一种rgd修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：温和还原法制备PEI包覆的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒；USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面修饰异硫氰酸荧光素(FI)和PEG化的RGD复合物(COOH-PEG-RGD)，以及纳米颗粒表面的乙酰化处理。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒粒径较小、弛豫率很高，并且具有良好的胶体稳定性、生物相容性和特定的αvβ3整合素高表达肿瘤细胞的靶向性，在体内肿瘤靶向MR成像诊断领域具有潜在的应用价值。
【专利说明】一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核磁共振成像造影剂的制备领域，特别涉及一种RGD修饰的超小型超 顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒在生物医学领域有着越来越广泛的应用， 特别是用作核磁共振成像（MRI)的造影剂。本课题组已通过简易的水热合成法制备了两种 不同表面修饰的四氧化三铁纳米颗粒，并探索了其在MR成像诊断中应用的可行性（沈明 武，蔡红东，史向阳。一种APTS修饰的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。专利号：ZL2011 1 0104443.l;Caietal·，ACSAppl.Mater.Interfaces2013, 5 (5) ,1722 - 1731 ;37·史 向阳，蔡红东，沈明武。一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。中国发明专 利，申请号=201210277624. 9, 申请日期:：2012-08-07)。这些制备的四氧化三铁纳米颗粒 的弛豫率在SO-Ieomr1iT1之间，为了减少造影剂的剂量并达到灵敏检测的目的，制备具有 更高弛豫率的四氧化三铁纳米颗粒就显得尤为有意义。在另一个研究工作中，通过温和还 原法制备出超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒（USPIO)，其尺寸较小，并且表现出很高的弛豫 率，在体内特定肿瘤的靶向MR成像诊断领域有着潜在的应用（沈明武，李静超，胡勇，孙文 杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号： 2014101828211， 申请日期:：2014-04-30)。
[0003] 检索国内外文献，尚没有发现关于用还原法制备具有超高弛豫率的RGD特异靶向 能力的USPIO纳米探针用于体外和体内脑胶质瘤模型的靶向MR成像诊断研究的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，该方法工 艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；制备的USPIO磁性纳米颗粒能够长时间稳定 地分散于水溶液中，不会出现团聚现象；所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产 业化实施的前景。
[0005]本发明的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：
[0006] (1)将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30?40 分钟；然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3 ·H20,60?70°C下恒温搅拌反应 30?40分钟；然后在室温下反应1. 5?3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得 PEI包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI.NH2 ;
[0007] (2)将步骤（1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于 DMSO中；再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1?2天，磁 分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒；
[0008] (3)将6-(马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEg-NH2混合于DMSO 溶液中，搅拌反应10?12小时，得到C00H-PEG-6-M ;然后再将充分溶解于DMSO中的端基 为巯基的RGDSH-RGD逐滴加入到C00H-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1?2天，透析， 真空冷冻干燥，即得到C00H-PEG-RGD;
[0009] (4)将步骤（3)中制备的C00H-PEG-RGD与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化 2?4h;将步骤⑵中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO 中，然后加入活化的C00H-PEG-RGD溶液，搅拌反应2?4天，磁分离洗涤并分散于水中，得 至IjUSPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGd纳米颗粒；
[0010] (5)向步骤⑷中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-R⑶纳米颗粒水溶液中加入三乙 胺，并搅拌20?40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20?30小时，磁分离洗涤并分散 于超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶。
[0011] 所述步骤⑴中的三价铁盐为FeCl3 · 6H20 ;三价铁盐、超纯水、NH3 ·H2O的配比为 L2?L4g:20?25mL:2?3mL，三价盐、亚硫酸钠、PEI的质量比为L2?L4:0. 20? 0. 25:0. 51 ?0. 53。
[0012] 所述步骤（1)中的NH3 ·H2O质量百分比浓度为25?28%。
