用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法
【专利摘要】一种用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法，属于水产微生物领域，其活性成分为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H1的菌体和它的胞外代谢产物；该菌株是从山东蓬莱健康养殖的仿刺参肠道粪便分离获得，通过安全性、抑菌活性、毒性检测以及人工拮抗灿烂弧菌实验，证实巨大芽孢杆菌H1菌株能拮抗灿烂弧菌，有效地保护仿刺参稚参，用于防治由灿烂弧菌引起的仿刺参“腐皮综合症”，提高仿刺参保苗期的成活率。
CGMCC No9883
20141030
【专利说明】用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂及制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于水产微生物领域，具体涉及一种用于防治仿刺参"腐皮综合症"的微生 态制剂及制备方法。
【背景技术】：
[0002] 仿刺参（Apostichopus japonicas Selenka)养殖以其单种类产值最高和每年 20%的增长速度，成为我国水产养殖业的重要支柱之一。2011年度，山东省仿刺参的养殖面 积达5. 3万公顷，年产量7. 1万吨（超过全国总产量一半），年产值达160亿元。然而，近年 来随着刺参养殖规模的不断扩大，各种病害接踵而至，严重制约了该产业的健康、可持续发 展。仿刺参保苗期和养成期发生的"腐皮综合症"波及面广，传染性强，死亡率极高，造成了 惨重的经济损失。其症状主要表现为：厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表 大面积溃疡；每年的1-4月份养殖水体温度较低时（< 8°C=是发病高峰，这种病在育苗场 多发生在2、3月份，池塘养殖则多发生在3、4月份，其高感染率通常引起成参50%的死亡 率和稚参的全部死亡，属于急性死亡。而灿烂弧菌（Vibrio splendidus)是引起养殖刺参 "腐皮综合症"的主要病原菌之一，其致病力强，既能引起仿刺参表皮溃疡，也能诱发稚参烂 胃病。
[0003] 为了控制仿刺参病害的发生，许多养殖户选择大量使用抗生素，而长期使用抗生 素会导致药物的残留、养殖环境恶化、病原耐药性增强等负面影响。近年来，抗生素已经陆 续被许多国家明令禁止作为饲料添加剂来使用，并严禁直接向养殖水域中泼洒抗生素。因 此，通过益生菌抑制病原微生物，调节养殖动物肠道微生态平衡，增强养殖动物免疫力以 及安全环保的生物防治手段在水产养殖业中得到越来越多的关注。
【发明内容】
：
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于防治仿刺参"腐皮综合症"的微生态制 剂及制备方法，所述微生态制剂的是包括巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)Hl及其胞 外代谢产物，该菌株是从山东蓬莱健康养殖的仿刺参肠道粪便分离获得，通过安全性、抑菌 活性、毒性检测以及人工拮抗灿烂弧菌实验，证实巨大芽孢杆菌Hl菌株能拮抗灿烂弧菌， 有效地保护仿刺参稚参，用于防治由灿烂弧菌引起的仿刺参"腐皮综合症"，提高仿刺参保 苗期的成活率。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0006] -种用于防治仿刺参"腐皮综合症"的微生态制剂，其活性成分为巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)Hl的菌体和它的胞外代谢产物；
[0007] 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)Hl分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参 (Apostichopus japonicas Selenka)肠道粪便。该菌株于2014年10月30日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9883,保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0008] 进一步，上述微生物制剂为液体制剂。
[0009] 本发明还提供一种上述微生态制剂的制备方法，具体包括如下步骤：菌种活化、种 子液制备和发酵培养；
