制缺氧引起的血管内皮细胞凋亡。
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于抑制缺氧引起的LDH活力降低。
5.根据权利要求I所述的应用，其特征在于抑制缺氧条件下MDA产生。
6.根据权利要求I所述的应用，其特征在于提高缺氧条件下SOD活力。
7.根据权利要求1-6任一所述应用，其特征在于所述药物是由有效量的淫羊藿苷和药学上可接受的载体组成，载体包括ロ服制剂载体、注射制剂载体、局部给药制剂载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述药物以ロ服剂、注射剂及局部给药制剂形式存在，ロ服剂包括胶囊剂、ロ服液、丸剤、片剂、颗粒剂；所述注射剂包括注射液、注射用冻干粉针剂；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂。
全文摘要
本发明涉及一种淫羊藿苷抗缺氧的新应用。本发明的试验证明，该化合物具有显著的抗缺氧诱导的抗缺氧损伤的保护作用。本发明同时还提供了淫羊藿苷用于制备抗缺氧作用的药物制剂。
文档编号A61P39/00GK102670635SQ201110056638
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者周亚伟 申请人:周亚伟