一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核酸纳米结构载体，包含其的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及它们的制备方法和应用。所述核酸纳米结构是通过DNA折纸技术构建的任意二维和/或三维纳米结构，所述贵金属光敏成分为表面进行DNA修饰的金纳米棒、金纳米壳、表面包银的金纳米棒，金纳米笼中的一种或至少两种的混合物。所述核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物作为光声成像探针不但能够保证其偶联的光声学造影剂的吸收对比增强效果，而且能够显著增加其对于肿瘤的靶向性，使其偶联的贵金属光敏成分在肿瘤组织内部富集，极大的改善普通光声造影剂全身分布或仅停留在肿瘤表面的缺陷。其制备方法工艺简单、成本低且方便易行。
【专利说明】一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于光声成像领域，涉及一种核酸纳米结构载体，包含其的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及它们的制备方法和应用，具体而言，本发明涉及一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体，包含其的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及它们的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的重要疾病。面对全球肿瘤发生率和死亡率的不断攀升，以及目前诊断和治疗方法的局限性，发展高效低毒的诊疗一体化方案已成为迫在眉睫的重大课题。如何有效的运输分子影像试剂进行肿瘤的早期检测和切除术中导航，如何实现检测与治疗一体化，是现今癌症研究中的热点问题。
[0003]物体在周期性变化的光照下，因受热膨胀而产生超声波的现象被称作光声效应(Photoacoustic effect)。利用位于组织体表面的超声探测元件接收该超声信号，依据光声信号重建组织内二维或三维光吸收分布图像，从而进行成像的方法被称为光声成像(Photoacoustic imaging)。光声成像很好的结合了光学和超声成像两种技术的优点，获得了更好的成像深度及分辨率，同时更加安全。该技术将带来更加早期和有效的肿瘤临床检测方法。
[0004]贵金属纳米材料(nobel metal nano-materials)是由其光热转换效应而引起广泛关注的一类光敏造影剂。如金纳米棒(gold nanorods, GNRs)近红外区域具有良好的等离子共振效应(Surface Plasmon Resonance, SPR),而其纵向的等离子共振峰(LSPR)使得金纳米棒很容易被与其LSPR峰波长相近的近红外光诱导而产生热量(Adv Mater, 2012，24 (36):4811-41.);利用其LSPR峰波长相近的双光子激光进行激发则产生明显的双光子荧光(Proc Natl Acad Sci U S A, 2005，102 (44): 15752-6.)和光声信号(Optics Express 2008,16(23):18605-18615 ；Journal of appliedphysics, 2007, 102(6):064701.)，可被用作活体成像的造影剂。
[0005]应用纳米技术发展针对恶性肿瘤的检测系统是有效解决上述问题的关键。自上世纪开始，研究者利用纳米技术对于恶性肿瘤的诊断和治疗进行系统研究。目前已有大量纳米载体成功用于药物运输和抗肿瘤研究与治疗之中，如美国FDA批准的脂质体内包阿霉素(Doxorubicin)和聚乙二醇(PEG)干扰素-a 2a (Pegasys) (Nature Reviews DrugDiscovery, 2010, 9, 615-627 ；Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4, 145 - 160 ；J.DrugTarget.2006，14，301 - 310 ；Nature Review Cancer 2006，6，688 - 701.)。同时利用纳米颗粒装载荧光试剂进行手术导航的临床前研究也有较大进展。虽然基于纳米技术，已有很多运载系统成功应用的先例，但在多模态手术导航探针、集检测和治疗于一体的多功能抗肿瘤探针等研究领域仍然存在许多关键问题尚未解决。此外，当今研究较为充分的纳米粒子药物转运系统，如脂质体和高分子材料，其形状和粒径分布范围较宽，从而影响载体进入细胞的效率；或如金属纳米粒子，虽然粒径和形状容易控制，但在材料上存在潜在生物安全性隐患，妨碍临床研究的进一步应用。综上所述，要更加有效的进行恶性肿瘤的诊断和治疗，急需解决的核心问题之一是如何构建一系列微纳米结构使其满足高效、靶向可控、安全的需要，并以此作为分子影像试剂和药物运输的载体；该载体系统需满足形态和粒径易精确控制、其构成材料的化学结构易修饰进从而易于实现功能化、能够同时装载多种分子影像试剂从而实现多模态成像，能够同时装载治疗药物从而实现多功能、稳定性和生物相容性较好等必要条件。
