免疫性LHRH组合物及其在猪只中的应用的制作方法

本发明是关于一种免疫性lhrh组合物，且特别是关于一种免疫性lhrh组合物，其含有包含可功能性抑制猪只lhrh浓度的lhrh肽结构，以有效地免疫去势猪只、消除公猪臭和促进生长。
背景技术：
：促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，gnrh)，也被称为促黄体激素释放激素(luteinizing-hormone-releasinghormone，lhrh)，是一种营养性肽激素，负责使滤泡刺激素(follicle-stimulatinghormone，fsh)和黄体成长激素(luteinizinghormone，lh)由脑下垂体前叶释放。lhrh是由下视丘内的神经元合成与释放。自1970年代早期已证实接种下视丘激素lhrh疫苗可作为一种用以控制繁殖的免疫方法。引发对lhrh的免疫反应可预防激素lh和fsh由脑下垂体前叶释放，lh和fsh为性腺(雄性的睾丸与雌性的卵巢)发展和维持所需。因此，减少lh和fsh水平可导致生殖功能的丧失。绝育(或阉割)手术是兽医学和畜牧动物管理上最为广泛使用的手术方法。家畜和伴侣动物之两种性别的显著比例是利用常规手术绝育以防止各种伴随性成熟的非欲求的特性。免疫阻绝lhrh作用可导致动物不孕，因为lhrh控制睾固酮生成，睾固酮生成进而调控精子发展与雌激素生成，雌激素生成进而导致卵子成熟。此外，基于lhrh的免疫疗法提供一种用于雄性与雌性伴侣动物(例如：狗、猫、马和兔子)的节育方法，以及和缓非欲求的雄性激素-驱动的行为(例如:发情、区域性标记和攻击)。一旦接受基于lhrh的免疫疗法的免疫接种，此种过程是可逆性的，其取决于受试动物的血清抗体水平。免疫去势(例如：利用抗体对lhrh作用的抑制)在肉用动物畜产上已有一种其他应用。因为讨人厌的气味与风味与其肉品相关，是睾固酮代谢的结果(例如：公猪臭(boartaint))，故雄性的肉品无法被加工制成特级肉块。因为视雄性食用动物的机械去势(例如：手术)为不人道，故免疫去势针对此方法提供一种可接受的替代方案。多种免疫性型式的lhrh用于试验。例如，结合lhrh肽至载体蛋白以增强此肽激素的免疫效力。然而，此些蛋白载体对大规模使用过于昂贵，且作为结果的肽-蛋白结合物无法有效的(1)产生长期的免疫去势，也无法(2)在所有动物产生抗-lhrh免疫反应，此二种条件对作为去势手术的替代方案的有效疫苗是需要的。更进一步，以一种非免疫性10-mer肽的lhrh有效的免疫接种，取决于lhrh和载体蛋白间的结合位置。此外，联结至lhrh的蛋白质作为免疫原是有问题的，因为对此免疫原的免疫反应的主体指向的是大的载体蛋白，而非lhrh肽(毒素或其他载体蛋白的质量远大于lhrh的质量，lhrh为10-mer肽)。此现象频繁地造成载体蛋白所引发的表位免疫抑制。据此，为了在免疫去势的多种应用，应该寻找一种免疫增强剂，此免疫增强剂适用于连结lhrh肽以产生作为疫苗制剂关键成份的价钱低廉的肽结构，此免疫增强剂能够刺激对lhrh早期且强烈的免疫反应。同样地，此免疫增强剂也需避免载体蛋白所引发的表位免疫抑制。因此，对免疫去势具有一贯高效力的lhrh疫苗包括(1)在猪只的公猪臭消除和生长曲线促进的具体应用，以及(2)用于行为矫正以易于牧场中动物管理；特别是在猪只，业界亟需解决目前基于lhrh的免疫疗法所不足之处。技术实现要素：本发明提供一种用于猪只去势的疫苗组合物，其包含肽免疫原和兽医学上可接受的载体或佐剂，其中肽免疫原包含(a)seqidno：1的lhrh肽，以及(b)选自由seqidno：2、3、4、5以及6组成的群组的至少一th抗原表位或免疫刺激性元件，其中lhrh的肽可借由gly-gly或εnlys间隔序列(spacersequence)经由其氨基端与th抗原表位和/或免疫刺激性元件共价连结。间隔“εnlys”是一个出现于二氨基酸间的赖氨酸残基，用以连接(1)位于赖氨酸残基的ε-nh2基团的在先的氨基酸的羧酸端，以及(2)位于赖氨酸残基羧酸端的接着的氨基酸的氨基端。本发明中所述的“εnlys”、“εlys”和“εk”可交替使用。