[0010] ⑴菌种活化：将保存的巨大芽孢杆菌Hl菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上划线 活化，再挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养基上，28°C培养24小时，获得活化 巨大芽孢杆菌Hl菌株；
[0011] (2)种子液制备：无菌条件下将步骤（1)活化的巨大芽孢杆菌Hl菌株接种至无菌 胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，在28-30°C、摇床转速150-170rpm条件下培养20-24小 时，获得巨大芽孢杆菌Hl种子液；
[0012] (3)发酵培养：按照体积比0.1%的比例将步骤⑵的巨大芽孢杆菌Hl种子液 接入用海水配制的发酵培养基；所述发酵培养基的成分及其重量百分比为豆柏粉0. 5%， 玉米浆0.2%，酵母膏0.01 %，KH2PO4O. 02%，磷酸高铁0.005 % ;所述发酵培养基的 pH7. 5-8. 0 ;在28-30°C、搅拌机转速120-140rpm条件下培养20-24小时，获得巨大芽孢杆 菌Hl菌株的液体制剂，活菌数IO ltl?10nCFU/ml，也即用于防治仿刺参"腐皮综合症"的微 生态制剂。
[0013] 进一步，所述步骤（3)将巨大芽孢杆菌Hl种子液接入发酵培养基后用搅拌机以 120-140rpm的转速进行搅拌，同时向发酵罐中通入过滤无菌空气，通气量与发酵液体积的 比值1:1，通气单位L/min，罐压为0. 03-0. 05Mpa。
[0014] 本发明还提供一种巨大芽孢杆菌Hl在防治仿刺参"腐皮综合症"的微生态制剂中 的应用；
[0015] 本发明还提供一种巨大芽孢杆菌Hl在防治仿刺参"腐皮综合症"中的应用，具体 为将上述所得微生态制剂泼洒于仿刺参养殖水体中，水体中最终活菌数为IO 5?IO6CFU/ ml 〇
[0016] 进一步，所述的巨大芽孢杆菌Hl在防治仿刺参"腐皮综合症"中的应用为将所述 的微生态制剂与仿刺参饲料混合后进行投喂，用量与泼洒使用的量相同。
[0017] 巨大芽孢杆菌Hl菌株的分离筛选
[0018] Hl菌株分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参肠道粪便。2011年10月，无菌采集健 康的仿刺参肠道粪便，用10倍体积的无菌海水对肠道粪便进行稀释混匀后置于15ml离心 管中，直接静置15min取上清。分别将上清液配制成0、10' 1(Γ2、1(Γ3四个不同的稀释浓 度，每个浓度设置3个平行组；并各取100 μ 1涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基；于28°C恒 温培养箱中倒置培养，进行细菌的分离和纯化。
[0019] 以由灿烂弧菌引起的仿刺参的排脏和死亡作为靶标，结合安全性、抑菌活性和毒 性的检测，进行生防菌的筛选。结果中筛选出一株对靶标病害具有显著防治效果的菌株，定 名为Hl菌株。
[0020] Hl菌株的分类鉴定
[0021] Hl菌株能在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长，形成圆或不规则形的菌落，表面 干燥不透明，培养后期起皱，呈奶黄色且具有一定粘性；孢子中生；革兰氏阳性，运动性 弱，菌体呈杆状，大小为（1.2?1.8) μ mX (2.0?3.5) μ m。该菌株革兰氏染色呈阳性， 能够水解明胶、淀粉，硝酸盐还原阴性。Biolog鉴定，Hl菌株与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)具有最高相似率为98%。与《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版中描述的Bacillus megaterium种属特征相符。该菌16S rDNA全长序列（见序列表SEQ1，长度为1518bp)通过 NCBI 的BLAST检索系统（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast/)与Bacillus megaterium Cl (AJ491841)进行同源序列比对，相似性达100% ;通过用MEGA4. 0作进化树（图1)。因 此Hl鉴定为BaciIlus megaterium，根据中文命名规则，命名为巨大芽孢杆菌Hl。
[0022] 巨大芽孢杆菌Hl菌株的安全性、抑菌活性和毒性的检测
[0023] 将分离纯化获得的巨大芽孢杆菌Hl菌株接种至绵羊血琼脂平板（购自青岛奕维 生物科技有限公司）上；置于28°C恒温培养18-24小时后观察菌落形态及溶血情况。以大 肠杆菌JM109 (Escherichia coli)为阴性对照。巨大芽孢杆菌Hl菌株无溶血性。