[0006]生物大分子脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)是自然界各种生命体的遗传信息的载体。结构DNA技术(structural DNA nanotechnology)中，DNA不再作为遗传信息的载体，而是通过预先进行序列设计，作为进一步形成自组装纳米结构的基元。DNA折纸技术(DNA origami)是一种新颖而独特的DNA自组装纳米技术，即利用长的单链核苷酸序列与若干条短的寡核苷酸序列通过碱基互补配对进行杂交形成预先设计的结构，现在被广泛用来从DNA自下而上(Bottom-up)地制作各种纳米尺度的二维和/或三维的DNA图案和形状(Nature, 2006, 440，297-302.)。利用DNA折纸技术构造的纳米结构具有结构可控、易于修饰的特点，利用DNA折纸技术构建小分子抗肿瘤药物载体可作为药物运载领域的新发展方向，有非常广阔的应用前景。
[0007]基于核酸序列的特性进行分析，可发现与传统抗肿瘤药物运输载体相比，核酸纳米结构具有十分明显的优势:1)自组装核酸纳米材料本身是由生物大分子而组成，能够生物降解，具有其他载体不可比拟的良好的生物相容性，研究表明自组装核酸纳米材料没有明显的细胞毒性和免疫原性；2)DNA结构本身依照碱基互补配对原则构造，形成的组装结构具有高度可预测性，随着DNA折纸术和其他自组装技术的发展，通过DNA链的杂交折叠，可以构造出所需要的图形结构，进一步构建复杂可控的纳米级图案和形状，可通过设计合理的DNA探针尺寸，在整体水平满足对肿瘤被动靶向运输；3)DNA纳米结构表面的短链可以用来组装具有分子影像材料，如水溶性量子点、上转换荧光纳米颗粒、磁性纳米颗粒、拉曼染料、金纳米棒等，并且可以精确控制组装材料的种类、数量和空间位置，实现成像试剂的有效运输和多模态成像；4)DNA折纸探针可以通过设计出合理尺寸和形状，用其负载分子影像试剂可以延长其在血液中滞留的半衰期，更好的实现肿瘤被动靶向运输；5)DNA纳米结构的外表面可以使用短链DNA进行杂交，从而在选择的部位进行靶向性功能基团的修饰，如修饰肿瘤细胞表面受体特异性的配体基团或肿瘤微环境靶向基团，增强DNA纳米探针的主动靶向性，更好的实现肿瘤特异性成像；6)DNA载体运输的量子点、上转换荧光纳米颗粒、磁性纳米颗粒、拉曼染料、金纳米棒等可进行活细胞/活体的荧光成像、核磁共振成像、拉曼成像或光声成像，可在细胞水平和活体水平观测探针运载的分布和汇聚，并有望在临床进行肿瘤的早期检测和切除术中导航；7)DNA纳米结构内部可以进行功能化修饰，能够有效装载具有活性的多种抗肿瘤功能成分，从而实现DNA纳米探针的载药功能，进而实现集肿瘤靶向、检测和治疗的多功能诊疗一体化纳米平台。
[0008]核酸纳米结构具有上述优势，同时已有将核酸纳米结构用于抗肿瘤药物载体在细胞水平和动物水平进行肿瘤治疗的报道，但是目前尚无将核酸纳米结构作为光敏剂载体应用于人体或动物肿瘤检测监控治疗的报道。主要是因为以核酸纳米结构作为光敏剂载体构建的分子影像探针在动物水平上的生物分布还缺乏认识。换句话说，目前还没有研究能够证明核酸纳米结构作为贵金属光敏成分的载体是否能够促进光敏成分在肿瘤组织中的富集从而更有效的进行活体光声成像。
[0009]因此，核酸纳米结构作为光敏成分载体的相关研究可克服本领域的技术偏见，并揭示了核酸纳米结构-贵金属光敏造影剂复合物在肿瘤诊断领域的发展趋势。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种核酸纳米结构载体，包含其的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及它们的制备方法和应用，其能够促进光敏成分在肿瘤组织中的富集从而更有效的进行活体光声成像。
[0011]为实现本发明的目的，采用以下技术方案:
