无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末及制剂，其特征在于所述二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末为无定型晶体形态，纯度大于98%。进一步，本发明提供了无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末及其制剂的制备方法，化学合成的二丁酰环磷腺苷钙粗品溶液，经制备型高压液相色谱进行纯化，浓缩、过滤、冷冻干燥后所得无菌粉末，经X射线粉末衍射及红外吸收光谱验证，为无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末。与市售的混晶形态二丁酰环磷腺苷钙粉针制剂相比，含量更高，稳定性更好。本发明提供的无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末及其制剂用于治疗心绞痛、心肌梗塞、心肌炎、心源性休克、免疫遗传性疾病红斑狼疮和银屑病等心血管疾病。
【专利说明】无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物合成及药物制剂领域，具体为一种无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌 粉末的制备。
【背景技术】
[0002] 二丁酰环磷腺苷钙是一种核苷酸类衍生物，作为G蛋白偶联型受体药物，可同时 激活蛋白激酶A和蛋白激酶C，蛋白激酶是一种别构酶，由两个催化亚基和两个调节亚基 组成，催化亚基具有催化蛋白质(或酶）磷酸化作用。故二丁酰环磷腺苷钙可催化人体内 最基本的生物化学代谢--氧化磷酸化反应和三羧酸循环，使大多数蛋白质和酶类产生活 性，激活人体各种反应，同时产生大量ATP，改善细胞和能量代谢，从而实现其促进神经再 生、转化异常细胞、扩张血管、舒张平滑肌、改善心肌缺血等作用。
[0003]二丁酰环磷腺苷钙是第二信使环磷腺苷（cAMP)的换代产品，由于cAMP不易透过 细胞膜，而且进入细胞内的cAMP很快地被细胞内之磷酸二酯酶水解，故制成磷酸腺苷的衍 生物，环磷酸腺苷双丁酰酯对细胞的渗透性比cAMP强，且能对抗机体内磷酸二酶的破坏作 用，故其作用时间和速度均比cAMP持久和迅速。是新一代细胞功能激活剂，营养与治疗的 结合。
[0004] 二丁酰环磷腺苷钙可以治疗因G蛋白功能失调引起的各种疾病，蛋白功能失调 可以表现为功能增强或下降，导致某些心血管疾病如：心绞痛、心肌梗塞、心肌炎、心源性休 克、免疫遗传性疾病红斑狼疮和银屑病等。
[0005] 中国专利CN103417474A公开了一种含有二丁酰环磷腺苷钙的注射用组合物， 该注射用组合物含有稳定剂〇. 1-1. 〇份，所述稳定剂为氯化钠和/或乳糖，还优选含有支 撑剂1-3份及pH调节剂；该注射用组合物为注射用冻干粉针。其通过采用氯化钠或/和 乳糖作为稳定剂，右旋糖酐或甘露醇为支撑剂，PH值为4. 5-6. 5。但对于一些对糖不耐受的 患者，如糖尿病，或者高血压患者对氯化钠较为敏感，则添加乳糖、氯化钠等佐剂则不适合， 而甘露醇作为速效利尿剂，对于某类患者也有很大的局限。
[0006]中国专利CN 100457770C公开了一种二丁酰环磷腺苷钙的精制方法。通过在粗品 中加入甲醇和丙酮，进行分离纯化，最终得到纯度>98%的二丁酰环磷腺苷钙干粉。较之 市售的现有广品，纯度有了很大提1?。
[0007] 中国专利CN1554358A公开了一种二丁酰环磷腺苷钙制剂及制备方法，涉及一种 注射用二丁酰环磷腺苷钙粉针或水针剂。
[0008]目前，我国仅批准了上海第一生化生产的二丁酰环磷腺苷钙冻干粉针制剂应用于 临床，但文献：《注射用二丁酰环磷腺苷钙致过敏反应1例》中南药学2013年11月第11卷 第11期和文献《二丁酰环磷腺苷钙4视觉异常不良事件调查》海峡药学2013年第25卷第 10期等报道，目前该产品在临床上应用，有过敏反应和致视觉异常等不良反应发生。
【发明内容】
[0009] 上海第一生化生产的二丁酰环磷腺苷钙冻干粉针制剂，是目前市场上唯一获批准 的注射用二丁酰环磷腺苷钙制剂，其所执行的药品标准为《化药地标升国标》第九册108 页，标准号：WS-1000l-(HD-0786) -2002,二丁酰环磷腺苷钙，该标准中所规定的二丁酰环磷 腺苷钙含量范围为"不得少于80.0%"。通过对市场采购的样品进行了含量和杂质检测，遗憾 地发现，市售药物中二丁酰环磷腺苷钙的含量，只有80. 8%。为了探究含量下降的原因，测定 了其中存在的其他组分，有包括〇- -丁酰环磷腺苷钙和N- -丁酰环磷腺苷钙在内的多种 杂质，其中部分为二丁酰环磷腺苷钙的降解产物，相当一部分为合成时的副产物。通过对其 晶型进行了 X-衍射粉末衍射测定，发现其为混合晶体形态。通过重量称重，发现目前销售 的二丁酰环磷腺苷钙冻干粉针制剂的装量与其标示装量完全一致，而且其说明书中也说明 未添加其他物质，说明其冻干制剂与原料一致，可以排除其他添加物质对晶体形态的干扰， 估计可能是晶体形态和残留杂质等因素造成了产品含量的降低。