[0013] 所述步骤（1)中的超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。
[0014] 所述步骤⑵中FI与USPIO/PEI.NH2表面氨基的摩尔比为1:39?40,优选1:40。
[0015] 所述步骤⑶中RGD、6-M和PEG的摩尔比为I: I. 0?L 2:1. 0?L 2,优选 1:1. 2:1。
[0016] 所述步骤（3)中NH2-PEg-COOH的分子量为2000。
[0017] 所述步骤⑷中的C00H-PEG-RGD与EDC、NHS的摩尔比为1:8?10:8?10,优选 1:10:10。
[0018] 所述步骤（4)中的C00H-PEG-RGD与USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒表面氨基的摩尔 比为1:23?25,优选1:24。
[0019] 所述步骤（5)中的三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-R⑶纳米颗粒表面的 PEI上的伯氨基摩尔比为8?10:10?12:1，优选10:12:1。
[0020] 本发明合成了一种基于RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒。为了克服裸露 USPIO普遍存在的磁学特性导致的聚集现象，并提高其在生物医学成像领域的可应用性，在 反应过程中加入聚乙烯亚胺（PEI)用于介导USPIO的合成，从而实现简易"一步"还原法 制备了胶体稳定性良好的PEI包覆的USPI0(USPI0/PEI.NH2)。为了使制备的该种USPIO/ PELNH2能有效地应用到生物体内，在其表面接上异硫氰酸荧光素（FI)用于纳米颗粒的 示踪和荧光成像；为实现特定肿瘤部位的成像检测，在其表面修饰聚乙二醇-RGD复合物 (Polyethyleneglycol-RGD，C00H_PEG-RGD);最后通过乙酰化中和PEI表面剩余的氨基， 降低纳米颗粒的表面电势，从而进一步提高其生物相容性。此外，实验数据表明，制备的 USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶和对照材料USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒均有很显著 的T2加权成像效果，其r2弛豫率分别高达550. (MmT1iT1和545.TOmT1s'最后以ανβ3整 合素高表达的U87MG细胞（一种脑胶质瘤细胞）为模型细胞和移植瘤模型对制备的两种多 功能纳米探针的性质进行一一评价。本发明制备的USPIO纳米探针在生物医学方面表现出 良好特性，特别是超高的r2弛豫率，有望实现在不同疾病系统的准确和灵敏诊断，为USPIO 纳米探针用作临床造影剂提供可靠的依据。
[0021] 本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的分散性、胶体 稳定性和生物相容性。与非靶向材料USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒相比，R⑶修饰的USPIO纳米颗粒使得肿瘤细胞或肿瘤部位信号更低，表明其具有更高的靶向性。从而说明该 方法制备的RGD修饰的USPIO纳米颗粒在MR分子影像诊断领域有着潜在的应用。
[0022]本发明使用X-射线衍射（XRD)、紫外可见吸收光谱（UV-Vis)、热重分析（TGA)、电 感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射（DLS)和透射电子显 微镜（TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过磁共振成像仪测定纳米颗粒的T2弛豫 性能，然后利用MTT法评价纳米颗粒的细胞毒性，再利用流式细胞仪、共聚焦显微成像以及 体外和体内核磁共振成像实验检测RGD修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。具体 测试结果如下：
[0023] (I)X-射线衍射（XRD)测试结果
[0024] 通过对比和分析X-射线衍射图谱，还原法合成的USPIO/PEI.NH2 (图la)和裸的 USPIO(图Ib)纳米颗粒与Fe3O4图谱（ICSD20-596) -致，表明PEI修饰的USPIO晶体结 构为四氧化三铁。由于PEI的修饰，使得USPIO/PEI.NH2纳米颗粒的X-射线衍射图谱在 22. 5°左右出现的较宽的峰。
[0025] (2)紫外吸收（UV-Vis)测试结果
[0026] 图 2 所示为USPIO/PEI.NH2 和USPIO/PEI.NH2-FI在 300 到 800nm的紫外吸收图 谱。从图中可以看出，USPIO/PEI.NH2在400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而USPIO/ PEI.NH2-FI在500nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到USPIO/PEI.NH2 纳米颗粒表面。
[0027] (3)核磁共振分析（1HWR)测试结果
[0028] 将合成的PEG-RGD溶于氘代DMSO中进行核磁共振分析（1HNMR)。如图3所示， 7. 3和7. 4ppm处出现明显的谱峰，证明RGD已成功连接到PEG上，并通过峰面积积分可知， 每一个PEG上连接0. 5个R⑶。
[0029] (4)热重分析（TGA)测试结果
[0030] 为了检测PEG-R⑶和mPEG在USPIO纳米颗粒表面的上载量，对修饰前后的纳米颗 粒进行了TGA测试。由图4可以看出，USPIO/PEI.NH2-FI在温度升至700°C时，重量为原来 的87. 65%，经过计算，PEI和FI的总上载率为12. 35%;修饰后，USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG和 USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-R⑶的失重分别是 15. 68%和 16. 35%，经过计算，mPEG和PEG-RGD 上载率3. 33 %和4. 00 %，由此表明mPEG和PEG-R⑶均已成功连接到USPIO纳米颗粒的表 面。
[0031] (5)电势和水动力粒径测试结果
[0032] 电势结果显示乙酰化后USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的表面电势是+26. 4mV和+28. 3mV;其分散于水中后的水动力粒 径分别是127. 3nm和146. 5nm(表1)。
[0033] (6)透射电子显微镜（TEM)测试结果