[0012]本发明的第一方面在于提供一种核酸纳米结构载体，其具有通过DNA折纸技术(DNA origami)构建的二维和/或三维纳米结构,具体是通过脚手架链(scaffold chains)与辅助折叠的订书钉链(staple strands)进行杂交而自组装形成的核酸纳米结构，所述脚手架链与所述订书钉链通过碱基互补配对原则进行杂交；
[0013]其中所述脚手架链可选自M13噬菌体基因组DNA、基于M13噬菌体基因组DNA进行改造的各种单链环状DNA、Lambda噬菌体基因组DNA、利用点突变技术和位点-延伸非依赖克隆(SLIC)技术从给定质粒大规模生产长度可调的单链环状DNA链、通过PCR得到的M13噬菌体基因组DNA片段、Lambda噬菌体基因组DNA片段和利用体外转录得到的RNA片段中的一种或至少两种的混合物。除此之外，还可使用其它脚手架链，只要其能够满足特定位点上的碱基互补配对，使订书钉链能够辅助脚手架链进行折叠自组装形成核酸纳米结构。优选地，所述脚手架为M13噬菌体基因组DNA。
[0014]所述辅助折叠的订书钉链为人工合成的寡核苷酸序列。其选取5-20个位点延伸出了捕获序列，其捕获序列与后续DNA修饰贵金属纳米光敏成分采用的序列互补。
[0015]由此可见，优选的核酸纳米结构载体为M13噬菌体基因组DNA与人工合成的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行杂交自组装而形成。
[0016]优选地，使用DNA折纸技术将所述核酸纳米结构载体构建成三角形、长方形、纳米管状、四面体、巴基球形、纳米片状、带状或笼状，优选三角形。
[0017]本发明的第二方面在于提供本发明第一方面所述的核酸纳米结构载体的制备方法，其包括以下步骤:将所述订书钉链混合溶液加入到所述脚手架链溶液中，所述脚手架链与所述订书钉链的摩尔比为1:2-50，混匀；以90-1001:为起始温度进行降温退火至15-25 0C，整个过程持续8-28h，制得所述核酸纳米结构载体。
[0018]其中所述脚手架链与所述订书钉链的摩尔比可以是例如1:2、1:3、1:4、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:28、1:32、1:35、1:38、1:40、1:42、1:45、1:48 或 1:49，优选1:5-30，更优选1:10-25，特别优选1:20 ；
[0019]其中所述降温退火的起始温度可以是例如90°C、91V、92 V、93 °C、94 V、95°C、96°C、97°C、98°C、99°C或 100°C，优选 92_98°C，更优选 95°C ；
[0020]其中所述降温退火的终点温度可以是例如15 °C、16 °C、17 °C、18 °C、19 °C、20 V、21°〇、221:、231:、241:或251:，优选 18-22 °C，更优选 20 °C ；
[0021]其中所述降温退火过程的持续时间可以是9h、llh、13h、14h、15h、18h、20h、21h、22h、23h、25h 或 27h，优选 10_26h，更优选 12_24h。
[0022]本发明的第三方面在于提供一种核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物，所述核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物包括贵金属光敏造影剂和如上所述的核酸纳米结构载体；所述贵金属光敏造影剂为表面进行寡核苷酸序列修饰修饰的金纳米棒、金纳米壳、表面包银的金纳米棒,金纳米笼中的一种或至少两种的混合物；所述核酸纳米结构载体与所述贵金属光敏造影剂通过寡核苷酸序列杂交偶联。
[0023]在本发明的一个【具体实施方式】中，通过电泳图证实装载金纳米棒后的核酸纳米结构载体具有清晰的电泳条带。再以电镜照片检测该载体的DNA折纸结构在与贵金属光敏造影剂偶联前后的结构变化，可见核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物形成良好，组装和纯化过程对DNA折纸-金纳米棒复合物没有不利影响。
[0024]所述贵金属光敏造影剂可使用领域内任意已知方法制备。在一个优选的实施方案中，所述贵金属光敏造影剂为表面进行巯基化DNA修饰的金纳米棒。
[0025]本领域的技术人员将会理解，本发明的贵金属光敏造影剂的制备方法并不必然依赖于上述详细工艺及参数，此处给出的仅仅是较优的技术方案。本领域技术人员可以根据其经验制备所需的贵金属光敏造影剂。
