抑制PARP活性的RNAi用于生产治疗癌症的药物的用途的制作方法

专利名称：抑制PARP活性的RNAi用于生产治疗癌症的药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制介导DNA链断裂修复的酶的活性的活性剂用于治疗某些形式的癌症，尤其乳腺癌的用途。
背景技术：
已表明在哺乳动物细胞中，同源重组(HR)在发生在DNA复制叉的损伤修复中起重要的作用(2)。从而，HR缺陷细胞表现为生长迟缓并显示出更高水平的遗传不稳定性。认为人类癌症中由于HR修复的丧失导致的遗传不稳定性明显促进了这些细胞中癌的发展(I)。
响应DNA链的断裂，由聚(ADP-核糖基)化(PARP)对核蛋白质的转录后修饰在 DNA修复、程序性细胞死亡的调节以及基因组稳定性的维持中起着重要的作用。
聚(ADP-核糖)聚合酶(PAPR-I)是哺乳动物细胞中大量存在的一种核蛋白质，它利用NAD+作为底物催化形成聚(ADP-核糖)(PAR)多聚体。一旦发生DNA损伤，PAPR-I迅速结合DNA链断裂(单链或双链)并催化向自身(自修饰)和其他蛋白质加入带负电的 PAR链(综述见[3，4])。认为PAPR-I与DNA链断裂的结合保护DNA损伤被进一步加工，直到通过PAR多聚体导致的积聚的负电荷使PAPR-I从断裂解离(5，6)。
虽然PAPR-I与一些核过程，比如染色质结构的调节、DNA复制、DNA修复和转录有关，但是PAPR-I敲除小鼠却正常发育(7)。从这些小鼠分离的细胞表现为过度重组表型和 SCE水平升高、微核和四倍性的遗传不稳定性(8-10)。通过端粒缩短、染色体融合频率增加和非整倍性也可以在这些PAPR-I敲除小鼠中发生遗传不稳定性(11)，尽管所有这些结果在另一组PARP-I敲除小鼠中不能重复(12)。在前一小鼠敲除中，PAPR-I无效突变挽救了 SCID小鼠中受损的V(D) J重组(13)。这些结果支持Lindahl和同事提出的观点，即PARP-I 有抵抗重组的保护作用(5)。他们提出PARP-I与DNA链断裂结合防止重组机器识别并处理DNA损伤，或者备选地，聚ADP-核糖基化后积累的负电荷排斥邻近重组DNA序列。只有后一模型与PARP-I的自身抑制和显性失活突变体PARP-I的表达、诱导SCE、基因扩增和同源重组相一致(HR[14-18])。
基于PARP抑制剂处理的细胞或者来源于PARP-1或PARP-2敲除小鼠的细胞的研究表明，PARP-I活性的抑制增加细胞对于DNA损伤剂的敏感性，并且抑制链断裂重接 (3，4，8-11，19，20，47)。
PARP-I活性的抑制剂已经与常规抗癌剂如放射疗法和化学疗法联合使用(21)。 抑制剂与甲基化剂、拓扑异构酶毒物及离子化放射联合使用，发现它可以提高这些治疗形式的有效性。然而，我们知道此类治疗导致对非癌细胞或者“健康”细胞的伤害和死亡，并与一些令人讨厌的副作用有关。
因此现在需要一种癌症治疗，其既有效又可以选择性地杀死癌细胞而且不必与放射治疗和化学治疗联合使用。
本发明人令人惊奇地发现，与野生型细胞相比，同源重组(HR)缺陷的细胞对PARP 抑制剂超敏感。这是令人奇的，因为PARP-I敲除小鼠正常生活，说明PARP-I对于生命并不是必需的。从而，不能预期细胞将对PARP抑制敏感。
根据本发明的第一个方面，提供了抑制介导DNA链断裂修复的酶的活性的活性剂用于生产治疗由介导同源重组的基因中遗传缺陷导致的疾病的药物的用途。
另一个方面，本发明提供了治疗哺乳动物(包括人类)中疾病或者状况的方法，所述疾病或状况是由于介导同源重组的基因中的遗传缺陷引起的，所述方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的活性剂，该活性剂抑制介导复制叉中存在的DNA链断裂或其它损伤的修复的酶的活性。
在优选的方面，所述酶是PARP。在更优选的方面，所述活性剂是PARP抑制剂或者对PARP基因特异的RNAi分子。
在进一步优选的方面，所述用途是癌症的治疗。
优选地，所述药物是药物组合物，其由PARP抑制剂和可药用载体或稀释剂组成。