[0010] 二丁酰环磷腺苷钙粉针制剂在预防和治疗心血管疾病的过程中出现了多种不同 程度的不良反应，包括胃部不适，胸闷、恶心、乏力，全身冷汗，视觉异常及过敏反应。估计可 能与冻干粉针制剂中的大量杂质有关。
[0011] 在实际研究过程中，通过采用新的纯化工艺，得到了一种形态为无定型粉末的二 丁酰环磷腺苷钙，其纯度大于98%，通过对其进行稳定性考察，惊奇的发现这种无定型粉末 与混合晶体状态的二丁酰环磷腺苷钙相比，稳定性更好、杂质含量更低，更重要的是，在应 用于人体后，不良反应显著降低。
[0012] 本发明提供的无定型二丁酰环磷腺苷钙粉末，其X-射线粉末衍射中无特征峰，其 原料及制剂衍射图谱见附图1和附图2。而市售二丁酰环磷腺苷钙制剂为混晶，有若干吸收 峰，具体见附图3。 本发明提供的无定型的二丁酰环磷腺苷钙粉末，是将合成的二丁酰环磷腺苷钙粗品溶 液，经过制备型高压液相色谱纯化，从高压液相中制备的单一组分纯溶液减压浓缩，蒸发有 机试剂，得到无定型二丁酰环磷腺苷钙的高浓度水溶液，经微孔滤膜过滤制成无菌溶液，冷 冻干燥后得到的无菌粉末，此过程在无菌环境中进行操作。
[0013] 本发明制备的无定型二丁酰环磷腺苷钙原料，为无菌粉末，在原料层面，精制阶段 即实现产品的无菌化，减少下游工序的再次溶解、除菌和冻干的冗繁工艺，降低药物降解和 破坏的风险。
[0014] 本发明采用的高压液相方法分离度高，能够将含量较少的细小杂质分离出去，得 到的目标组分纯度高，杂质种类和含量皆大幅降低。
[0015] 无菌原料粉末，在制剂过程进行进一步加工过程，制备成所需要的剂型，如无菌分 装产品。
[0016] 本发明提供的无定型二丁酰环磷腺苷钙粉末，再次溶解后冻干制成冷冻干燥粉 针，所得产品仍为无定型形态。
[0017] 本发明提供的无定型二丁酰环磷腺苷钙粉末，优选为不添加支撑剂，调节剂，赋形 剂等辅料，减少了可能由辅料带来的药物副作用。
[0018] 本发明提供的无定型二丁酰环磷腺苷钙制剂中还可以加入磷酸盐，磷酸氢盐，氨 基酸等作为稳定剂或缓冲剂，如磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钙，甘氨酸，丙 氨酸。在无菌条件下，将无菌辅料与二丁酰环磷腺苷钙混合均匀，分装即可。
[0019] 本发明提供一种高纯度无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末或其制剂的具体制备 方法，如下： (1) 成季铵盐：环磷腺苷与三乙胺水溶液，30-40°C搅拌反应，减压蒸干后加入吡啶，继 续减压蒸干，重复一次，减压蒸干后真空干燥得到环磷腺苷三乙胺盐，为中间体1 ; (2) 酰化：上述环磷腺苷三乙胺盐中加入吡啶和正丁酸酐进行酰化。用适量乙醚洗去 正丁酸及未反应的酸酐，2-3倍体积水进行提取，重复二到三次，得到的二丁酰环磷腺苷三 乙胺盐水溶液减压浓缩至干，得中间体2; (3) 成钙盐：上述中间体2,加入等当量的氯化钙在乙醇水溶液中进行成盐反应，得到 二丁酰环磷腺苷钙粗品，为中间体3; (4) 高压液相制备：中间体3加水成水溶液，活性炭吸附脱炭后0.45 μ m微孔滤膜过滤， 经过制备型高压液相色谱纯化，收集目标组分； (5) 无菌：上述目标组分洗脱液经减压浓缩，0. 45 μ m滤膜过滤，0. 22 μ m微孔滤膜得到 无菌的二丁酰环磷腺苷钙浓溶液； (6) 冷冻干燥：上述无菌浓溶液经冷冻干燥后，得到无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌干 粉，经X射线粉末衍射测定验证其为无定型晶体； 步骤（4)- (6)在无菌环境下操作。
[0020] 本发明技术方案优势在于： (1)得到的二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末为无定型固体形态，经过稳定性加速试验和长 期试验表明，本发明制备的无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末终含量超过98%，而市售仅 80%左右。本发明无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末相较于市售原料及制剂，纯度和稳定性 明显提商。
[0021] (2)原料经高压液相法纯化，分离度高，能够将含量较少的细小杂质分离出去，得 到的目标组分为无定型形态，纯度高，杂质含量低，经过12个月长期放置和6个月加速试 验，无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末杂质含量不超过1%，降低后续反应中杂质含量升高 风险和副作用风险。