[0026]本发明的一个具体实施方案以巯基化DNA修饰的金纳米棒作为贵金属光敏造影齐U，由本发明的核酸纳米结构载体将其运载进入动物细胞及动物体后测量其成像效果。本领域的技术人员能够知晓，现有的贵金属光敏造影剂及以后研发出来的光敏造影剂均可与本发明的核酸纳米结构载体进行偶联制备成复合物，都落入本发明的范围。
[0027]本发明的第四方面在于提供本发明第三方面所述的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0028](I)制备核酸纳米结构载体；
[0029](2)制备贵金属光敏造影剂；
[0030](3)将步骤⑴得到的核酸纳米结构载体与步骤(2)得到的贵金属造影剂按照摩尔比为1:1.5-5混合于溶液中，以梯度循环的方式降温退火；
[0031](4)将步骤(3)得到的溶液进行电泳除去过量的贵金属光敏造影剂，纯化得到核酸纳米结构-光敏造影剂复合物。
[0032]该制备过程为将所述核酸纳米结构载体与所述贵金属光敏造影剂混合，DNA杂交偶联形成所述核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物。其将所述核酸纳米结构载体溶液与所述贵金属光敏造影剂溶液混合，以梯度循环的方式逐渐降温退火；再在一定的电泳条件下分离过量的贵金属光敏造影剂，纯化得到所述核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物。
[0033]步骤(I)中，核酸纳米结构载体的制备方法为根据本发明第二方面的制备方法，例如将M13噬菌体基因组DNA与所述人工合成的寡核苷酸序列按摩尔比1:2-50、优选I: 5-30、更优选1:10-25、特别优选1:20混合于溶液中，以90_100°C，优选92_98°C，更优选950C为初始温度，逐渐降温退火至15-25°C，优选18-22°C，更优选20°C。降温退火过程持续时间为8-28h，优选10-26h，更优选12-24h，得到核酸纳米结构载体；
[0034]步骤(2)中所述贵金属光敏造影剂可通过以下方法制备:利用晶种诱导生长法制备表面CTAB包裹的金纳米棒；使用合成的巯基化寡核苷酸序列取代金棒表面的CTAB，由此完成金纳米棒的DNA表面修饰；或者具体地，通过上文所述的巯基化DNA修饰的金纳米棒的合成和表面修饰方法进行制备；
[0035]步骤(3)中，所述核酸纳米结构载体与所述贵金属造影剂的摩尔比为1:1.5、1:2、1: 3、1: 4、1: 5，优选1:2 ;所述降温退火为从温度40-45°C，逐渐降温退火至温度20_25°C，该降温退火过程为一个循环，共30-60个循环，优选30-45个循环，每。C为一个梯度，每梯度保持 3_5min ；
[0036]步骤⑷中，所述电泳的条件为:0.5-1 %琼脂糖胶、电泳环境温度4-10°C、电泳缓冲液为0.5-1 X TBE缓冲液并含5-1 ImM Mg2+、电泳电压为10_15V/cm、且电泳时间30_50min。
[0037]本发明的第五方面在于提供本发明第一方面所述的核酸纳米结构载体在制备抗肿瘤药物或肿瘤检测金属造影剂中的应用。所述核酸纳米结构载体装载抗肿瘤药物或贵金属光敏造影剂，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。
[0038]本发明的第六方面在于提供本发明第三方面所述的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物在制备活体光声成像造影剂或肿瘤手术导航探针中的应用，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。
[0039]本发明中，“订书钉链”、“寡核苷酸序列”和“短链核苷酸序列”等表示核苷酸片段的术语或短语都意指同样的对象且具有相同的功能，即指通过碱基互补配对原则对脚手架链起到辅助折叠作用以使其自组装形成特定二维和/或三维结构的短的核苷酸序列。所述“订书钉链”是一种形象的表达，意指其像订书钉一样将脚手架链的不同位点钉在一起。“捕获序列”则指在选取5-20订书钉链位点延伸出捕获序列的短DNA序列，其捕获序列与DNA修饰贵金属纳米光敏成分采用的序列互补。
[0040]本发明中，术语“脚手架链”是指长的DNA或RNA序列，尤其是指单链DNA序列，其是形成核酸纳米结构的主体原料，在订书钉链的辅助折叠作用下自组装形成特定二维和/或三维结构。
