专利名称：一种组织工程软骨支架材料及其制备方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种组织工程软骨支架材料及其制备方法和制备装置。
背景技术：
关节软骨损伤是临床常见疾患。国内外调查显示，关节软骨损伤患病率约15 %，40 岁人群患病率为10% 17%，60岁以上则达50%，而在75岁以上人群中80%患有骨性关节炎伴随的软骨缺损。在美国，关节软骨损伤是导致50岁以上男性丧失工作能力的第二位原因(仅次于缺血性心脏病)，也是中年以上人群慢性致残的主要原因。据美国风湿病学会 (ACR)数据显示目前，美国约有2000万关节软骨损伤患者，估计至2020年，发病人数将上升到4000万，65岁以上老年人中，70%有关节软骨损伤症状，其中46%不同程度地丧失关节功能和劳动能力，每年门诊病人700万，住院病人300万。美国第三次国家健康与营养调查表明，8%的成人可以明确诊断为手关节软骨损伤，意味着每12个美国人中就有I人患手关节软骨损伤。保守估计，我国骨关节疾患在5000万以上。研究发现，软骨损伤发病有低龄化的趋势，临床上有症状的30 40岁的软骨损伤患者并不少见，X线普查发现15 24岁年龄组的骨关节炎发生率为10%。人关节软骨无血管、无神经，软骨细胞被周围基质限制很难迁移，因此软骨损伤后不能自愈。传统的治疗方法(如关节灌洗术和关节清理术、微骨折手术、骨膜移植、自体/异体软骨移植等)只能缓解症状，不能有效恢复受损组织功能。近年出现的软骨细胞移植技术，能够在一定程度恢复软骨组织的结构功能，但需要二次手术，并且会对供区造成损伤。组织工程软骨的开发为治疗软骨缺损提供了一种更好的选择。研究者采用多种支架材料与多种细胞构建出了性状较好的组织工程软骨；由于天然软骨不是一个无序的结构，而是由表层、移行层、辐射层和钙化层四层结构部分组成；表层结构中II型胶原含量最高，而糖胺聚糖(GAG)含量较低，其基质纤维按水平方向分布；移行层和辐射层结构中II型胶原随着深度增加其含量逐渐下降，而GAG正好相反，并且基质纤维按垂直方向排列，正是这种结构赋予了关节软骨良好的抗压特性；钙化层结构中II型胶原含量最低，GAG含量最高，并且存在有大量的X型胶原。软骨组织这种有序的结构与成份分布，最终形成了关节软骨耐磨、抗压的功能特点。基于关节软骨的生理特点，若要构建出功能与天然软骨一致的组织工程软骨，首先要制备出具有天然软骨结构特征的组织工程软骨支架材料，在其上复合种子细胞，实现与人软骨组织接近的组织工程软骨的构建。经检索，中国专利申请200610026004. 2,200910058053. 8,02113378. 6 和 201010539861. 9所构建的软骨支架为均一的组分和结构，不具有天然软骨组织结构特点。 中国专利申请200910117158. 6虽有分层结构，但其结构仅是羟基磷灰石的含量不同，软骨支架材料没有能够增加软骨抗压强度的垂直定向结构。中国专利申请201010297976. I构建的软骨修复材料呈天然软骨基质的纵向排列方式，但其并不具备软骨表层的水平排列纤维结构以及钙化层的成份特点。中国专利申请200710090962. 0公开了ー种关节软骨生物支架材料及制备方法，是将脱细胞、去抗原、去I型和X型胶原的天然软骨基质成份与II型胶原共混，以氯化钠晶体颗粒作为致孔剂，通过理化处理，制成ー种多孔的关节软骨支架材料；该方法采用天然软骨基质为原料，保证了构建材料成份与天然软骨一致，但软骨组织各层之间组分差异较大，而且钙化层去除了软骨基质中的X型胶原，不同于天然软骨基质成份。中国专利申请200510012257. X采用聚こ烯醇(PVA)与羟基磷灰石等材料构建多层软骨材料，模拟天然软骨组分在多层结构中的渐变规律，以PVA等高分子材料代替软骨组织中的胶原、蛋白聚糖等成份，但高分子聚合材料在体内的降解代谢与软骨基质完全不同，前者的降解会产生酸性产物，引起非菌性炎症反应，直接影响到移植物与周围组织的融合。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种组织工程软骨支架材料及其制备方法和装置，所制备的软骨支架材料在复合软骨细胞后，能够用于全层软骨缺损修复， 再生的软骨组织具有与天然软骨一致的结构及组分，适用于负重部位关节软骨的修复。