在另一实施例中，本发明的肽免疫原包含seqidno：7、8、9或10，或其混合物，且兽医学上可接受的佐剂选自由isa50v2和emulsigend组成的群组。每剂量的肽免疫原的总量为超过6.25μg，优选地为50μg至200μg。本发明的另一范畴是关于一种用以抑制猪只因性成熟所引发的特征的方法，包含利用本发明的疫苗组合物的有效量投予猪只，以降低猪只的睾固酮及其衍生物(例如︰二氢睾固酮和雌激素)产量。此特征包含，但不限于，公猪臭、性活动力、生育力以及发情行为。本发明的方法可抑制公猪臭和睾丸与副睾的生长。在一实施例中，借由肌肉注射投予公猪两剂疫苗组合物，第一剂施用于早至3周龄的猪只，作为加强免疫的第二剂则于10至16周龄注射，或投予年龄更大的猪只，其于加强免疫后约两周造成有效的免疫去势、生长促进和公猪臭消除。本发明将详细描述于以下的实施例中，并请参照附图。附图说明图1a和图1b是公猪以配制于佐剂isa50v2(图1a)或emulsigend(图1b)中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后个别抗-lhrh抗体的效价。所有试验组的猪只(第1至4组和第8至11组)在加强免疫后两周(即初免后十周，或10wpi，约为18周龄)具有高的抗-lhrh抗体效价。相对之下，注射目前市售疫苗(第7组和第14组)猪只的lhrh-抗体效价只在14wpi时上升，其效价低于本发明肽疫苗制剂(第1至4组和第8至11组)。第5和12组猪只接受生理食盐水作为阴性对照组，且第6和13组猪只以手术程序去势作为阳性对照组。图2a和图2b是公猪以配制于佐剂isa50v2(图2a)或emulsigend(图2b)的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后猪只相对应的睾固酮浓度，用以说明个别动物的去势持续性。配制于isa50v2或emulsigend的所有组别在10wpi前维持低浓度的睾固酮，并维持低水平直到16wpi(24周龄)。相较之下，第7和14组接受疫苗的猪只具有高浓度的血清睾固酮直到12wpi，且低浓度的睾固酮在14wpi时浓度开始上升，显示免疫去势的效力较低。图3a和图3b是公猪以配制于isa50v2(图3a)或emulsigend(图3b)的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后于24周龄猪只的个别体重。经标准化的阴性对照组和手术去势组具有显著较低的平均体重94.9kg(阴性对照组，第5和12组)和88kg(手术去势组，第6和13组)。相对于手术去势组，证明本发明的疫苗(第4和11组)可增加约27.9％的体重，具有显著的好处。图4a和图4b是公猪以配制于佐剂isa50v2(图4a)或emulsigend(图4b)中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后个别抗-lhrh抗体的效价。所有试验组猪只在加强免疫后两周在10wpi(即18周龄)具有高的抗-lhrh抗体效价。不论是配制在isa50v2或emulsigend组别的猪只，此抗体效价可维持于接近3.0(log10)直到16wpi(即24周龄)，此相当于上市贩售之时。图5a和图5b是公猪以配制于佐剂isa50v2(图5a)或emulsigend(图5b)中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后的个别睾固酮浓度。在配制于isa50v2的第1至4组和配制于emulsigend的第8至11组猪只的血清睾固酮浓度相反地对应至lhrh-抗体的血清效价，即较高的抗-lhrh抗体效价具有较低的血清睾固酮浓度，去势血清睾固酮浓度于加强免疫后两周(即10wpi或18周龄)达到1.87nmol/l的边界值。除了第1组，配制于佐剂isa50v2或emulsigend中所有组别猪只均维持低浓度的血清睾固酮浓度直到16wpi(24周龄)。图6a和图6b是以配制于佐剂isa50v2(图6a)或emulsigend(图6b)中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种公猪后猪只的个别体重。