[0041]本发明中，术语“核酸纳米结构”是指脚手架链在订书钉链的辅助折叠作用下自组装形成的特定二维和/或三维结构。需要说明的是，该名称虽然含有“纳米” 一词，但其实际所指的对象并不一定要限定为纳米级别，本领域的技术人员将会理解，虽然纳米级别的颗粒作为药物载体是常见的，但也有些药物载体能够达到微米的级别，因此，本发明纳米只是一个统称，核酸纳米结构实际上代表纳米或微米级别的具备本发明技术特征的结构。
[0042]本发明中，术语“核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物”是指核酸纳米结构负载相应光敏成分，(在本发明中特指贵金属纳米颗粒)或其活性成分形成的结构复合体。
[0043]本发明的有益效果为:
[0044](I)本发明通过DNA折纸技术，将脚手架链与辅助折叠的订书钉链和捕获链通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成带有捕获序列核酸纳米结构载体，该核酸纳米结构载体可负载贵金属光敏造影剂，实现核酸纳米结构载体与贵金属光敏造影剂的结口 ο
[0045](2)所示核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物具有高灵敏度的光声成像能力，能够作为影像探针，在细胞水平和动物水平的实验证明，该复合物不但能够保证活细胞水平的双光子荧光成像，而且能够在活体水平实现非侵入性和高灵敏性的光声成像能力。
[0046](3)动物水平的光声成像实验证明，核酸纳米结构载体有效的提高贵金属光敏造影剂的被动靶向性，使抗肿瘤药物在肿瘤组织内部明显富集，显著改善单独贵金属光敏成分仅停留在肿瘤组织表面的性质。去氧血红蛋白在注射所述核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂后3h出现大量分布，且分布区域与核酸纳米结构-金纳米棒复合物信号较好的吻合，同时3-24小时后核酸纳米结构-金纳米棒复合物信号在肿瘤组织内部均匀分布。
[0047](4)本发明制备所述核酸纳米结构载体的方法，只需要按照合适的比例将辅助折叠的订书钉链加入到脚手架链溶液中，混匀后，在适宜的温度范围内降温以实现自组装，不需要太多的人为干预，因此工艺简单且方便易行。
[0048]本发明制备的核酸纳米结构载体装载贵金属光敏造影剂可以制成复合物探针，作为成像造影剂和手术导航探针，在肿瘤筛查和手术中用于检测和/或治疗肿瘤。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1为金纳米棒及核酸纳米结构载体-金纳米棒复合物的电泳图。
[0050]图2为三角形的核酸纳米结构载体及核酸纳米结构载体-金纳米棒复合物的电子显微镜照片，标尺为20nm。
[0051]图3为金纳米棒组及核酸纳米结构-金纳米棒复合物组在活细胞中进行双光子荧光成像效果的对比图，20倍油镜观测，标尺为20 μ m。
[0052]图4为贵金属光敏造影剂在活体水平注射后，在不同时间进行光声成像后，材料在移植瘤中汇聚效果图。
[0053]图5为核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物在活体水平注射后，在不同时间进行光声成像后，材料在移植瘤中汇聚效果图。
【具体实施方式】
[0054]下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0055]本发明所用的器材和材料:
[0056]器材:MastercyclerPro 梯度 PCR 仪(Eppendorf,德国)，581R 小型高速离心机(Eppendorf，德国)，UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，透射电镜(Tecnei，日本)，双光子荧光显微镜(Olympus，日本)，小动物光声成像系统(iThera，德国)。
[0057]原料:短链核苷酸序列(订书钉链，Nature, 2006，440，297-302)购自上海英潍捷基生物技术有限公司，M13噬菌体基因组DNA购自New England B1labs公司。CTAB，氯金酸，硼氢化钠，硝酸银等合成金纳米棒的原料购自Sigma-Aldrich公司。