本发明所提出的组织工程软骨支架材料，具有与天然软骨组织的类似结构，由上至下依次为表层、中层和钙化层；其中表层由冻干软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、糖胺聚糖(GAG)、X型胶原和II型胶原及转化生长因子(TGF-P)组成，其基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型胶原及煅烧骨粉组成，钙化层内的纤维在三维空间交错分布。由于天然软骨组织的移行层和辐射层在组分及结构功能上相似，本发明中把这两层结构并为ー层，构建软骨支架材料的中层， 其结构和组分与天然软骨的移行层及辐射层接近。本发明所提出组织工程软骨支架材料的制备方法，其特征是将天然软骨基质制备成凝胶，添加GAG、X型胶原及煅烧骨后，冻干制备钙化层；天然软骨基质与GAG、X型胶原、 II型胶原及TGF-P混合后，在钙化层表面进行低温定向結晶，经冷冻干燥后形成中层；将天然软骨基质与II型胶原复合后，采用旋转涂层方法在中层表面制备表层，晾干后得到组织工程软骨支架材料。具体步骤包括步骤一、天然软骨基质的制备在4°C条件下，将哺乳动物无软骨膜的关节软骨块放入液氮冷冻3小时后，转入预冷的粉碎机中粉碎，采用体积浓度为I %的醋酸溶液溶解， 经真空冻干得到软骨基质；步骤ニ、钙化层的制备将冻干软骨基质、GAG和X型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中，使终浓度分别为5 12mg/ml、8 15mg/ml和5 10mg/ml,用氢氧化I丐溶液调 pH至中性，得到软骨基质溶液；将粒径0. 05 0. 2mm的煅烧骨粉按0. I 0. 5g/ml的量与软骨基质溶液混合均匀，得到凝胶溶液，将其注入培养器皿底盒，使凝胶层厚度为I 4_， 加盖后在37°C条件下待凝胶溶液凝固后，连同器皿一起置入-80°C环境中冷冻，形成钙化层；天然软骨钙化层是软骨与软骨下骨的过渡连接部位，其中的细胞主要是肥大软骨细胞，能够大量分泌GAG与X型胶原，所以钙化层中GAG和X型胶原浓度较高，形成了钙化层特殊的大分子蛋白网络结构，赋予钙化层较大的抗压强度。本发明人通过研究天然软骨钙化层中两种主要组分GAG和X型胶原的含量特点，在冻干软骨基质内添加GAG和X型胶原制备钙化层，证实所构建的钙化层在复合软骨细胞后，能够促进软骨细胞向肥大软骨细胞分化，并且具有接近天然软骨钙化层的抗压强度。本发明在钙化层中加入煅烧骨这种生物相容性好、成骨效果稳定的骨修复材料，能够在修复软骨缺损的同时，再生软骨下骨，有利于钙化层与软骨下骨层的融合；并可以通过煅烧骨与冻干软骨基质比例的调整改变钙化层的抗压强度及可塑性。例如，当煅烧骨粉与冻干软骨基质溶液的质量体积比小于O. 2g/ml 时，所制备的钙化层，经复水后柔韧度高，可根据缺损部位形状任意塑形，便于临床操作。步骤三、中层的制备将冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原溶于体积浓度为 I %的醋酸溶液中，使终浓度分别为5 12mg/ml、4 10mg/ml、2 5mg/ml和4 IOmg/ ml，用氢氧化钙溶液调pH至中性，再加入终浓度为2 15ng/ml的TGF-β，得到支架材料中层的凝胶溶液；将步骤二冷冻的盛有钙化层的培养器皿置于_80°C的底板上，在O 10°C 的空气环境中，将中层凝胶溶液注入培养器皿内的钙化层表面，该凝胶层厚度为I 3mm之间，加盖待凝胶溶液结冰后，转入_80°C环境下冷冻3小时以上；再经低温真空干燥，得到软骨支架材料的中层与钙化层结构；天然软骨的辐射层与移行层的基质成分及结构相似，为了模拟天然软骨辐射层和移行层的基质蛋白纤维纵向分布的特点，本发明采用预冻中的低温钙化层为冰晶“形成模板”，利用定向结晶原理，在中层凝胶冷冻结冰过程中，冰晶以钙化层表面为起点逐渐向上生长，经低温冷冻干燥后，形成基质蛋白纤维呈纵向排列的定向支架材料。为了保持后期接种在此支架材料中的软骨细胞的分化状态，在中层的构建过程中，添加了能够促进软骨细胞分化的转化生长因子。