同源重组缺陷肿瘤对PARP-I抑制剂的特异敏感性意味着患者体内正常分裂的细胞将不受治疗的影响。用PARP-I抑制剂治疗同源重组缺陷癌细胞还有一个好处，就是它不必和常规的放射疗法或化学疗法一起施用作为联合疗法，从而避免了与这些常规形式的治疗相关的副作用。
介导同源重组的基因中的遗传缺陷可以是由于编码与同源重组有关的蛋白质的基因中的突变、缺失或有缺陷的表达。
另一方面，本发明还提供了 PARP-I抑制剂用于生产在同源重组缺陷细胞中诱导程序性细胞死亡的药物的用途。
另一方面，本发明提供了在哺乳动物的同源重组缺陷细胞中诱导程序性细胞死亡的方法，该方法包括对该哺乳动物施用治疗有效量的PARP抑制剂。
通过在同源重组缺陷细胞中导致程序性细胞死亡，有可能减小或者停止哺乳动物中肿瘤的生长。
优选地，同源重组缺陷细胞是癌细胞。
同源重组缺陷的癌细胞可以在HR中部分或者完全缺陷。优选地，癌细胞在HR中完全缺陷。
术语“癌”或“肿瘤”包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌。癌还可以包括皮肤癌、肾癌、肝癌、膀胱癌或者脑癌。
待治疗的癌可能是遗传形式的癌症，其中待治疗的患者具有患癌症的家族倾向。 优选地，待治疗的癌症是基因连锁的遗传性癌症。在本发明的优选实施方案中，癌症是基因连锁的遗传性乳腺癌。
在优选的方面，PARP-I抑制剂可用于治疗涉及HR的基因的表达有缺陷的癌细胞的治疗。在同源重组中具有所提出的功能的基因包括XRCCl、ADPRT (PARP-I)、 ADPRTL2 (PARP-2)、CTPS, RPA、RPAU RPA2、RPA3、XPD、ERCCU XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、 RAD51C、RAD5ID、DMCl、XRCC2、XRCC3、BRCAl、BRCA2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NBSI、WRN、BLM、Ku70、Ku80、ATM、ATR、chkl、chk2、FANCA,FANCB、FANCC,FANCDI、FANCD2、FANCE、FANCF, FANCG、RADl、RAD9、FEN-l、Mus81、Emel、DDSl、BARD(综述见(2、3、5、22_28))。
涉及同源重组的基因可以是肿瘤抑制基因。本发明因此提供了肿瘤抑制基因表达缺陷的癌细胞的治疗。优选地，肿瘤抑制基因是BRCAl或BRCA2。
现在在西方国家乳腺癌是妇女中最常见的癌症。某些家庭有很强的乳腺癌诱因， 这常常是因为在BRCAl或BRCA2的一个等位基因中的遗传突变。然而，这些患者仍然保持一个有功能的等位基因。因此，这些患者发育正常并且没有该突变造成的表型结果。但是在一个细胞中，所述功能的等位基因可能丢失，使这个细胞癌变，同时在同源重组中有缺陷。这一步对于肿瘤发生是关键的(I)。
本发明人已经令人惊奇地发现BRCA2缺陷细胞对PARP抑制剂NU1025的细胞毒性的敏感性比野生型细胞强100倍。
从而，在优选方面，本发明提供了 PARP抑制剂用于生产治疗HR缺陷(例如，由于 BRCAl和/或BRCA2表达的损失)的癌细胞的药物的用途。
待治疗的癌细胞可以在BRCAl或BRCA2表达中部分或完全缺陷。BRCAl和BRCA2 突变可以用多路PCR技术、阵列技术(29，30)或者技术人员已知的其他筛选来鉴定。
可用于本发明的PARP抑制剂可以选自PARP-l、PARP-2、PARP-3、PARP-4、端锚聚合酶I或端锚聚合酶2。(综述见31)。在优选实施方案中，可用于本发明的PARP抑制剂是 PARP-I活性的抑制剂。
可用于本发明的PARP-I抑制剂包括苯并咪唑_甲酰胺类、喹唑啉-4-[3H]_酮和异喹啉衍生物(如2-(4-羟基苯基)苯并咪唑-4-甲酰胺(NU1085)、8_羟基-2-甲基喹唑啉-4-[3H]酮(NU1025)、6(5H)菲啶酮、3氨基苯甲酰胺、苯并咪唑-4-甲酰胺(BZ1-6)和三环内酰胺吲哚(TI1-5) [32]。通过设计[33]或者新的FlashPlate测定法[34]可以鉴定 PARP的其他抑制剂。