[0058]试剂:实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.0)和PBS缓冲溶液(pH7.4)。其中，ΙΧΤΑΕ/Mg2+缓冲溶液(pH 8.0)的组分为:4Xl(T2mol L^1Tris, 2X 10_2mol Γ1乙酸，2.0Xl(T3mol T1EDTA 和 1.25Xl(T2mol L—1 醋酸镁；I XPBS 缓冲溶液(pH 7.4)的组成为:136.9Xl(T3mol L-1 (8.0Og L’NaCl, 2.68X 10_3mol L-1 (0.20g L-1)KC1，9.75X l(T3molΓ1 (1.56g Γ1) Na2HPO4.H2O 和 1.47 X l(T3mol Γ1 (0.20g Γ1) KH2PO4 ;这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。
[0059]细胞:4T1小鼠乳腺癌细胞系，购自中国协和医科大学基础医学研究所
[0060]培养基:RPMI1640培养基，添加10%胎牛血清，细胞接种于10mm2培养皿中，置于5% CO2培养箱，37°C培养，当细胞生长至融合度80%左右时传代；所用培养基和胎牛血清购自 Life Technology 公司。
[0061]BALB/c裸鼠:购自北京大学医学部。
[0062]实施例1制备核酸纳米结构载体、贵金属光敏造影剂和核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物
[0063]将50 μ L终浓度为5ηΜ的Μ13噬菌体基因组DNA与100 μ L终浓度为50ηΜ的订书钉链及捕获链混合溶液充分混匀在ImL I X TAE/Mg2+(pH = 8.0)溶液中，从95°C开始，逐渐降温退火至20°C，退火孵育时间为12-24h，制备得到具有预先设计几何外形的核酸纳米结构。本实验中所用的三角形DNA折纸是基于Rothemund 2006年的设计进行修改(Nature, 2006, 440, 297-302.)，在 7 个位点延伸出了捕获链(5’-AAAAAAAAAAAAAAA-原始订书钉链序列-3’)，其捕获序列与后续DNA修饰金棒采用的序列互补。
[0064]利用晶种诱导生长法以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为表面活性剂，调控AgNO3浓度制备金纳米棒(Chem Mater, 2003，15(10): 1957-62.)。具体方法如下:
[0065]a)晶种的合成。将7.5mL的浓度为10mM的CTAB加入25mL圆底烧瓶中，加入50yL浓度2% (w/v) HAuCl40在搅拌状态下迅速加入600 μ L浓度为1mM预冷NaBH4，搅拌均匀。待溶液颜色由无色变为土黄色，停止搅拌，28-30°C静置2h备用。
[0066]b)金棒的生长。在25mL圆底烧瓶中加入1mL浓度为10mM的CTAB和80 μ L 2%(w/v) HAuCl40在搅拌条件下，加入75 μ L浓度为1mM AgNO3, 50 μ L浓度为10mM的抗坏血酸和20 μ L晶种溶液。搅拌Imin后，将溶液置于28°C温水浴生长5h。
[0067]c)金纳米棒的纯化。将上述生长溶液加入试管离心(8000rpm,30min),弃上清,将沉于管底的纳米颗粒用超纯水重新分散并再次离心(3000rpm，25min)。弃去沉淀，取上清液再次离心(8000rpm, 30min),将沉于管底的AuNR用100 μ L超纯水重新分散,利用紫外_可见分光光度计检测金纳米棒浓度。
[0068]利用巯基化DNA对于金纳米棒进行表面修饰，具体方法如下:
[0069]巯基化DNA (ACGCTTTTTTTTTTTTTTT-SH, 100 μ Μ)用 TCEP (20mM, 200 倍过量)还原6h，过量TCEP用G-25体积排阻柱离心去除。将纯化后的巯基化DNA(100 μ Μ)加入修饰缓冲液中(含 0.01% (w/v) SDS,89mM Tris, 89mM 硼酸，2mM EDTA, 500mM NaCl，pH 5-6)，在震荡时加入AuNR(100nM，AuNR:DNA = 1:1000)置于28°C温水浴进行修饰。修饰过夜后将修饰了 DNA 的金棒(AuNR-DNA)离心(8000rpm，30min)去除过量 DNA。
[0070]DNA折纸结构与金纳米棒的组装:
[0071]DNA折纸结构经PCR程序控温组装后，利用截留分子量为10kDa离心柱纯化去除过量DNA订书钉链和捕获链。将DNA折纸结构和包覆了 DNA的金棒(AuNR-DNA)以1:1.2-1:5的比例混合，置于PCR中退火杂交，制备金纳米棒-DNA折纸复合物。退火条件为:从45°C -25°C为一个循环，共30个循环，每。C为一个梯度，每梯度保持3min。
[0072]电泳纯化:制备I %琼脂糖胶，将包覆了 DNA的金棒、DNA折纸和DNA折纸-金纳米棒加入胶孔中进行电泳，电泳环境为0.5XTBE缓冲液并含llmMMg2+。电泳结束后在白光下对凝胶进行拍照。在白光下切出目标条带，利用凝胶纯化柱4°C离心浓缩。