步骤四、表层的制备将冻干软骨基质和II型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中，使终浓度分别为I 3mg/ml和9 30mg/ml，用氢氧化钠溶液调pH至中性，采用真空旋转涂膜方法将其均匀涂布于经低温真空干燥的中层表面，其旋转速度500 3000rpm，时间20 100s，晾干后得到组织工程软骨支架材料。软骨组织表层结构的完整对于保持软骨正常的生理代谢至关重要，表层结构相对致密，控制着软骨基质中水分的出入，含水量对于保持软骨组织表面的润滑和软骨组织的高弹性模量具有重要作用。表层中II型胶原含量占到软骨组织细胞外基质总蛋白含量的 90%，胶原纤维在表层呈水平方向平行分布，有利于降低摩擦系数，保持关节面功能。为了使所制备的组织工程软骨支架材料表层更接近于天然关节表层的蛋白组分和胶原纤维分布特点，将以II型胶原为主的基质蛋白溶液均匀涂布在已构建的纵向分布的基质蛋白纤维结构之上，以晾干的方式增加表层胶原纤维的致密程度、减小摩擦；其中，所述的真空旋转涂膜方法可以通过控制旋转速度和涂膜时间来调整表层结构的致密程度和厚度。本发明制备的软骨支架材料以天然软骨组织基质为基础成分，从表层至钙化层， II型胶原含量逐渐下降，GAG含量逐渐升高，并在钙化层中加入了天然软骨组织钙化层特有的X型胶原成分。为了实现天然软骨多层结构中各层蛋白纤维结构的空间分布特点，本发明采用定向结晶和旋转涂膜方法，使所制备中层的蛋白纤维纵向排列、表层的蛋白纤维水平排列，并使钙化层具有骨修复效果，有利于支架材料植入后与软骨下骨的融合，促进软骨下骨的再生。所制备的软骨支架材料在复合软骨细胞后，能够用于全层软骨缺损修复，再生的软骨组织具有与天然软骨一致的空间结构和蛋白组分；特别适用于膝关节等负重部位关节软骨的修复，再生抗压强度较大的新生软骨。本发明通过在软骨支架材料表面制备致密的软骨基质涂层，既能提高软骨支架表面的耐磨性，保证软骨修复区表层结构的完整，又能防止软骨受力后的水分流失，具有保水特性，保持了软骨组织的高弹性模量，进ー步加强了再生软骨的抗压能力。本发明制备组织工程软骨支架材料采用的培养器皿，由下至上依次为培养器皿底盒、增高圈及上盖，其相互之间能够密封扣合，根据需要可増加中部的增高圈调整高度。器皿底盒内用于材料培养，内径为5 30mm,深度为I IOmm,其中增高圈深度为I 5mm ； 培养器皿底盒由导热良好的金属材质制成(如医用不锈钢)，增高圈与上盖采用阻隔热传导性能良好的材质制成(如聚苯こ烯泡沫)，其相互间密封性良好，能够防止热传导及液体渗漏。培养器皿的内径、外径及深浅根据所制备支架材料的尺寸确定。使用时，底盒在下， 可在底盒侧壁处套装增高圏，最后扣合上盖。在制备组织工程软骨支架材料过程中，培养器皿置于低温环境，由于底部导热良好，温度迅速降低，而增高圈和上盖在短时间仍然维持相对高温，使器皿内溶液先从底部形成冰晶，逐渐向上凝结，这样就能够保证溶液冰晶的生长沿ー个方向进行，有利于制备具有方向性的支架材料。
附图I为本发明制备方法所采用培养器皿的结构示意图，图中I为底盒，2为增高圈(可以是I 3个)，3为上盖。附图2为本发明所制备软骨支架材料中层的电子显微照片，可见其中基质蛋白纤维呈纵向分布，证实所制备的组织工程软骨支架材料的结构与天然软骨基质的结构相似。附图3为本发明所制备软骨支架材料中层结构横截面的电子显微照片，可见纤维排列不同于纵向的定向特性，呈现多孔隙的特点，证实所构建的软骨支架材料在垂直与水平方向具有不同的结构特点，与天然软骨一致。附图4为本发明所制备软骨支架材料钙化层的电子显微照片，可见钙化层中的煅烧骨颗粒与软骨基质结合紧密，两种材料复合形成的钙化层复水后能够保持一定的含水率，能根据缺损部位的实际情况塑形。附图5为本发明制备的软骨支架材料在复合软骨细胞后用于兔关节软骨修复术后8周的结果照片，结果显示，新生软骨组织的纤维结构具有天然软骨的纵向分布特点，且软骨特有的多层结构完整。