配制成药物组合物的PARP抑制剂可以以对靶定癌细胞有效而方便的方式施用， 例如，经口、静脉内、肌内、皮内、鼻内、局部途径等施用。可用于该药物组合物的载体或者稀释剂可以包括，但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的组合。
在治疗中或是作为预防剂，活性剂可以作为可注射的组合物，例如作为无菌水性分散体施用于个体。抑制剂可以直接施用于肿瘤，或者可以通过全身施用靶向肿瘤。
抑制剂的治疗有效量是足够实现所希望的效果的量并且可以根据疾病状况的本质和严重性以及抑制剂的效力而变。将理解除了治疗活动性疾病外，不同的浓度还可以用于预防。
对于哺乳动物，特别是人的给药，预计活性剂的日剂量将最多100mg/kg，例如 O. 01mg/kg 到 50mg/kg 体重，通常最多 O. 1,0. 5、I. 0,2. 0,5. 0、10、15、20 或 30mg/kg 体重。 然而，最终，由医生决定所施用的抑制剂的量和施用频率。
使用PARP抑制剂治疗癌细胞的治疗上的优点是仅用很小的剂量就可以达到治疗癌症中的治疗效果，从而减小抑制剂的全身性积累和相关的毒性作用。
本发明的优选方面提供了一种活性剂，它是抑制性RNA(RNAi)分子。
一种特异废除基因功能的技术是通过把双链RNA，也称作抑制性(RNAi)导入细胞，导致与该RNAi分子中包括的序列互补的mRNA的破坏。RNAi分子包含RNA的两条互补链(有义链和反义链)，它们相互退火形成双链RNA分子。RNAi分子通常来自待废除的基因的外显子序列或编码序列。
优选地，所述RNAi分子来源于核酸分子，其包含选自如下的核酸序列
a)如图9、10、11、12、13或14中序列代表的核酸序列或其片段；
b)核酸序列，其与图9、10、11、12、13或14的核酸序列杂交或者编码PARP的基因；
c)核酸序列，其包含在a)和b)中定义的核酸序列由于遗传密码简并性得到的序列。
最近的研究提不来源于编码序列的IOO-IOOObp的RNAi分子是基因表达的有效抑制剂。令人惊奇的是，仅需要几个RNAi分子来阻断基因表达，这暗示着它的机制是催化性的。作用位点似乎在细胞核，因为在细胞的细胞质中几乎检测不到(如果有)RNAi，表明 RNAi分子在mRNA合成或加工期间发挥其作用。
更优选地，所述RNAi分子的长度为10个核苷酸碱基(nb)到lOOOnb。甚至更优选地，所述 RNAi 分子的长度为 10nb、20nb、30nb、40nb、50nb、60nb、70nb、80nb、90nb 或者 IOOnb0甚至更优选地，所述RNAi分子的长度为21nb。
甚至更优选地，所述RNAi分子包含核酸序列aaa age cau ggu gga gua uga (PARP-I)。
甚至更优选地，所述RNAi分子由核酸序列aag acc aau cuc ucc agu uca ac组成(PARP-2)。
甚至更优选地，所述RNAi分子由核酸序列aag acc aac auc gag aac aac组成 (PARP-3)。
RNAi分子可以包含经修饰的核苷酸碱基。
本发明的各个方面的优选特征做必要的修正可用于各个其它方面。
现在仅用举例的方式，参考所附的附图描述本发明，其中
图I是曲线图，其表明HR缺陷细胞对PARP-I的抑制导致的细胞毒性超敏感。中国仓鼠细胞系AA8(野生型)、irsISF(HR缺陷型[4])、CXR3 (与XRCC3互补的irsISF[2])、 V79(野生型)、irsI(HR缺陷型[5])或irsIX2. 2 (与XRCC2互补的irsl[l])暴露于 3-AB(A) ,ISQ(B)或NU1025(C)时的集落生长晕。显示了至少三次实验的平均值(符号)和标准差(条线)。使用集落生长晕测定法；
图2为曲线图，其显示了在wt V79细胞、BRCA2缺陷的VC-8细胞和与功能性BRCA2 基因互补的VC-8细胞(VC-8#13，VC-8+B2)中PARP抑制剂NU1025存在下的细胞生存力；
图3是柱状图，其显示用NU1025孵育72小时后程序性细胞死亡的细胞的百分数；