[0073]电镜:镀碳支持膜(铜网)经等离子体处理机辉光溅射，将7 μ L纯化后的DNA折纸-金纳米棒复合结构沉积在铜网上，1min后吸弃，用0.7%醋酸双氧铀染色30s。吸弃染色液，待铜网完全干燥后进行透射电镜观测，电压为80kV，高反差模式进行拍照。
[0074]如图1所示，左边第一泳道为巯基化DNA修饰的金纳米棒，右侧四个泳道为DNA折纸-金纳米棒复合结构；琼脂糖胶前沿的条带为DNA修饰的金纳米棒条带，白色虚线框中为目标DNA折纸-金纳米棒复合结构的条带，目标条带之上为复合结构的多聚体。由图1可见装载金纳米棒后的核酸纳米结构具有清晰的电泳条带。如图2所示，左图为DNA折纸纳米结构电镜图，右图为DNA折纸-金纳米棒复合结构电镜图。由图2可见组装金纳米棒前后的三角形DNA折纸结构，可见DNA折纸-金纳米棒复合物形成良好，组装和纯化过程对DNA折纸-金纳米棒复合物没有不利影响。
[0075]实施例2核酸纳米结构-金纳米棒复合物的活细胞摄入
[0076]鼠乳腺癌4T1细胞接种于10mm2培养皿中，利用RPMI1640培养基(10%胎牛血清和双抗)于5% 0)2培养箱，37°C培养。当细胞生长至融合度80%左右，消化细胞，接种于35mm2共聚焦小皿中培养过夜,加入金棒、DNA折纸-金纳米棒复合结构(0.1nM,完全培养基稀释)和对照组孵育24h。吸弃各组药液，用PBS清洗细胞后利用双光子荧光显微镜进行观察，激发波长为800nm。
[0077]观察结果如图3所示，图片从上至下分别为对照组、金纳米棒处理组和DNA折纸-金纳米棒复合结构处理组，从左至右分别为明场成像、双光子荧光成像和双光子通道与细胞膜染料的叠加信号。由图3可得知，核酸纳米结构能够有效运载金纳米棒在活细胞内双光子荧光成像良好；在相同金纳米棒浓度条件下，核酸纳米结构-金纳米棒复合物的细胞摄入效果明显优于单独金纳米棒。该结果展示了核酸纳米结构-金纳米棒复合物在活细胞水平进行成像的能力。
[0078]实施例3核酸纳米结构-金纳米棒复合物的活体光声成像
[0079]培养4T1细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞悬液浓度为I X 17个/mL，取100 μ L原位接种于5-6周雌性BALB/c裸鼠背部皮下，进行皮下乳腺移植瘤建模。建模I周后，当肿瘤大小至100mm3，分为2组进行给药处理，分别为金纳米棒组(3nMX 150 μ L)，核酸纳米结构-金纳米棒复合物组(3nMX 150 μ L)，静脉注射药物。注射后0、3、24h时利用小动物光声成像系统对于荷瘤鼠进行活体光声成像。
[0080]图4所示为注射金棒后0h，3h和24h的荷瘤鼠光声成像结果。由图4可见，利用单独金纳米棒处理后，1-3小时后造影剂已聚集于荷瘤鼠肿瘤区域，去氧血红蛋白在注射后3h出现大量分布,且分布区域与金棒信号较好的吻合；注射后24h仅肿瘤表层具有金棒的光声信号。图5所不为注射DNA折纸-金纳米棒复合结构后Oh, 3h和24h的荷瘤鼠光声成像结果。而由图5可见，与单独金棒类似，核酸纳米结构-金纳米棒复合物处理后，去氧血红蛋白在注射后3h出现大量分布，且分布区域与核酸纳米结构-金纳米棒复合物信号较好的吻合，同时3-24h后核酸纳米结构-金纳米棒复合物信号在肿瘤组织内部均匀分布。该结果进一步证明核酸纳米结构-金纳米棒复合物是一种良好的纳米探针材料，在活细胞内和活体肿瘤内部具有良好的分布，在活体水平能够对于肿瘤组织进行非侵入性、实时的光声成像，有望为进一步开发核酸纳米结构作为肿瘤检测造影剂和切除术导航探针提供基础，具有极大的应用价值。
[0081] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种核酸纳米结构载体，其特征在于，所述核酸纳米结构载体具有通过DNA折纸技术构建的二维和/或三维纳米结构，具体是通过脚手架链与辅助折叠的订书钉链进行杂交而自组装形成的核酸纳米结构；其中所述脚手架链为M13噬菌体基因组DNA、基于M13噬菌体基因组DNA进行改造的各种单链环状DNA、Lambda噬菌体基因组DNA、利用点突变技术和位点-延伸非依赖克隆技术从给定质粒大规模生产长度可调的单链环状DNA链、通过PCR得到的M13噬菌体基因组DNA片段、Lambda噬菌体基因组DNA片段或利用体外转录得到的RNA片段中的一种或至少两种的混合物。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米结构载体，其特征在于，所述脚手架链与所述订书钉链通过碱基互补配对原则进行杂交； 优选地，所述脚手架为M13噬菌体基因组DNA ； 优选地，所述订书钉链为人工合成的寡核苷酸序列； 优选地，使用DNA折纸技术将所述核酸纳米结构载体构建成三角形、长方形、纳米管状、四面体、巴基球形、纳米片状、带状或笼状，优选三角形。