[0022] (3)无菌原料：在上游原料阶段对产品纯度进行控制，并实施无菌化和无菌条件操 作，节约工艺步骤，避免了目标产物的更多降解。
[0023] 本发明提供的无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末用于治疗或辅助治疗心血管疾 病，如：心绞痛、心肌梗塞、心肌炎、心源性休克、免疫遗传性疾病红斑狼疮和银屑病等疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 1.附图1为自制无定型二丁酰环磷腺苷钙精制原料粉末X-射线粉末衍射图谱； 2. 附图2为自制无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末制剂X-射线粉末衍射图谱； 3. 附图3为市售二丁酰环磷腺苷钙冻干粉针X-射线粉末衍射图谱； 4. 附图4为自制无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末红外光谱图； 5. 附图5为自制无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末核磁共振谱图； 6. 附图6为自制无定形二丁酰环磷腺苷钙粉末差热分析（DSC)谱图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例I 无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末的制备 (1) 200. Og环磷腺苷中，加入三乙胺水（1:5, v/v)溶液，30-40°C条件下搅拌，减压蒸干 后加入吡啶1000ml，重复一次，真空减压干燥得到中间体1，检测中间体含量。
[0026] (2)取250. Og上述中间体1中加入10-15倍体积的吡啶和5-10倍体积的正丁酸 酐进行酰化，30-35°C搅拌。用适量乙醚低温条件下吸取酸酐，2-3倍体积水进行萃取，重 复二到三次，得到的二丁酰环磷腺苷三乙胺盐水溶液减压浓缩至干，得中间体2 ; (3) 上述中间体2用3-5倍（m/v)乙醇溶液使溶解，加入等当量的氯化钙乙醇水溶液， 搅拌，减压浓缩至干；用乙醇溶解，冰浴下流加乙醚，过滤，滤饼真空减压干燥，得到二丁酰 环磷腺苷钙粗品，为中间体3 ; (4) 高压液相制备：中间体3加10-20倍水成溶液，搅拌溶解后，加入活性炭吸附后经 0. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液经制备型高压液相色谱纯化，色谱柱填充剂为十八烷基键合硅 胶，流动相为乙腈-7K，检测波长273nm，梯度洗脱，，收集目标组分； (5) 过滤除菌：高压液相流出的目标组分洗脱液经减压浓缩，依次经0. 45um和0. 22um 微孔滤膜两次过滤得到无菌的二丁酰环磷腺苷钙浓溶液； (6) 冷冻干燥：上述无菌浓溶液经冷冻干燥，冷冻干燥条件为：-l(TC，3h，-40°C，8h，抽 空，40°C，28h，40°C恒温，5h，得到无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末； 步骤（4)- (6)在无菌环境下操作。
[0027] 纯度：99· 5% ;检测方法：高效液相色谱法。
[0028] 实施例2无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末制剂 将上述实施例制备的二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末在无菌环境下分装如西林瓶，20mg/ 瓶。
[0029] 按照中国药典2010版第二部附录I B项下注射用无菌粉末检查项对上述产品进 行检查，连续三批。检查指标为可见异物，不溶性微粒，无菌检查，细菌内毒素，皆符合药典 规定。
[0030] 实施例3无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末制剂 实施例1制备的无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末，备用； 甘氨酸精制：首先将粗甘氨酸溶解在热水中，加入粉状活性炭吸附脱色，再经过滤分离 活性炭； 无菌环境下，上述溶液分别过0. 45 μ m，0. 22 μ m微孔滤膜，滤液加热浓缩，当浓缩液体 积为原先体积的二分之一时，冷却至室温，再加入3-4倍体积的无菌乙醇或甲醇使甘氨酸 结晶析出，烘干，得到无菌精制甘氨酸； 无菌环境下，按照处方混合无定型二丁酰环磷腺苷钙和甘氨酸，分装。
[0031] 实施例4无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末制剂 处方：无定型二丁酰环磷腺苷钙20g，磷酸二氢钠6. Ig，磷酸氢二钠7. lg。