图4 (a)用 siRNA 转染 48 小时后从 MCF-7 (p53wt)或 MDA-MB-231 (p53mut)乳腺癌细胞分离的蛋白质裂解物的蛋白质印迹分析。(b) siRNA处理的MCF-7细胞的集落生长晕或 (c)暴露于PARP抑制剂NU1025后MDA-MB-231细胞的集落生长晕。显示了至少三次实验的平均值(符号)和标准差(条线)。
图5. BRCA2缺陷细胞不能修复由PARP抑制剂在复制叉处形成的重组损伤。通过脉冲凝胶电泳显示用NU1025(0. ImM)处理24小时后BRCA2完整或缺陷的细胞。2mM羟基脲用作阳性对照。(b)未处理的V-C8+B2细胞和V-C8细胞中γΗ2Αχ转化灶的显示。(c)用NU1025 (10 μ Μ)处理24小时后在V-C8+B2和V-C8细胞中显示的含有Y Η2Αχ转化灶或(c) RAD51转化灶(d)的细胞数。显示了至少三次实验的平均值(符号)和标准差(条线)。 (e)所提出的在BRCA2缺陷细胞中诱导的细胞死亡的模型。
图6. PARP-I而不是PARP-2对于预防重组损伤的形成中是重要的，在BRCA2缺乏时引起细胞死亡。(a)从BRCA2、PARP-1和PARP-2以所示组合处理48小时的SW480SN. 3细胞分离的RNA进行的RT-PCR。(b) BRCA2、PARP-1和PARP-2的48小时耗竭后产克隆细胞存活。显示了至少三次实验的平均值(符号)和标准差(条线)。两个星号和三个星号分别指斯氏t检验中p〈0. 01和p〈0. 001的统计学显著性。(c)用不同siRNA处理的SW480SN. 3 细胞中PARP-I的蛋白质印迹。
图7. (a)未处理的和(b)用胸苷处理的V79细胞(5mM处理24小时)的PAR多聚体的显示。(c)羟基脲(O. 2mM)和胸苷(5mM)处理后含有>10个PARP活性位点的细胞百分数。对每次处理和实验计数至少300个细胞核。(d)用羟基脲(e)或胸苷与Νυ 025(10μΜ) 共处理后V-C8+B2细胞的存活。(f)用MMS、羟基脲(O. 5mM)或者胸苷(IOmM)处理后，通过游离NAD (P) H11的水平测量PARP的活性。描绘了从至少3次实验得到的平均值(符号)和标准差(误差线)。
图8. (a)未处理的V-C8细胞和(b)V_C8+B2细胞中PAR多聚体的显示。(C)未处理的V-C8细胞和V-C8+B2细胞中含有>10个PARP活性位点的细胞百分数的定量(d)未处理的V-C8和V-C8+B2细胞中测量的NAD (P) H水平。3个星号表示在斯氏t检验中p〈0. 001。 (e) 24小时胸苷(5mM)处理后V79细胞中RAD51和PARP活性位点的显示。(f)PARP和HR 在停止的复制叉中的作用的模型。
图9.人 PARP-I 的 cDNA 序列；


图10.人 PARP-2 的 cDNA 序列；
图11.人 PARP-3 的 cDNA 序列；
图12.人端锚聚合酶I的cDNA序列；
图13人端锚聚合酶2的mRNA序列；
图14.人 VPARP 的 mRNA 序列。
材料和方法
PARP抑制剂对HR缺陷细胞XRCC2、XRCC3或BRCA2的细胞
毒性
细胞培养
irsI、irsIX2. I 和 V79-4 细胞系由 John Thacker 赠送[40]，AA8、irsISF 和 CXR3 细胞系由Larry Thompson提供[41]。
VC-8、VC-8+B2、VC-8 # 13 由 Malgorzata Zdzienicka 赠送[42]。该研究中所有的细胞系均在 37C 含 5%C02 的大气下，在用 Dulbecco's modified Eagle’s Medium(DMEM)培养基中生长，培养基中加入10%胎牛血清和青霉素(100U/ml)和硫酸链霉素(100yg/mL)。
毒性测定_集落生长晕测定
在培养皿中铺上500个悬浮在培养基中的细胞，4小时后加入3-AB、ISQ或 NU1025。ISQ和NU1025溶解在DMSO中，在处理培养基中的终浓度是0.2%。7_12天后，当可以观测到细胞集落时，将这些集落固定并用溶于甲醇的亚甲基兰染色(4g/L)染色。随后计数多于50个细胞组成的集落。
程序性细胞死亡实验