[0034] 通过TEM观察本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒的形态和尺寸（如图5)。TEM测试结果显示USPIO/PEI. NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒的形貌均是球形或准球形。分别 随机测量300个纳米颗粒的直径，计算得到本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD和 USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒的直径分别是 9.I±I. 9nm和 9. 0±I. 7nm。
[0035] (7)弛豫率测量结果
[0036] r2弛豫率反映USPIO纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的横向 弛豫时间（T2),可通过不同浓度下的T2的倒数拟合计算得到。图6为本发明制备的USPIO/ PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的T2 弛豫时间倒数与Fe浓 度的线性拟合图，可以看出两种USPIO纳米探针的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加（在 0.003-0. 048mM浓度范围内）具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的两种 探针的r2弛豫率分别高达545. 70πιΜ?和550. (MmT1S'因此，本发明所制备的USPIO/ PELNHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒均可作为MR成像的优良T2信 号衰减造影剂。
[0037] (8)MTT细胞活力测试结果
[0038] 通过MTT比色法测定U87MG细胞的活力来检测本发明制备的USPIO/PEI. NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒的细胞相容性（如图7)。U87MG细 胞分别与两种纳米颗粒$6浓度分别为0、10、25、50、75和1001^/11^)在371：下共培养24 小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力。不同浓度 的两种材料对细胞增殖的影响以PBS缓冲液处理的细胞为对照进行比较。与PBS对照组相 t匕，在Fe的实验浓度为 0 到 100μg/mL范围内，USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒对U87MG细胞的存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均 在80%以上。这充分说明两种纳米探针具有良好的细胞相容性，可以应用到细胞水平或生 物体内MR成像诊断。
[0039] (9)流式细胞仪检测结果
[0040] 通过流式细胞仪检测U87MG细胞对本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和 USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒在不同Fe浓度下的吞噬量和处理后细胞的平均 荧光强度（如图8)来检测RGD靶向性效果。两种纳米颗粒分别与U87MG细胞（Fe浓 度为0. 125、0. 25、0. 50、1. 00和I. 50mM)在37°C下共培养4小时，然后通过流式细胞仪 检测细胞的平均荧光强度。如图8所示，在Fe浓度0. 125-1. 50mM范围内，USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒培养的U87MG细胞的平均荧光强度明显高于USPIO/PEI. NHAc-FI-mPEG纳米颗粒培养的U87MG细胞的平均荧光强度。结果表明，RGD的修饰使得 USPIO纳米颗粒对U87MG细胞有特异靶向能力。
[0041] (10)共聚焦显微镜检测结果
[0042] R⑶修饰的USPIO纳米颗粒的靶向性同样也通过共聚焦显微镜来验证。如图9所 示,PBS、本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD 纳米颗粒分别与U87MG细胞在37°C下共培养4小时，然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒 后的荧光信号。从图9可以看出，经过PBS处理的细胞内没有荧光（9a);经过USPIO/PEI. NHAc-FI-mPEG纳米颗粒处理后的U87MG细胞内显示出非常微弱的荧光信号（9b);而经过 USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD处理后的U87MG细胞内显示出很强的荧光信号（9c)，这进一 步说明RGD修饰的USPIO纳米颗粒对U87MG细胞有更好的靶向性。
[0043] (11)体外细胞MR成像结果
[0044] 在体内实验之前，评价了本发明制备的USP10/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒和 USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒的细胞MR成像效果（如图10)。U87MG细胞分别与USPI0/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPI0/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒（Fe浓度为（λ1、0· 2、 0. 3和0. 4mM)在37°C下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。从图IOa中可 以看出，随着Fe浓度的增加，USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳 米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米 颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD 纳米颗粒处理后的U87MG细胞比USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG处理的U87MG细胞的MRI信号 降低更明显，说明ανβ3整合素高表达的U87MG细胞对USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米 颗粒的吞噬量要大大高于对USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG的吞噬量。