阴性对照组(即未接种疫苗组(第5和11组))和手术去势组(第6和12组)在24周龄时分别具有显著较低的平均体重94.9kg和88kg。相对于手术去势组的猪只，本发明的疫苗制剂(第4和10组)可增加约20.3％的体重，具有显著的好处。图7是公猪以配制于佐剂isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后抗-lhrh抗体效价的持续性。加强免疫后两周(即10wpi)，第1至4组抗-lhrh抗体效价达到超过3.0(log10)，且此高效价持续至20wpi。第2和3组的动物甚至可维持抗-lhrh抗体效价于3.0(log10)直到24wpi(即32周龄)。相较之下，阴性对照组(第5组)和手术去势组(第6组)总是保持低的抗-lhrh抗体效价。图8是公猪以配制于佐剂isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后猪只个别睾固酮浓度的去势持续性。第1至4组所有猪只在加强免疫后两周(即10wpi)具有低浓度的血清睾固酮，且证实可借由抗-lhrh抗体之抑制达到去势程度。第1至4组猪只的睾固酮水平维持如去势对照组(第6组)一样低至20wpi(即28周龄)。图9是猪只以配制于佐剂isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后于24wpi时的睾丸重量。在第1至4组，猪只的睾丸萎缩至无功能的尺寸。图10是猪只以配制于佐剂isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后于24wpi时的副睾重量。在第1至4组，副睾的重量显著地下降。图11是猪只以配制于佐剂isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后的体重。在第1至4组中的动物具有较阴性对照组和手术去势组(第5和6组)更佳的体重增加表现。图12是猪只以配制于佐剂isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后对雄甾烯酮浓度的影响。在第1至4组中，脂肪中的雄甾烯酮浓度控制在0.5μg/g脂肪以下。在第3组，雄甾烯酮的平均值甚至控制在0.1384μg/g脂肪。图13是猪只以配制于佐剂isa50v2或emulsigend的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后对粪臭素浓度的影响。在第1至3组中，粪臭素浓度控制在低于0.1μg/g脂肪。以第3组的粪臭素平均值最低(为0.0514μg/g脂肪)。图14是公猪臭因子分布图。第1组与第2组的表现相似，7/8样品分布于低度风险区域，一个样品位于中度/高度风险区域。第3组具有较佳的表现直到24wpi，其中所有样品分布于低度风险区域。手术去势组(第6组)总是保持公猪臭因子的最低浓度。生理食盐水对照组(第5组)只有2/8位于低度风险区域，2/8位于中度风险区域，且4/8位于高度风险区域。图15是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂利用不同初免和加强免疫时程表免疫接种后的抗-lhrh抗体效价，用以评估免疫去势时程表的适应性。第1组猪只证实了高度免疫原性，在22周龄时达到3.556(log10)的lhrh抗体平均效价，且在26周龄时维持于3.235(log10)。第2组达到其最高抗体效价，在18周龄时为3.526(log10)的平均效价，且在26周龄时维持于2.869(log10)。第3组于24周龄达到其最高平均抗体效价3.219(log10)，且在26周龄维持于2.682(log10)。图16是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂利用不同初免和加强免疫时程表免疫接种后的血清睾固酮浓度，用以评估免疫去势时程表的适应性。第1组的猪只在20周龄(即加强免疫后两周)时展现免疫去势效果(睾固酮浓度≦1.87nmol/l)，且此效果持续至少六周直到26周龄。