将O. 25xl06个细胞加入培养皿中，培养4小时后用NU1025处理。72小时后，细胞用胰酶消化并重悬于含有来自那个样品的任何悬浮细胞的培养基。细胞经离心沉淀和重新悬浮后根据生产商的方案用FITC缀合的膜联蛋白V和碘化丙锭(PI) (ApoTarget, Biosource International)进行程序性细胞死亡分析。通过流式细胞术(Becton-Dickenson FACSort, 488nm激光)分析样品，通过结合FITC缀合的膜联蛋白V的活细胞(PI阴性)的分数确定程序性细胞死亡细胞的百分数。
免疫荧光
将细胞铺在盖玻片上，4小时后如上述处理24小时。处理后，除去培养基，盖玻片用PBS在37°C洗涤并如别处所述的进行固定[2]。用于该研究的一级抗体和稀释液为兔多克隆抗 PAR(Trevigen;l:500);羊多克隆抗 Rad51 (C_20，Santa Cruz ; 1:200);兔多克隆抗Rad51(H-92，Santa Cruz ; 1:1000)。二级抗体为Cy_3缀合的山羊抗兔IgG抗体(Zymed; 1:500), Alexa555 山羊抗兔 F (ab，)2IgG 抗体(Molecular Probes; 1:500), Alexa546 驴抗山羊 IgG 抗体(Molecular Probes; 1:500)和 Alexa488 驴抗山羊 IgG 抗体 (Molecular Probes; 1:500)。抗体用含有3%牛血清白蛋白的PBS稀释。DNA用I μ g/ml To Pro (Molecular Probes)染色。用Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜，使用63X/NA1. 4油浸物镜和488、546和630nm的获取图像。通过焦点最大投影，从相隔0. 50 μ m和I. O μ m切片厚度的光学切片获得图像。图像用Adobe PhotoShop (Abacus公司)处理。每张载玻片上计数至少300个细胞核，并将含有10个以上RAD51转化灶或PARP活性位点的那些细胞核分类为阳性。
PARP活性测定
用水溶性的四唑盐(5mM WST-8)通过它还原成黄色甲If染料来监测NAD(P) H的量[43]。将5000个细胞以至少一式三份铺在96孔板的孔中并在100 μ I正常培养基中37 °C培养4小时。随后加入含有WST-8的CK8缓冲液(Dojindo Molecular Technology, Gaithersburg, USA),用或不用所指出浓度的DNA损伤剂处理。通过每30分钟测量可见吸收(OD45tl)确定嫩0$)!1存在下131'-8的还原。还制备了只含有培养基和CK8缓冲液的培养基空白。NAD (P) H水平的变化可以通过比较含经DNA损伤剂处理的细胞的孔的吸收和仅用DMSO处理的细胞的孔的吸收来计算。或者，在CK8缓冲液中孵育4小时后计算不同细胞系中NAD(P)H的相对水平。
用Halldorsson等人[44]的方法的改进方法(在别处有详细[45])测定通透细胞中NU1025抑制PARP-I活性的能力。简言之300 μ L NU1025处理的通透细胞在26°C与寡核昔酸(终浓度 2. 5 μ g/mL)和 75 μ M NAD+ [32P] NAD (Amersham Pharmacia, Amersham, UK) 孵育，总体积是400 μ L0 5分钟后，加入冰预冷的10%TCA，10%Na Ppi后60分钟以终止反应， 之后用 Whatman GF/C 滤器(LabSales, Maidstone, UK)过滤，用 l%TCAl%NaPPi 冲洗 6 次，让其干燥并测量掺入的放射性来测定PARP-I活性。参考[32P]NAD标准，数据表示为掺入的 pmol NAD/106 个细胞。
脉冲凝胶电泳
将I. 5xl06个细胞铺在IOOmm的培养皿中，贴壁4小时。暴露于药物18小时，之后用胰酶消化细胞。每个1%琼脂糖加样孔(insert)中融解IO6个细胞。如别处描述(8)的孵育这些加样孔，并通过脉冲凝胶电泳24小时分离(BioRad; 120°角度，60到240转换时间，4V/cm)。将凝胶随后用溴化乙锭染色用于分析。