[0032] 制备：精制的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠无菌粉末，与自制无定型二丁酰环磷腺苷 隹丐在无菌条件下混合均勻，分装1000份。
[0033] 实施例5晶型和结构确证 1、X-射线粉末衍射检测结果见附图1，结果显示自制二丁酰环磷腺苷钙原料为无定型 粉末。
[0034] 2、差示扫描量热法 仪器：日本岛津DSC-60型差示扫描量热仪 参数设置：起始温度30°C;升温速率KTC/min ;终止温度300°C;氛围：氮气，30ml/ min〇
[0035] 测试结果：供试品在280°C有放热峰。
[0036] 3、核磁共振 仪器：Bruker AVANCE-600型核磁共振仪 溶剂：D20 内标：TMS 本发明无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末特征峰=(1HNMR) δ 〇. 99(3H，t)、δ I. 〇2(3H， t)、Sl.70 (2Η，πι)、δ1·79 (2Η，πι)、δ2·57 (2Η，πι)、δ2·61 (2H，t)、S4.40 (2H，m)、4.54 (2H，d)、δ 5· 21 (1H，t)、δ 5· 73 (1H，d)、δ 6· 38 (1H，s)、δ 8· 48 (1H，s)和 δ 8· 69 (1H， s)。
[0037] 4、红外吸收 仪器：瑞士 Bruker IFS55付立叶变换红外分光光度计。
[0038] 仪器的校正及检定：按中国药典2010年版二部附录IV C红外分光光度法项下规定 进行仪器校正和检定，结果符合要求。
[0039] 样品制备方法：KBr压片。
[0040] 1705 (Vc=〇 -COCT)，1329 (Vc_。-CO(T)，1746 (Vc=〇-C=O)，1524(δ_丽-C00NH-)， 3418(νΝ_Η ΝΗ)，2965、2877、1463、1384( vCH -CH3)，2920、2851 ( vCH -CH3 CH2), 1611、1589 (vc=CvC=N〇)，n〇〇 ( v-C-〇-C -C〇〇-)，1252 ( vp=。=P=〇)、l〇24 ( vp=〇=c =p=〇=c)。
[0041] 实施例6 长期稳定性和加速试验 为了考察本发明技术方案的有益效果，我们按照中国专利CN 1554358A里描述的详细 步骤，制备三批二丁酰环磷腺苷钙冻干粉针，同时以市售上海第一生化药业有限公司生产 的二丁酰环磷腺苷钙注射粉针作为对照，本发明技术方案(按照实施例2)制备的无菌粉末 连续制备三批，以上三组分别为对照专利组、市售对照组和自制组。
[0042] 考察指标：组分含量，杂质含量。
[0043]含量（％)=样品峰面积/对照峰面积*对照品取样量/对照品稀释倍数*样品稀 释倍数*对照品含量/标示量*100/5 总杂含量（％) =杂质峰面积总和/自身对照峰面积*1 加速试验：将各组模拟上市包装样品，置温度25±2°C、相对湿度为60%± 10%的恒温箱 中放置6个月，于0、1、2、3、6月末取样测定，与0月对比。结果如下： 表1三种二丁酰环磷腺苷钙制剂加速试验对比考察结果
【权利要求】
1. 一种高纯度的二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末，其特征在于：所述无菌粉末为无定型固 体形态，其纯度大于98%，所述无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末，其原料及制剂的X射线 粉末衍射图如附图1和附图2所示。
2. 权利要求1所述无菌粉末，其特征在于：原料经制备型高压液相法纯化。
3. 权利要求1或2所述无菌粉末，其特征在于：高压液相纯化制备的二丁酰环磷腺苷 钙水溶液经微孔滤膜过滤除菌，进一步冷冻干燥，得到无定型二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末。
4. 权利要求1或2所述的无菌粉末，其除菌和冷冻干燥过程在无菌环境下操作。
5. 权利要求1或2所述的无菌粉末，经过无菌分装得到二丁酰环磷腺苷钙无菌粉末制 剂。
6. 权利要求1或2所述的无菌粉末，其特征在于：不添加辅料。
7. 权利要求1或2所述的无菌粉末，其特征在于：包含选自磷酸二氢钾，磷酸二氢钠， 磷酸氢二钠，磷酸钙，甘氨酸，丙氨酸中的一种或多种辅料。
8. 权利要求1-7任一权利要求所述的无菌粉末在制备治疗心血管疾病，如：心绞痛、心 肌梗塞、心肌炎、心源性休克、免疫遗传性疾病红斑狼疮和银屑病药物中的应用。
【文档编号】A61P9/10GK104262436SQ201410481945
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】关屹, 闫冬 申请人:北京赛盟医药科技发展有限公司, 关屹