[0024] 与中国海洋大学海洋生命学院海洋微生物实验室保藏的仿刺参致病弧菌灿烂弧 菌（Vibrio splendidus) LJ08在2216E平板上进行牛津杯法抑菌实验，28°C恒温培养24小 时后，巨大芽孢杆菌Hl呈现明显的抑菌圈（图2)。
[0025] 毒性试验于预先消毒的盛有3L砂滤海水的玻璃烧杯中进行。挑选个体大小相当 的健康稚参（平均体质量为1.07±0.08g)用于试验，每20头一组，设3个平行。巨大芽 孢杆菌Hl菌株以IO 7CFUAiI的浸泡浓度，对仿刺参进行毒性试验。整个试验期间不投喂任 何饲料，水温保持在18-20°C，充气培养。每隔3天，彻底换水一次，补加菌悬液一次，保持 IO7CFUAiI的浸泡浓度，连续两周，观察仿刺参排脏情况。巨大芽孢杆菌Hl菌株对稚参均无 刺激排脏的作用，且实验期间无稚参死亡，说明巨大芽孢杆菌Hl对仿刺参是安全的，可以 作为潜在的有益菌（图3)。
[0026] 对灿烂弧菌的拮抗实验挑选个体大小相当的健康稚参养殖（平均体质量为 1. 07±0. 08g)于预先消毒的盛有3L砂滤海水的玻璃烧杯中，每20头一组，每组设3个平 行。其中空白对照组未做任何处理，阳性对照组仅添加浓度为l〇 lclCFU/ml的灿烂弧菌菌悬 液3ml。拮抗组同时添加浓度为101(lCFU/ml的Hl菌株和灿烂弧菌菌悬液各3ml。整个试 验期间不投喂任何饲料，水温保持在18_20°C，充气培养。每隔3天，彻底换水一次，补加菌 悬液一次，保持原有的浸泡浓度。连续观察两周，统计稚参排脏率，并计算保护率（％)= {(阳性对照组平均排脏率一试验组平均排脏率）/阳性对照组平均排脏率} X 100%。在拮 抗实验的第14天，取Iml各实验组换水前的稚参养殖海水进行系列稀释，定量涂布TCBS琼 脂平板检测实验水体中灿烂弧菌数量的变化。采用SPSS 17.0统计软件Duncan法对实验 数据进行方差分析。在实验的第14天，添加巨大芽孢杆菌Hl拮抗组实验水体中的灿烂弧 菌数量为（I. 55±0. 5) X 105CFU/ml，而阳性对照组灿烂弧菌数量为（2. 16±0. 6) X IO7CFU/ ml，巨大芽孢杆菌Hl拮抗组与阳性对照组差异显著（p<0. 05)，进一步证实Hl对灿烂弧 菌具有明显的抑菌作用，与牛津杯抑菌试验结果一致。经过两周的人工拮抗实验，空白对照 组的累计排脏率为〇% ;仅添加灿烂弧菌的阳性对照组累计排脏率为（43. 33±5. 77) % ;而 巨大芽孢杆菌Hl拮抗组的累计排脏率为（3. 33 ±2. 89) % (图3)。统计分析显示：H1拮抗 组和阳性对照组差异显著（P < 0. 05)，说明巨大芽孢杆菌Hl具有很好的保护仿刺参稚参的 作用。经计算获得的巨大芽孢杆菌Hl对仿刺参稚参的排脏保护率为92. 7%。
[0027] 本发明与现有技术相比的有益效果
[0028] (1)本发明微生态制剂的主要成分为巨大芽孢杆菌菌株Hl及其胞外代谢物，该微 生态制剂对由灿烂弧菌引起的仿刺参"腐皮综合症"特异性强，且防效高，对仿刺参稚参的 排脏保护率为92. 7%。（2)利用本发明微生态制剂防治由灿烂弧菌引起的仿刺参"腐皮综 合症"不易产生抗药性，对人、畜安全，无环境污染。（3)本发明制备方法简单、成本低、使 用方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1根据16S rRNA基因序列构建的Hl菌株及与其亲源关系较近的Bacillus megaterium代表菌株的系统进化树。进化距离的计算采用P-distance计算模型，树的拓扑 形状采用neighbor-joining方法构建，分支上的数字为1000次bootstrap分析所得值，标 尺0. 0002代表此长度为万分之2的核苷酸序列替换。
[0030] 图2巨大芽孢杆菌Hl菌株体外拮抗灿烂弧菌LJ08 (牛津杯法）
[0031] 图3巨大芽孢杆菌Hl菌株对灿烂弧菌LJ08的拮抗实验
[0032] 巨大芽抱杆菌H1，拉丁文名称为Bacillus megaterium H1，于2014年10月 29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9883,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编 100101。
【具体实施方式】：
[0033] 下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的解释，但本发明的保护范围不受 实施例任何形式上的限制。
[0034] 实施例1
[0035] -种巨大芽孢杆菌Hl生产的微生物制剂，其活性成分为巨大芽孢杆菌Hl的菌体 和它的胞外代谢产物。其制备方法按照如下步骤进行：