siRNA 处理
购买预先设计好的BRCA2SMART 库和乱序 siRNAs (Dharmacon, Lafayette, CO)。将 10000个细胞接种在6孔板中，并放置过夜，之后用Oligofectamine Reagent (Invitrogen) 根据生产商的使用手册用IOOnM siRNA转染。细胞在正常生长培养基中培养48小时后，用胰酶消化，重新铺板后进行毒性测定。使用针对BRCA2的抗体(Oncogene, Nottingham, UK), 通过用siRNA处理过的蛋白质提取物的蛋白质印迹(如前述[46])来证实BRCA2的抑制。实施例
同源重纟目缺陷细朐对PARP-I抑制有轺敏感件
为了研究HR参与对PARP-I抑制的细胞应答，研究了 PARP-I抑制剂对HR修复缺陷细胞系存活的影响。我们发现HR中缺陷的细胞(即，XRCC3缺陷的irsISF或XRCC2 缺陷的irsl[见表I])对3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的毒性效应非常敏感，对另外两种更有效的PARP-I抑制剂1，5_ 二羟基异喹啉(ISQ; [37])或8-羟基-2-甲基喹唑啉 (NU1025[38, 39])也非常敏感(图I)。irsISF细胞对3_AB、ISQ或NU1025的敏感性可以通过导入含有功能XRCC3基因(CXR3)的粘粒来校正。类似地，irsl细胞对3-AB、ISQ或 NU1025的敏感性可以通过导入含有功能XRCC2基因的粘粒来校正(irslX2. 2)。
BRCA2缺陷的细胞对PARP-I抑制超敏感
研究了在PARP-I的抑制剂存在下BRCA2缺陷细胞(VC8)和野生型细胞(V79Z)的存活。发现VC8细胞对NU1025的毒性效应非常敏感(图2)。VC8细胞的敏感性可以通过在13号染色体(VC8 # 13)上或者过表达载体(VC8+B2)上导入功能BRCA2基因来校正。结果表明对PARP-I抑制剂的敏感性是BRCA2功能丧失的直接的结果。
为了研究是否PARP-I的抑制引发了 BRCA2缺陷中程序性细胞死亡，研究了暴露于 NU102572小时后程序性细胞死亡的水平。发现NU1025仅在VC8细胞中引发程序性细胞死亡，表明BRCA2缺陷细胞中PARP-I活性的丧失引发了这种死亡(图3)。
BRCA2缺陷的乳腺癌细胞对PARP-I抑制超敏感
检查了当耗竭BRCA2时，MCF7(野生型p53)和MDA_MB_231 (突变型p53)乳腺癌细胞系是否表现出对NU1025相似的敏感性。发现只有用BRCA2siRNA混合物耗竭BRCA2时， PARP-I抑制剂才能很大程度的降低MCF7和MDA-MB-231细胞的存活(图4)。这表明BRCA2 耗竭的乳腺癌细胞对PARP抑制剂敏感性，其与p53状态无关。
不存在DNA双链断裂(DSB)佰是存在Y H2Ax时BRCA2缺陷细胞因PARP-I抑制而死亡
已知HR与DNA复制中DSB和其它损伤的修复有关[2]。为了确定BRCA2缺陷细胞的敏感性是否是NU1025处理后不能修复DSM的结果，在用高毒性水平的NU1025处理后，测量V79和V-C8细胞中DSB的积累。发现用从经处理的细胞得到的DNA的脉冲凝胶电泳分析没有检测到DSB (图5A)，说明在HR缺陷细胞中，PARP抑制后积累低水平的DSB或其它重组底物，这引发YH2AX(图5B)。BRCA2缺陷细胞在诱导了这些重组损伤后死亡的原因可能是因为不能修复这些损伤失。为了验证这一说法，测定了 BRCA2缺陷的V-C8细胞和BRCA2互补的细胞响应NU1025形成RAD51转化灶的能力。经NU1025处理后，在V-C8+B2细胞中确实诱导了 RAD51转化灶(在t检验中p〈0. 05时统计学显著的；图OT)。这表明重组的损伤引起这些细胞中重组修复，使这些细胞存活下来。相比，BRCA2缺陷的V-C8细胞对不能响应NU1025形成RAD51转化灶(图OT)，说明没有HR，这将使得重组损伤未被修复并从而导致细胞死亡。