图IOb是细胞经过不同 浓度的纳米颗粒处理后的MRI信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信 号值均逐渐减少，而且在相同的Fe浓度下，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒处理的 U87MG细胞的MRI信号值要明显低于USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-mPEG纳米颗粒处理的U87MG 细胞的MRI信号值。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MR成像效果，而且 证明了USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒对U87MG细胞的特异靶向性。
[0045] (12)体内肿瘤MR成像结果
[0046] 两组裸鼠分别直接尾静脉注射本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(如图 11a)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(如图lib)(Fe的质量为 600μg，0.ImL)纳米颗粒PBS 溶液，用临床核磁共振体系（3. 0T)评价肿瘤部位（*)的MR成像效果。与注射前的对照组 相比较，在注射0. 5小时后，两组裸鼠肿瘤部位均开始变暗，1个小时后达到最暗。在注射 2小时后，两个实验组的裸鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液循 环已经从肿瘤部位逐渐代谢出去（图11a，lib)。图Ilc是相应注射时间的肿瘤MRI信号 值变化，在注射0. 5小时后，两组裸鼠肿瘤部位的信号值均降低，1个小时后信号值后达到 最低。在注射2小时后，两组裸鼠肿瘤部位MRI信号值均有所增加，这与图IlaUlb的结 果一致。值得一提的是，图11a，Ilb和图Ilc均表明：随着时间的推移，注射USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-R⑶的裸鼠肿瘤MRI信号强度一直低于注射USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-mPEG的 裸鼠肿瘤MRI信号强度。这些结果说明本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗 粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MR肿瘤成像诊断。
[0047] 有益效果
[0048] (1)本发明采用简单的还原法制备水溶性良好的PEI包覆的USPIO纳米颗粒，然后 在纳米颗粒表面先后连接荧光素FI分子和mPEG-C00H或C00H-PEG-RGD，最后对纳米颗粒的 表面氨基进行乙酰化处理，即得到用于MR成像的多功能USPIO纳米颗粒；此法操作工艺简 单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的 前景；（2)本发明制备的USPIO纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚 现象。PEI的包覆增加了USPIO纳米颗粒的稳定性，mPEG-C00H或C00H-PEG-R⑶的表面修 饰增加了USPIO纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且C00H-PEG-R⑶的表面修饰赋予纳米 颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的特异性靶向能力。这些优点使制备的RGD修饰的USPIO纳 米颗粒可以有效地用作体内靶向MR成像的阴性造影剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1是本发明制备的USPIO/PEI.NH2 (a)和USPIO(b)纳米颗粒的X-射线衍射图；
[0050] 图2是本发明制备的USPIO/PEI.NH2(a)和USPIO/PEI.NH2-FI(b)的紫外吸收图 谱；
[0051] 图3是COOH-PEG-R⑶核磁共振分析（1HNMR)图；
[0052] 图 4 是本发明制备的USPIO/PEI.NH2-FI(a)、USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG(b)和
[0053] USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGd(C)的热重分析图；
[0054] 图 5 是本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(a，c)和USPIO/PEI. NHAc-FI-mPEG(b，d)的透射电镜图片和尺寸分布直方图；
[0055] 图 6 是本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD 纳米颗粒的T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图；
[0056] 图7是MTT法测试的U87MG细胞经过PBS缓冲液（对照）和本发明制备的 USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒（Fe的浓度范围在 10-100μg/mL)处理24小时后的细胞活力；
[0057] 图 8 是U87MG细胞与本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒的PBS溶液（Fe的浓度为 0、0. 125、0. 25、0. 50、I. 0 和I. 5mM)共 培养4小时后的细胞的平均荧光强度；
[0058]图9是U87MG细胞分别经过PBS缓冲液（a)、本发明制备的USPIO/PEI. NHAc-FI-mPEG纳米颗粒（b)(Fe浓度为 0. 5mM)和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒 (c) (Fe浓度为0. 5mM)处理4小时后细胞的共聚焦显微成像图片；
[0059] 图 10 是U87MG细胞分别与本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒（Fe浓度范围在0. 1-0. 4mM)共培养4小时后的细胞T2MR成像 图片（a)和相应的MRI信号值变化（b);