[0036] (1)菌种活化：将保存于_80°C的巨大芽孢杆菌Hl菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养 基上划线活化，28°C培养至长出单菌落，再挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基斜 面培养基上，28°C培养24小时，得到活化菌株。
[0037] (2)种子液制备：按常规方法制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，其成分及组成： 胰蛋白胨 1.5% (g/100ml)、大豆蛋白胨 0.5% (g/100ml)、氯化钠 0.5% (g/100ml);在 500mL锥形瓶中装入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基200mL，pH为7. 6。置高压蒸气灭菌器中， 在121°C，105kPa下灭菌20分钟。待培养液温度降至30°C后，于瓶中接入步骤（1)活化好 的一接种环菌苔，在摇床上进行振荡培养，培养条件为转速170rpm，28°C培养24小时，获得 种子液。
[0038] (3)发酵罐培养基的制备：用海水配制的发酵培养基，按重量百分比将豆柏粉 0. 5%，玉米浆0. 2%，酵母膏0. 01%，KH2PO4O. 02%，磷酸高铁0. 005%加入海水中，于316L 不锈钢发酵罐中搅拌均匀，在121°C，105kPa下灭菌20分钟，降温至30°C以下备用。
[0039] (4)发酵培养：向发酵罐中按体积比0. 1%的比例接入步骤⑵的巨大芽孢杆菌 Hl种子液，搅拌机转速为120rpm，通入过滤无菌空气，通气量与发酵液体积的比值1: 1，通 气单位L/min，罐压为0. 04Mpa，pH 7. 6, 28°C下培养24小时。每隔2小时取样镜检，菌数 达IOltl?10nCFU/ml后即停止发酵培养，所得菌液为巨大芽孢杆菌Hl液体微生物制剂。
[0040] 实施例2
[0041] 2012年1月至3月，我们在山东安源水产股份有限公司进行了为期2个月的仿刺 参保苗养殖实验。巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂按照实施例1的方法经发酵罐生产，活菌数 达3. 5 X 101(lCFU/ml，菌液呈浅棕色状，于室温保存。实验在该公司实验车间6个仿刺参保苗 池进行，设对照组和泼洒巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂的实验组，每组3平行，其中每池水体 为8立方米。选取健康稚参个体（平均体质量为0. 81 ±0. 37g，体长I. 3-2. Icm)，个体投放 密度为〇. 5kg/方水体，进行24小时充气养殖。保证水体溶解氧>5mg/L，水温16?18°C， 避光，每天换水量50-100%。饲料和添加剂按正常生产投喂，初始饲料投喂量按参苗体湿 重的5%，每天早晨投喂一次。仿刺参致病弧菌灿烂弧菌LJ08每天早晨按养殖水体最终活 菌数IO 4CFUAiI的量进行各池拌料投喂。实验组巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂用法为每天 换水后泼洒一次，每立方米水体泼洒4毫升，保持巨大芽孢杆菌Hl在养殖水体的最终活菌 数为I. 4X 105CFU/ml。每4至7天倒池，在参苗框换池时统计各池底参苗死苗和有腐皮症 状的个数。结果表明，2月内泼洒巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂的实验组池底参苗腐皮及死 苗数平均为75. 67±7. 59只/池，对照池的参苗腐皮及死苗数平均为287. 33±52. 64只/ 池。加本发明微生态制剂有效地控制了由灿烂弧菌引起腐皮症，提高了仿刺参稚参的成活 率，可应用于仿刺参大规模的保苗生产。
[0042] 实施例3
[0043] 2013年12月，我们在青岛贝宝海洋科技股份有限公司进行了为期3个月的仿刺参 保苗越冬养殖实验。巨大芽孢杆菌菌株Hl由公司按照实施例1的方法二级发酵罐生产， 菌数达8. 6 X 101(lCFU/ml，于室温保存。实验在该公司循环水车间9个仿刺参保苗池进行，设 对照组、投喂巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂实验组和投喂枯草芽孢杆菌菌液实验组，枯草芽 孢杆菌菌液为市售（标称l〇 nCFU/ml)，每组3个平行，其中每池水体为6立方米。选取健 康稚参个体（平均体质量为3. 12±0. 97g，体长3. 01-4. 12cm)，个体投放密度为0. 5kg/方 水体。养殖池24小时充气，溶解氧>5mg/L，水温14?16 °C，避光，每天换水量80%。初始 饲料投喂量按参苗体湿重的5%，每天早晨投喂一次。