PARP-I而不是PARP-2在预防重组损伤形成中是重要的在哺乳动物细胞核中存在着两种主要的PARP =PARP-I和PARP-2。所有报道的PARP抑制剂都能抑制这两种PARP。为了区分哪种PARP造成所述效应，我们通过用SiRNA耗竭人细胞中的PARP-I和/或PARP-2和BRCA2来测试没有PARP-I和/或PARP-2是否导致有毒损害的积累(图6a)。我们发现当从细胞同时耗竭PARP-I和BRCA2时，产克隆细胞存活显著下降(图6b)。耗竭PARP-2和BRCA2对产克隆细胞存活无影响并且耗竭PARP_2、PARP_1和BRCA2不导致额外的毒性。这些结果提示，在人细胞中PARP-I而不是PARP-2负责减轻毒性重组损害。在PARP-I和BRCA2共同耗竭的细胞中克隆化效率仅减小到对照的60%，然而没有HR缺陷的细胞在用PARP抑制剂处理后幸存下来。这可能与siRNA对大量PARP-I蛋白质的不完全耗竭有关(图6c)，这可以足够在一些细胞中保持PARP-I功能。PARP-I受到复制抑制剂活化HR也与停止的复制叉上发生的损伤修复有关，其可能不包括可检测的DSB。为了测试PARP是否在复制叉中有作用，检查了用延缓或者阻止DNA复制叉的试剂(胸苷或羟基脲)处理的细胞中的PARP活化。胸苷消耗细胞的dCTP并减慢复制叉的速度但不导致DSB。羟基脲耗竭几种dNTP并且阻断复制叉，伴随着在复制叉处形成DSB [2]。这两种试剂都能有效地诱导HR[2]。用胸苷或羟基脲处理24小时的V79仓鼠细胞对PAR多聚体染色。这揭示了含有PARP活性位点的细胞数目的显著增加(图7C)。该结果提示在停止的复制叉处PARP的功能。并且还显示用NU1025抑制PARP增强了对V-C8+B2细胞中胸苷或羟基脲的敏感性(图7D，E)。该结果提示PARP活性在停止的复制叉的修复中是重要的或者备选地，它防止具有停止的复制叉的细胞中死亡的诱导。PARP在DNA单链断裂(SSB)处被快速活化，并且吸引DNA修复酶[3_6]。甲基甲磺酸(MMS)导致DNA的烷基化，其通过碱基切除修复得到修复。PARP被这个修复过程中形成的SSB中间产物快速活化，它耗竭NAD (P) H水平(图7F)。我们发现在胸苷或羟基脲处理后，PARP的活化和NAD(P)H水平的降低都慢得多。这种PARP活化的减慢可以通过是胸苷和羟基脲的间接作用和细胞进入细胞周期S期后积累停止的复制叉需要的时间来解释。PARP-I和HR在停丨h的复制叉中具有单独的作用测定了未处理的BRCA2缺陷的V-C8细胞中PARP活性位点的数目。发现和V-C8+B2细胞相比更多V-C8细胞含有PARP活性位点(图8A、B、C)。而且V-C8细胞中游离NAD⑵H水平低于校正的细胞的水平(图8D)，可能是由于增加的PARP活性。重要的是，这些PARP活性位点不与RAD51转化灶重叠(图8E)。此处的结果提示PARP和HR在保护或挽救停止的复制叉方面中具有单独的作用(图8F)。PARP活性的丧失可以通过增加的HR来弥补，而HR的丧失可以通过增加的PARP活性来弥补。然而，这两条通路的同时丧失导致停止的复制叉的积累以至细胞死亡，正如PARP被抑制的BRCA2缺陷细胞一样。如图8F中概述的模型中所示，PARP和HR在停止的复制叉处有互补作用。(i)当遇到DNA模板的障碍物时，复制叉可能停止。另外，由于缺乏dNTPs或其它DNA复制辅因子，复制叉也会暂时停止。(ii)PARP结合停止的复制叉或者其它复制相关的损伤，引发PAR多聚化。所得带负电的PAR多聚体可以通过正常情况下处理复制叉的蛋白质(例如，解离酶)保护停止的复制叉，直到当可以利用dNTPs或其它辅因子时，可以自发恢复复制叉。备选地，PAR多聚体或PARP可以通过其他方式吸引蛋白质来分解复制叉。(iii)在缺乏PARP活性的情况下，HR可以作为修复停止的复制叉的替代途径。该补偿模型解释了在PARP缺陷细胞(即V-C8)中发现的HR和RAD51转化灶的升高的水平3'在在PARP和HR都不存在时，自发复制阻断/损害反而是致命的表I.研究中用到的细胞系的基因型和来源
权利要求
1.聚ADP-核糖聚合酶-I抑制剂用于生产治疗同源重组缺陷癌细胞的药物的用途。