3.根据权利要求1或2所述的核酸纳米结构载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将所述订书钉链混合溶液加入到所述脚手架链溶液中，所述脚手架链与所述订书钉链的摩尔比为1:2-50，混匀；以90-100°C为起始温度进行降温退火至15-25°C，整个过程持续8-28h,制得所述核酸纳米结构载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述脚手架链与所述订书钉链的摩尔比1:5-30，更优选1:10-25，特别优选1:20 ； 优选地，所述降温退火的起始温度为92-98°C，更优选95°C ； 优选地，所述降温退火的终点温度为18-22°C，更优选20°C ； 优选地，所述降温退火过程的持续时间为10-26h，更优选12-24h。
5.—种核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物，其特征在于，所述核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物包括贵金属光敏造影剂和根据权利要求1或2所述的核酸纳米结构载体；所述贵金属光敏造影剂为表面进行寡核苷酸序列修饰的金纳米棒、金纳米壳、表面包银的金纳米棒、金纳米笼中的一种或至少两种的混合物；所述核酸纳米结构载体与所述贵金属光敏造影剂通过寡核苷酸序列相偶联。
6.根据权利要求5所述的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物，其特征在于，所述贵金属光敏造影剂为表面进行巯基化DNA修饰的金纳米棒。
7.根据权利要求5或6所述的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备核酸纳米结构载体； (2)制备贵金属光敏造影剂； (3)将步骤(I)得到的核酸纳米结构载体与步骤(2)得到的贵金属造影剂按照摩尔比为1:1.5-5混合于溶液中，以梯度循环的方式降温退火； (4)将步骤(3)得到的溶液进行电泳除去过量的贵金属光敏造影剂，纯化得到核酸纳米结构-贵金属光敏造影剂复合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，核酸纳米结构载体的制备方法为根据权利要求3或4的制备方法； 优选地，步骤(2)中所述贵金属光敏造影剂通过以下方法制备:利用晶种诱导生长法制备金纳米棒；使用十六烷基三甲基溴化铵CTAB进行修饰；使用合成的巯基化寡核苷酸序列替代CTAB，由此完成金纳米棒的DNA表面修饰； 优选地，步骤(3)中，所述核酸纳米结构载体与所述贵金属造影剂的摩尔比为1:2;所述降温退火为从温度40-45°C，逐渐降温退火至温度20-25°C，此退火降温过程为一个循环，共30-60个循环，优选30-45个循环，每摄氏度。C为一个梯度，每梯度保持3_5min ；优选地，步骤(4)中，所述电泳的条件为:0.5-1%琼脂糖胶、电泳环境温度4-10°C、电泳缓冲液为0.5-1 XTBE缓冲液并含5-llmM Mg2+、电泳电压为10_15V/cm、且电泳时间30_50mino
9.根据权利要求1或2所述的核酸纳米结构载体在制备抗肿瘤药物或肿瘤检测金属造影剂中的应用，其特征在于，所述核酸纳米结构载体装载抗肿瘤药物或贵金属光敏造影剂，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求5或6所述的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物在制备活体光声成像造影剂或肿瘤手术导航探针中的应用，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。
【文档编号】A61K49/00GK104324375SQ201410426106
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】丁宝全, 蒋乔, 苏晓芳, 宋琳琳, 杜洋, 张倩 申请人:国家纳米科学中心, 中国科学院自动化研究所