第2组的猪只睾固酮浓度在加强免疫后的2至6周期间(即由22周龄至26周龄)显著地低于1.87nmol/l，且保持低水平(睾固酮浓度≦1.644nmol/l)直到26周龄。加强免疫后两周，第3组的平均睾固酮浓度为4.535nmol/l。图17a、图17b、图17c和图17d是猪只以配制于佐剂isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后睾丸和副睾的重量。睾丸的重量于10wpi(图17a)、12wpi(图17b)、14wpi(图17c)和16wpi(图17d)测量。睾丸和副睾随着时间逐渐萎缩，且副睾于10wpi时以及睾丸于12wpi时重量显著地减少(p<0.001)。图18a、图18b、图18c和图18d是以配制于佐剂isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后的公猪臭因子(雄甾烯酮和粪臭素)量。雄甾烯酮和粪臭素量在10wpi(分别为图18a和图18c)和12wpi(分别为图18b和图18d)评估。免疫接种后，睾固酮浓度抑制到去势程度(即低于1.87nmol/l)，造成脂肪中的雄甾烯酮减少。图19a和图19b是通过比较未接受处理的阴性对照组(图19a)与以lhrh肽疫苗制剂接种公猪(图19b)的脂肪中雄甾烯酮和粪臭素浓度进行风险评估。所有接种的组别从10wpi至16wpi皆处于敏化评估中的低度风险区域(低雄甾烯酮(<0.5μg/g脂肪)和低粪臭素浓度(<0.22μg/g脂肪))。图20是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后对抗-lhrh抗体效价的持续性的影响。第1组的抗体效价从3.636±0.577(log10)(最高点)减少到2.418±0.742(log10)(实验结束时)。第2组的抗体效价从3.868±0.221(log10)减少到2.806±0.213(log10)(实验结束时)。图21是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后的睾固酮浓度。于本试验起始阶段所有组别的睾固酮浓度为2.943±2.854(平均值±标准差)nmol/l。疫苗效力评估的时间点设为加强免疫后2周，其显示最低睾固酮浓度。第1至4组猪只于加强免疫后2周的平均睾固酮浓度分别为1.265±0.353、1.329±0.636、1.904±2.297以及1.222±0.445(平均值±标准差)nmol/l。图22a和图22b是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后的睾丸长度(图22a)和体积(图22b)。第1至4组的猪只于成对睾丸和成对副睾的重量与睾丸的长度并无差异。依据各组别以箭号指出加强免疫的时间点。图23a、图23b和图23c是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后于尸体剖检时猪只的成对睾丸(图23a)和成对副睾(图23b)的重量，以及睾丸的长度(图23c)。图24是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后于24周龄的雄甾烯酮和粪臭素浓度。在公猪臭因子分布图中，除了第1组中的一只猪以外，第1至4组中所有猪只的危险因子均位于低度/中度危险。图25是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后的抗-lhrh抗体效价。第1、2和3组在第0和3周龄的抗-lhrh抗体效价分别位于背景值1.718±0.297、1.765±0.340和1.770±0.283(log10)附近。在16周龄加强免疫后，在18周龄时，第4组的抗-lhrh抗体效价为3.249±0.346，第5组为2.893±0.786。图26是猪只以配制于佐剂isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制剂免疫接种后的血清睾固酮浓度。第1和2组的猪只血清睾固酮浓度分别为2.154±0.921nmol/l于10周龄，以及2.183±1.231nmol/l于6周龄。