仿刺参致病弧菌灿烂弧菌LJ08每天 换水后按养殖水体最终活菌数为l〇 4CFU/ml进行各池泼洒。实验组巨大芽孢杆菌Hl微生 态制剂和枯草芽孢杆菌菌液的用量分别为每立方米水体3毫升，拌饲料投喂。每5至7天 倒池，参苗框换池时统计各池池底参苗死苗和有腐皮症状的个数，并于3个月后进行各池 称重。结果表明，投喂巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂的实验组池底参苗腐皮及死苗数平均为 35. 33±1. 70只/池，对照组的参苗腐皮及死苗数平均为187. 33. 06±31. 67只/池，投喂枯 草芽孢杆菌菌液实验组的参苗腐皮及死苗数平均为142. 67± 15. 97只/池。投喂巨大芽孢 杆菌Hl微生态制剂的实验组参苗体质量比对照组和投喂枯草芽孢杆菌菌液实验组分别增 重38. 75%和26. 51%。结果证明在仿刺参冬季低温保苗期投喂巨大芽孢杆菌Hl微生态制 剂可有效降低参苗腐皮症的发生，并显著提高产量，巨大芽孢杆菌Hl微生态制剂适宜于仿 刺参冬季保苗大规模养殖时应用。
【权利要求】
1. 一种用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂，其特征在于其活性成分为巨大芽孢 杆菌（Bacillus megaterium)Hl的菌体和它的胞外代谢产物； 所述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)Hl分离自山东蓬莱健康养殖的仿刺参 (Apostichopus japonicas Selenka)肠道粪便，该菌株于2014年10月29日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9883,保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2. 根据权利要求1所述的一种用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂，其特征在于 所述微生态制剂为液体。
3. 根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于它的具体步骤如下： (1) 菌种活化：将保存的巨大芽孢杆菌H1菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上划线活 化，再挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基斜面培养基上，28°C培养24小时，SP可 获得活化巨大芽孢杆菌H1菌株； (2) 种子液制备：无菌条件下将步骤（1)活化的巨大芽孢杆菌H1菌株接种至无菌胰蛋 白胨大豆肉汤液体培养基中，在28-30°C、摇床转速150-170rpm条件下培养20-24小时，获 得巨大芽孢杆菌H1种子液； (3) 发酵培养：按照体积比0. 1%的比例将步骤（2)的巨大芽孢杆菌H1种子液接入用 海水配制的发酵培养基；所述发酵培养基的成分及其重量百分比为豆柏粉0.5%，玉米浆 0. 2%，酵母膏0. 01 %，KH2P040 . 02%，磷酸高铁0. 005% ;所述发酵培养基的pH7. 5-8. 0 ;在 28-30°C、搅拌机转速120-140rpm条件下培养20-24小时，获得巨大芽孢杆菌H1菌株的液 体制剂，活菌数101°?l〇nCFU/ml，也即用于防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤（3)将巨大芽孢杆菌H1种子 液接入发酵培养基后用搅拌机以120-140rpm的转速进行搅拌，同时向发酵罐中通入过滤 无菌空气，通气量与发酵液体积的比值1:1，通气单位L/min，罐压为0. 03-0. 05Mpa。
5. -种巨大芽孢杆菌HI在防治仿刺参腐皮综合症中的应用，将权利要求1所述的微生 态制剂泼洒于仿刺参养殖水体中，水体中最终活菌数为1〇5?l〇6CFU/ml。
6. 根据权利要求5所述的一种巨大芽孢杆菌HI在防治仿刺参腐皮综合症中的应用，其 特征在于所述的巨大芽孢杆菌H1在防治仿刺参腐皮综合症中的应用方法为将所述的微生 态制剂与仿刺参饲料混合后进行投喂，用量与泼洒使用的量相同。
7. -种巨大芽孢杆菌H1在防治仿刺参腐皮综合症的微生态制剂中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK104367597SQ201410657397
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】祁自忠, 韩茵, 陈四清, 邹安革, 王亮, 余彬 申请人:中国海洋大学