具体实施例方式以下结合实例对本发明技术方案作进ー步的详细说明。实例中所采用的哺乳动物关节软骨购于屠宰场，剥去表面的软骨膜；采用的煅烧骨粉购买于市售的同类产品(如珠海丽珠集団生产的拜阿蒙牌羟基磷灰石骨修复材料)，也可參照已有文献(如中国专利申请号200910022842. 6)制备。实例中所使用的培养器皿采用医用不锈钢(模压)和聚苯こ 烯(注塑)一次成型制备；规格I :底盒内径为15mm,深为4mm,增高圈深为1_，增高圈2 个；规格2 :底盒内径为20mm,深为2mm,增高圈深为I. 5mm。实施例I、步骤一、天然软骨基质的制备在4°C条件下，将10 200mm3大小的无软骨膜的哺乳动物关节软骨块放入液氮冷冻3小时后，转入预冷的粉碎机中粉碎，将粉碎物溶于体积浓度为I %的醋酸溶液，经真空冻干得到软骨基质；步骤二、钙化层的制备将冻干软骨基质、GAG和X型胶原溶于体积浓度为I %的醋酸溶液中，使终浓度分别为5mg/ml、8mg/ml和5mg/ml,用氢氧化I丐溶液调pH至中性得软骨基质溶液；将煅烧骨粉(粒径O. 2mm)与软骨基质溶液按O. 4g/ml的浓度充分混合，注入培养器皿底盒，使凝胶层厚度4_，加盖后在37°C环境待凝胶溶液凝固后，连同器皿一起置入-80°C环境中冷冻；步骤三、中层的制备将冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原溶于体积浓度为 I %的醋酸溶液中，使终浓度分别为5mg/ml、4mg/ml、2mg/ml和4mg/ml,用氢氧化I丐溶液调 PH至中性，再加入终浓度为5ng/ml的TGF-β，得到支架材料的中层凝胶溶液；将步骤二冷冻的盛有钙化层的培养器皿置于_80°C的不锈钢底板上，在O 10°C的空气环境中，套上两个增高圈，将中层凝胶溶液注入培养器皿内的钙化层表面，该凝胶层厚度为2mm，加盖后待凝胶溶液结冰，转入_80°C环境下冷冻3小时以上；再经低温真空干燥，得到软骨支架材料的中层及钙化层结构；步骤四、表层的制备将冻干软骨基质和II型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中，使浓度分别为lmg/ml和9mg/ml，用氢氧化钠溶液调pH至中性,采用真空旋转涂膜方法将其均匀涂布于经低温真空干燥的中层表面，旋转速度500rpm，时间为50s，晾干后得到组织工程软骨支架材料。本实例制备的组织工程软骨支架材料的钙化层较厚，可用于软骨下骨伴随软骨病变发生部分缺失的软骨缺损修复，加厚的钙化层可深入软骨下骨进行软骨缺损的修复，特别适合于机械损伤造成的软骨缺损修复。实施例2、步骤一、天然软骨基质的制备在4°C条件下，将10 200mm3大小的无软骨膜的哺乳动物关节软骨块放入液氮冷冻3小时后，转入预冷的粉碎机中粉碎，将粉碎物溶于体积浓度为I %的醋酸溶液，经真空冻干得到软骨基质；步骤二、钙化层的制备将冻干软骨基质、GAG和X型胶原溶于体积浓度为I %的醋酸溶液中，使终浓度分别为10mg/ml、9mg/ml和10mg/ml,用氢氧化I丐溶液调pH至中性得软骨基质溶液；将煅烧骨粉(拜阿蒙牌羟基磷灰石骨粉粒径O. Imm)与软骨基质溶液按
O.15g/ml的浓度充分混匀，注入培养器皿底盒，使凝胶层厚度2_，加盖后在37°C条件下待凝胶溶液凝固后，连同器皿一起置入_80°C环境中冷冻；步骤三、中层的制备将冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原溶于体积浓度为 I %的醋酸溶液中，使终浓度分别为8mg/ml、6mg/ml、2mg/ml和8mg/ml,用氢氧化I丐溶液调 PH至中性，再加入终浓度为5ng/ml的TGF-β，得到支架材料的中层凝胶溶液；将步骤二经冷冻的盛有钙化层的培养器皿置于_80°C的不锈钢底板上，在O 10°C的空气环境中，套上增高圈，将中层凝胶溶液注入培养器皿内的钙化层表面，该凝胶层厚度为I. 5mm，加盖后待凝胶溶液结冰，转入_80°C条件下冷冻3小时以上；再经低温真空干燥，得到软骨支架材料的中层及钙化层结构；步骤四、表层的制备将冻干软骨基质和II型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中，使浓度分别为2mg/ml和18mg/ml，用氢氧化钠溶液调pH至中性，再采用真空旋转涂膜
7方法将其均匀涂布于经低温真空干燥的中层表面，旋转速度2000rpm，时间20s，晾干后得到组织工程软骨支架材料。本实例制备的组织工程软骨支架材料的钙化层和中层厚度适中，表层结构致密， 可用于骨性关节炎引起的软骨缺损修复；骨性关节炎通常由表层逐渐向下侵蚀造成软骨缺损，致密的表层结构有利于快速再生致密软骨表层，能防止局部病理环境再次对软骨的侵蚀，快速缓解症状，提高患者生活质量。