第3组猪只于12周龄时有最低睾固酮浓度3.065±0.205nmol/l。第4和5组在20周龄的血清睾固酮浓度分别地被抑制至0.586±0.184和0.893±1.192nmol/l的低浓度。相较之下，接受疫苗(第6组)猪只的血清睾固酮在20周龄保持在高浓度(约9.415±7.560nmol/l)，且之后在22周龄下降至低浓度。图27是公猪以配制于佐剂isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后的抗-lhrh抗体效价。第1和2组猪只的抗-lhrh抗体效价显著地高于第3组(未去势未接种疫苗(公猪))和第4组(手术去势(阉猪))。图28是第1和2组的公猪以不同剂量的配制于佐剂isa50v2的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种后的完全(100％)免疫去势。图29是显示在与手术去势组相比时，对于以配制于佐剂isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制剂免疫接种的公猪而言，因平均日采食量(adfi)的增加而有较高的平均体重。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。下面的描述是用以实现本发明的最佳的预期模式。此描述的目的是说明本发明的一般原理，且不应被理解成具有限定意义。本发明的范围借由参照所附的权利要求书而被最适地裁定。为了使文稿排版更美观和便于阅读，以下具体实施方式中出现的表格将被统一放置于文字之后。本发明提供包含lhrh的肽，lhrh为经由其氨基端连结至共同刺激或辅助t细胞抗原表位(th抗原表位)的10-mer肽。本发明的名词“lhrh”是指促黄体激素释放激素(genbank：aab34379.1)，其为营养性肽激素，负责使fsh和lh由脑下垂体前叶释放。用于此揭露内容中的名词lhrh包含衍生自不同门(包含鸟类、鱼类、爬行动物和无脊椎动物)的lhrh同系物。此lhrh肽优选地包含如表1所示的seqidno：1的氨基酸序列。本发明的名词“疫苗(vaccine)”为一般的临床术语，用以描述可导致暴露于此疫苗的受试者产生抗体的免疫刺激性组合物。从临床角度看，接受疫苗组合物的受试者将对存在于此疫苗中的抗原产生抗体。本申请案所叙述的疫苗组合物不限于用以改善对特定疾病或病原体的免疫力的生物制剂。本发明的名词“辅助t细胞抗原表位(th抗原表位)”指衍生自外源病原体的th抗原表位，包含但不限于，例如：b型肝炎表面和核心抗原(hbsag和hbc)辅助t细胞抗原表位、百日咳毒素辅助t细胞抗原表位(ptth)、破伤风毒素辅助t细胞抗原表位(ttth)、麻疹病毒f蛋白质辅助t细胞抗原表位(mvfth)、砂眼披衣菌的主要外膜蛋白质辅助t细胞抗原表位(ctth)、白喉毒素辅助t细胞抗原表位(dtth)、镰状疟原虫环围种虫辅助t细胞抗原表位(pfth)、曼氏住血吸虫三醣磷酸盐异构酶辅助t细胞抗原表位(smth)、大肠杆菌trat辅助t细胞抗原表位(tratth)。此等病原-衍生th抗原表位作为滥交th抗原表位的代表性例子，如美国专利号5,759,551中之seqidno：2-9和42-52并入本文作为参考。有用的th抗原表位可包含组合的th抗原表位。wang等人(wo95/11998)描述一特别种类的组合th抗原表位，称为“结构性合成抗原库(syntheticantigenlibrary，ssal)”。此ssal抗原表位包含众多的th抗原表位，以氨基酸序列围绕一在特定位置具有取代物的不变的残基的结构性架构而组成。ssal的序列是借由保留相对不变的残基，同时改变其他残基以提供各种不同的mhc限制元素的辨认而决定。此可借下列达成，将滥交th的初级氨基酸序列排成一列，选择并保存造成th肽独特结构的残基作为骨架，以及根据已知的mhc限制元素改变剩余的残基。已有不变位置及具mhc限制元素的较佳氨基酸的可变位置的清单，可用于得到mhc-结合特色(mhc-bindingmotifs)。此等可作为设计ssalth抗原表位时的参考((meister等人，vaccine，1995；13:581-591)。