[0060] 图11是两组裸鼠分别尾静脉注射本发明制备的USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-RGD(a)、USPI0/PEI.NHAc-FI-mPEG(b)纳米颗粒PBS溶液（Fe:600μg，0.ImL) 后不同时间点裸鼠肿瘤的T2MR成像图片和相应的MRI信号值变化（c)。
【具体实施方式】
[0061] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0062] 实施例1
[0063] 将I. 30gFeCl3 · 6H20溶解于20mL超纯水中，移入250mL三口瓶中搅拌；氮气鼓 吹15分钟后，将0. 2g亚硫酸钠溶于IOmL超纯水后加入到三口瓶中，持续搅拌反应30分 钟；然后依次将〇. 5g超支化聚乙烯亚胺PEI的水溶液和2mL的NH3 ·H2O也加入到三口瓶 中，70°C下恒温搅拌反应30分钟；接着在室温下反应1. 5小时；反应结束后，将所得到的黑 色USPIO/PEI.NH2磁分离，除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复超纯 水洗涤三次，以除去杂质，然后重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包覆的USPIO纳米颗粒 (USPIO/PEI.NH2)。同时用相同的方法在缺少PEI的情况下制备裸露的USPIO作为对照。取 3mL纳米颗粒溶液，真空冷冻干燥用于X-射线衍射检测。XRD结果显示了USPIO和USPIO/PEI.NH2纳米颗粒的晶体结构为四氧化三铁（见附图1)。
[0064] 实施例2
[0065] 取 20mLUSPIO/PEI.NH2 (154mg)(实施例 1)用DMSO洗涤后，重新分散于 20mLDMS0 溶液中。接着，将2mLDMSO溶解的FI溶液（3. 6mg)加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中， 搅拌反应1天，产物USPIO/PEI.NH2-FI磁分离并用超纯水洗涤，然后分散到水中。分别取 25μLUSPIO/PEI.NH2 (实施例1)、USPIO/PEI.NH2-FI的水溶液于2mL离心管中，再向其中 加700μL超纯水，超声均匀，测紫外吸收（见附图2)。从图中可以看出，USPIO/PEI.NH2在 400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而USPIO/PEI.NH2-FI在500nm处有一个明显的紫 外吸收峰，从而说明FI成功修饰到USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面。
[0066] 实施例3
[0067] 将 3. 70mg6-M与 20mgNH2-PEg-COOH混合于 5mLDMSO溶液中，搅拌反应 10 个 小时，得到C00H-PEG-6-M;然后将充分溶解于2mLDMSO中的6. 9ImgRGD逐滴加入到 C00H-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1天，用截留分子量1000的透析袋透析三天，然后 真空冷冻干燥，即得C00H-PEG-R⑶。取3mg合成的C00H-PEG-RGD溶于氘代DMSO中进行核 磁共振分析（1HNMR)(见附图3)。从图中可以看出，在7.3和7. 4ppm处出现的谱峰证明 RGD成功连接到PEG上，并通过峰面积积分可知，每一个PEG上连接0. 5个R⑶。
[0068] 实施例4
[0069] 将实施例 3 中制备的 25mgC00H-PEG-RGD、15. 99mgEDC和 9. 60mgNHS混合溶解 于5mLDMSO后，搅拌活化4h;将实施例2中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗 涤后，重新分散于IOmLDMSO中，然后将活化的C00H-PEG-RGD溶液逐滴加入到USPIO/PEI. NH2-FI的DMSO溶液中，搅拌反应4天，再磁分离洗涤，即得USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGd, 并分散于IOmL水中。取 2mLUSPIO/PEI.NH2-FI-mPEG(对比例 1)和USPIO/PEI. NH2-FI-PEG-RGd水溶液冻干进行热重分析（见附图4)。从图中可以看出，修饰后，USPIO/ PEI.NH2-FI-mPEG和USPIO/PEI.NH2-PEG-RGD的失重分别是 15. 68 % 和 16. 35 %，通过比 较USPIO/PEI.NH2-FI在700°C时的失重量，经过计算，PEI和FI的总上载率为12. 35%， mPEG-C00H和C00H-PEG-RGD上载率为3.33%和4.00%。再结合实施例3，说明PEI、FI、 mPEG和PEG-R⑶均已成功连接到USPIO纳米颗粒的表面。
[0070] 实施例5
[0071] 向对比例1中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG和实施例4中制备的USPIO/PEI. NH2-FI-PEG-R⑶纳米颗粒水溶液（IOmL)中分别加入505μL三乙胺（密度为0· 726? 0. 729g/mL，浓度为99. 0% )，并搅拌20?40分钟；然后向上述两种溶液中再分别加 入412yL乙酸酐（密度为L08g/mL，浓度为98.5% )(三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI. NH2-FI-mPEG、USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-R⑶纳米颗粒表面氨基摩尔比=10:10:1)，继续搅拌 反应24小时；产物磁分离并加入适量超纯水超声分散，如此重复3次，最终分散到5mL超 纯水中，即制得乙酰化的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗 粒。取本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米颗粒悬 浮液各100μL，用超纯水分别配制成I. 5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径（见附 表 1)。电势结果显示乙酰化后USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD 纳米颗粒的表面电势是+26. 4mV和+28. 3mV，而其分散于水中的水动力粒径分别是127. 3nm和 146. 5nm。