权利要求
1.一种组织工程软骨支架材料，其特征在于，由上至下依次为表层、中层和钙化层；其中表层由冻干软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原及TGF-β组成，其基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型胶原及煅烧骨粉组成，钙化层内的纤维在三维空间交错分布。
2.制备权利要求I所述的组织工程软骨支架材料的方法，其特征在于，是将天然软骨基质制备成凝胶，添加GAG、X型胶原及煅烧骨粉后，冻干制备钙化层；将天然软骨基质与 GAG、X型胶原、II型胶原及TGF-β混合后，在钙化层表面进行低温定向结晶，经冷冻干燥后形成中层；将天然软骨基质与II型胶原复合后，采用旋转涂层方法在中层表面制备表层， 晾干后得到组织工程软骨支架材料。
3.根据权利要求I所述的的制备方法，其特征在于，具体步骤包括步骤一、天然软骨基质的制备在4°C条件下，将哺乳动物无软骨膜的关节软骨块放入液氮冷冻3小时后，转入预冷的粉碎机中粉碎，采用体积浓度为I %的醋酸溶液溶解，经真空冻干得到软骨基质；步骤二、钙化层的制备将冻干软骨基质、GAG和X型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中，使终浓度分别为5 12mg/ml、8 15mg/ml和5 10mg/ml,用氢氧化I丐溶液调pH 至中性，得到软骨基质溶液；将粒径O. 05 O. 2mm的煅烧骨粉按O. I O. 5g/ml的量与软骨基质溶液混合均匀，得到凝胶溶液，将其注入培养器皿底盒，使凝胶层厚度为I 4_，加盖后在37°C条件下待凝胶溶液凝固后，连同器皿一起置入_80°C环境中冷冻，形成钙化层；步骤三、中层的制备将冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原溶于体积浓度为1% 的醋酸溶液中，使终浓度分别为5 12mg/ml、4 10mg/ml、2 5mg/ml和4 10mg/ml,用氢氧化钙溶液调PH至中性，再加入终浓度为2 15ng/ml的TGF-β，得到支架材料的中层凝胶溶液；将步骤二冷冻的盛有钙化层的培养器皿置于_80°C的底板上，在O 10°C的空气环境中，将中层凝胶溶液注入培养器皿内的钙化层表面，该凝胶层厚度为I 3mm，加盖后待凝胶溶液结冰，转入-80°C环境下冷冻3小时以上；再经低温真空干燥，得到软骨支架材料的中层与钙化层结构；步骤四、表层的制备将冻干软骨基质和II型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中， 使终浓度分别为I 3mg/ml和9 30mg/ml，用氢氧化钠溶液调pH至中性，采用真空旋转涂膜方法将其均匀涂布于低温真空干燥的中层表面，其旋转速度500 3000rpm，时间20 IOOs,晾干后得到组织工程软骨支架材料。
4.制备权利要求I所述组织工程软骨支架材料的培养器皿，其特征在于，培养器皿由下至上依次为底盒、增高圈及上盖，其相互之间能够密封扣合；底盒的内径为5 30mm，深度为I 10_ ;增高圈深度为I 5_。
全文摘要
一种组织工程软骨支架材料，本发明的软骨支架材料由上至下依次为表层、中层和钙化层；表层由冻干软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原及TGF-β组成，基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型胶原及煅烧骨粉组成，其纤维呈三维交错分布。所制备的软骨支架材料具有软骨修复效果，有利于支架材料植入后与软骨下骨的融合，促进软骨下骨的再生；在复合软骨细胞后，能够用于全层软骨缺损修复，再生的软骨组织具有与天然软骨一致的空间结构和蛋白组分；适于膝关节等负重部位关节软骨的修复，再生抗压强度较大的新生软骨，提高软骨支架表面的耐磨性和抗压能力。
文档编号A61L27/36GK102580156SQ201210088049
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者姚瑶 申请人:陕西博鸿生物科技有限公司