在一实施例中，th抗原表位包含如表1所示的seqidno：2、3、4及/或5。seqidno：6是指衍生自致病的耶尔辛森氏属(yersiniaspp.)细菌的侵染素蛋白质的肽片段，其为微生物外膜蛋白质，以调停细菌进入哺乳动物细胞。已证实细菌侵入培养的哺乳动物细胞时需要耶尔辛森氏菌的侵染素分子和多种出现于培养的细胞上的β1家族整联蛋白质之间的交互作用。因为t淋巴球具有丰富的β1整联蛋白质(特别是活化的免疫或记忆t细胞)，且证明t细胞协同刺激的特性与侵染素结构区域有关，其可连结至包含lhrh结构的滥交th抗原表位，以进一步增强所设计的肽免疫原的免疫原性(美国专利号6,025,468)。本发明的肽包含至少一lhrh、th抗原表位，以及任选地共同刺激的侵染素肽结构区域。lhrh肽(包含其同系物)可经由其氨基端氨基酸与间隔共价连结到包含至少一已知含有th抗原表位的序列。th抗原表位可经由其氨基端共价连结至共同刺激的侵染素肽结构区域。间隔包含，但不限于，gly-gly、lys、εnlys、εnlys-(lys)n(此处n＝1至3)，或lys-lys-lys-εnlys(seqidno：11)等。本发明的肽具有约20个至约100个氨基酸残基，较佳介于约20个至约70个氨基酸残基，以及更佳介于约25个至约50个氨基酸残基。在另一较佳实施例中，肽具有约27个至约45个氨基酸残基。th抗原表位的数量包含，但不限于，一、二、三、四或更多个如本发明表1所示的th肽。本发明的肽包含至少一选自seqidno：2、3、4、5之th抗原表位的肽，其可任选地连结至seqidno：1的lhrh肽的氨基端。在一实施例中，th抗原表位可连结至lhrh的氨基端以形成本发明的肽。例如，seqidno：2和3的肽可借由间隔(gly-gly、lys或εnlys)连续地连结至lhrh的氨基端。如果有必要，此领域的习知技艺者可改变th抗原表位数目和用以连结至lhrh肽免疫原的间隔种类，以提供本发明的最理想肽。在另一实施例中，本发明的肽包含如表2所示的seqidno：7、8、9和/或10，或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少99％相似性者。本发明的肽可以一般习知技艺者所熟知的化学合成方法制造；参见，例如，合成肽中的auser'sguide(grant编辑，w.h.freeman&co.出版，newyork,n.y.,1992，第382页)。因此，可利用叔丁氧基羰基(t-butyloxycarbonyl,t-boc)或9-芴甲氧羰基(9-fluorenyl-methyloxycarbonyl,f-moc)化学法之自动化固相合成技术在应用生物系统自动化肽合成仪(430a或431型)上合成肽。为合成聚赖氨酸核心部分，未保护的di(t-boc)或di(f-moc)-nα，nε)赖氨酸残基可用以代替具有保护的ε-胺基的t-boc或f-moc。为改进所设计的肽的溶解度，可在肽的氨基端增加额外的丝氨酸或/和赖氨酸残基加以延长。在组合完成所欲的肽后，依照标准程序处理树脂，将肽由树脂上切下，并去除位于氨基酸侧链上的保护基团。以高效能液相层析纯化游离的肽，并确认其生化特性。另外，较长的线性肽可利用习知的重组dna技术合成。任何dna技术的标准手册可提供详细方法以制造本发明的肽。当本发明的肽作为疫苗制剂的关键成份时，可在接受免疫接种的动物产生免疫去势，其包含与性成熟有关的物理及/或化学特性(例如：性行为、战斗、徘徊、攻击性行为、非欲求的感官特性、生殖器官肿瘤以及怀孕、动情周期、生育力)的丧失。因此，抑制的特性包含抑制性行为(例如，避免雄性牛只驾乘其他雄性牛只)、避免或延迟排卵、使睾丸和副睾萎缩、降低睾固酮浓度、减少攻击行为或减少非欲求的感官特性(例如公猪臭)。为了方便且有效地投予本发明的肽的有效量和适合的药学上可接受的载体，以在此揭露的单位剂量型式配制本发明肽。单位剂量可为，例如，通常含有介于0.5μg至约2000μg的主要肽抗原量，较佳为超过6.25μg，最佳为25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg或200μg。