2.根据权利要求I的用途，其中所述聚ADP-核糖聚合酶-I抑制剂选自苯并咪唑_甲酰胺类、喹唑啉-4-[3H]-酮和异喹啉衍生物。
3.根据权利要求2的用途，其中所述聚ADP-核糖聚合酶-I抑制剂选自2-(4-羟基苯基)苯并咪唑-4-甲酰胺、8-羟基-2-甲基喹唑啉-4-[3H]酮、6(5H)菲啶酮、3氨基苯甲酰胺、苯并咪唑-4-甲酰胺类和三环内酰胺吲哚。
4.根据前面权利要求任一项的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞是同源重组中部分缺陷的。
5.根据权利要求I到3任一项的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞是同源重组中完全缺陷的。
6.根据权利要求I到3任一项的用途，其中所述癌细胞在介导同源重组的基因中具有缺陷。
7.权利要求6中要求保护的用途，其中所述缺陷是编码与同源重组有关的蛋白质的基因中的突变。
8.权利要求6中要求保护的用途，其中所述缺陷是编码与同源重组有关的蛋白质的基因的缺失。
9.权利要求6中要求保护的用途，其中所述缺陷存在于编码与同源重组有关的蛋白质的基因的表达中。
10.权利要求6要求保护的用途，其中介导同源重组的基因选自XRCCl、CTPS、RPA、 RPAl、RPA2、RPA3、XPD、ERCCl、XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMCl、XRCC2、 XRCC3、BRCAl、BRCA2、RAD52、RAD54、RAD50、MRElI、NBSU WRN, BLM、Ku70、Ku80、ATM、ATR、 chkI、chk2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCDI、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RADI、RAD9、FEN-1、 Mus81、EmeUDDSl 和 BARD。
11.权利要求I一 3任一项中要求保护的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞选自肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌和前列腺癌的细胞。
12.权利要求I一 3任一项中要求保护的用途，其中所述癌细胞在人体中。
13.权利要求12要求保护的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞是基因连锁的遗传性癌细胞。
14.权利要求13中要求保护的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞是乳腺癌细胞。
15.权利要求I一 3任一项中要求保护的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞是 BRCAl表达缺陷的。
16.权利要求I一 3任一项中要求保护的用途，其中所述同源重组缺陷的癌细胞是 BRCA2表达缺陷的。
17.权利要求15中要求保护的用途，其中所述癌细胞部分缺乏BRCAl表达。
18.权利要求15中要求保护的用途，其中所述癌细胞完全缺乏BRCAl表达。
19.权利要求16中要求保护的用途，其中所述癌细胞部分缺乏BRCA2表达。
20.权利要求16中要求保护的用途，其中所述癌细胞完全缺乏BRCA2表达。
21.权利要求6要求保护的用途，其中介导同源重组的基因是肿瘤抑制基因。
22.权利要求21中要求保护的用途，其中所述肿瘤抑制基因是BRCA1。
23.权利要求21中要求保护的用途，其中所述肿瘤抑制基因是BRCA2。
全文摘要
本发明涉及抑制介导DNA链断裂修复的酶的活性的活性剂的用途，用于生产治疗介导同源重组的基因中缺陷导致的疾病的药物。
文档编号A61K31/5517GK102935230SQ20121033247
公开日2013年2月20日 申请日期2004年7月23日 优先权日2003年7月25日
发明者T·赫勒代 申请人:设菲尔德大学