[0072] 取本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-R⑶纳米 颗粒水溶液各5μL，然后用超纯水分别配制成100μL的纳米颗粒悬浮液。并取5μL纳米颗 粒悬浮液滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM测试（见附图5)。TEM结果显示USPIO/ PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(见附图 5a)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图 5b)纳米颗粒的 形貌均为球形或准球形。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到USPI0/PEI. NHAc-FI-PEG-RGD(见附图5c)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图5d)纳米颗粒的直径是 9. 1±L9nm和 9. 0±L7nm。
[0073] 表1.纳米颗粒分散于水中的电势和水动力粒径
[0074]
【权利要求】
1. 一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括： (1) 将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30?40分钟； 然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3 ? H20,60?70°C下恒温搅拌反应30? 40分钟；然后在室温下反应1. 5?3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得PEI 包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI. NH2 ; (2) 将步骤（1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中； 再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI. NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1?2天，磁分离洗 涤并分散于水中，得到USPIO/PEI. NH2-FI纳米颗粒； (3) 将6-(马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液 中，搅拌反应10?12小时，得到C00H-PEG-6-M ;然后再将充分溶解于DMSO中的端基为巯 基的RGD SH-RGD逐滴加入到C00H-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1?2天，透析，真空 冷冻干燥，即得到C00H-PEG-RGD ; (4) 将步骤（3)中制备的C00H-PEG-R⑶与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化2? 4h ;将步骤⑵中制备的USPIO/PEI. NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中， 然后加入活化的C00H-PEG-RGD溶液，搅拌反应2?4天，磁分离洗涤并分散于水中，得到 USPIO/PEI. nh2-fi-peg-r⑶纳米颗粒； (5) 向步骤⑷中制备的USPIO/PEI. NH2-FI-PEG-R⑶纳米颗粒水溶液中加入三乙胺， 并搅拌20?40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20?30小时，磁分离洗涤并分散于 超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI. NHAc-FI-PEG-R⑶。
2. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（1)中的三价铁盐为FeCl3 ? 6H20 ;三价铁盐、超纯水、NH3 ? H20的配 比为1. 2?1. 4g:20?25mL:2?3mL，三价盐、亚硫酸钠、超支化聚乙烯亚胺PEI的质量比 为 1. 2 ?1. 4:0. 20 ?0? 25:0. 50 ?0? 53。
3. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（1)中的NH3 ? H20质量百分比浓度为25?28%。
4. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（1)中的超支聚乙化烯亚胺PEI的分子量为25000。
5. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（2)中FI与USPIO/PEI. NH2表面氨基的摩尔比为1:39?40。
6. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（3)中RGD:6-M:NH2-PEG-C00H的摩尔比为1:1?1. 2:1?1. 2 ; NH2-PEG-C00H 的分子量为 2000。
7. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（3)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析2-4天。
8. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（4)中的C00H-PEG-RGD与EDC、NHS的摩尔比为1:8?10:8?10。
9. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（4)中的C00H-PEG-RGD与USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面氨基的摩尔 比为1:23?25。
10.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法， 其特征在于，所述步骤（5)中的三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面上的伯氨基 摩尔比为8?10:10?12:1。
【文档编号】A61K49/18GK104399092SQ201410604468
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】沈明武, 胡勇, 李静超, 韦平, 史向阳 申请人:东华大学