在含有补充活性成分的组合物的情况下，此剂量是通过参考所述成分的给药的常用剂量和方式来决定。本发明亦提供包含用于肽免疫原投予的药学上可接受的传输系统的组合物。此组合物包含至少一种本发明肽的免疫学上的有效量。在本发明组合物(疫苗)中，本发明肽的数量包含，但不限于，一、二、三、四或更多。例如，本发明的组合物包含seqidno：7、8、9、10或其混合物。在一实施例中，本发明的组合物包含seqidno：7、8、9或10的单一肽。在其他实施例中，本发明的组合物包含seqidno：7、8和9(在以下范例称为lhrh3)。在其他实施例中，本发明的组合物包含seqidno：10(在以下范例称为lhrh1)。当如此配制时，包含作为目标抗原性位点的lhrh或其同系物的本发明组合物，可用于预防/消除公猪臭、促进生长、猪只免疫去势，以及用于雄性和雌性的避孕。本发明的肽免疫原可利用佐剂、乳化剂、医药上可接受的载剂或其他例行提供于疫苗组合物的成分，配制作为免疫性组合物。可用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、不完全弗罗恩特氏佐剂(ifa)、liposyn、皂角苷、鲨烯、l121、emulsigen、单磷酰基脂质a(mpl)、qs21，和isa720、isa50、isa50v2、isa35或isa206，以及其他有效的佐剂和乳化剂。此类调配物可由此领域中一般熟知技艺者轻易决定，且也可包含可立即释放及/或可持续释放的调配物。此疫苗可借由任何合宜的途径施用，包含皮下、口服、肌肉、腹腔或其他非经肠途径或肠胃途径。相似地，免疫原可以单一剂量或多剂量施用。一般熟知技艺者可轻易地决定免疫接种的时程表。在特定实施例中，传输系统和佐剂为montanidetmisa50v2(一种包含植物油和二缩甘露醇油酸(mannideoleate)的油质疫苗佐剂组合物以制造油包水(即w/o)乳化液)、80(也称为聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯)、cpg寡核苷酸和/或其任意组合。在其他实施例，此药物组合物为具有emulsigen或emulsigend作为佐剂的水包油包水(即w/o/w)乳化液。亦提供其他例行合并于疫苗制剂的成分，以及剂量用法说明书，以产生良好的b和t细胞免疫反应。适合注射用的药物剂型包括无菌水溶液(水溶性)或分散体和无菌粉末，以当场配制无菌注射液或分散体。其于制造和储存状况下必须稳定，且必须可对抗微生物(例如细菌或真菌)污染而加以保存。载体可为溶剂或分散介质，包含，例如︰水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。借由例如涂层(例如卵磷脂)、借由在悬浮状况下维持所需粒径，以及借由使用界面活性剂，以维持适当的流动性。可借由各种抗细菌和抗真菌剂(例如：对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等)预防微生物作用。在许多情况下，以含有等渗剂(例如：糖或氯化钠)为较佳。可使用延迟吸收试剂(例如：单硬脂酸铝或/和明胶)来延长注射用的组合物的吸收或延迟释放。本发明也提供借由对哺乳动物投予目标肽组合物一段时间，以引发抗-lhrh抗体效价、降低睾固酮浓度、避免公猪臭、使睾丸和副睾萎缩、猪只免疫去势，以及避孕的方法。普遍来说，本发明的方法可于猪只引发抗-lhrh抗体效价，且抗-lhrh抗体效价于一或两次疫苗接种后超过2.0，较佳为2.5或3.0(log10)。本发明的方法也可抑制猪只睾固酮浓度，睾固酮浓度于一或两次疫苗接种后不超过2.5nmol/l，较佳为2.0、1.87或1.0nmol/l。再者，本发明的方法可增加猪只体重，较佳为增加10％或更多。本发明的组合物可以此领域已知的任何适当方法投予，包含，但不限于，口服或注射，以肌肉注射为优选。本发明的组合物包含一或多个本发明肽免疫原的有效量，以及药学上可接受的载体。适当剂型单位的组合物通常包含每公斤体重约0.5μg至约1mg的肽免疫原。当以多剂量投予，其可以方便地划分为每剂量的适当量。剂量可例如为6.25μg至200μg，较佳为50μg，可通过注射给药，较佳为肌肉注射。此后可重复(加强)剂量。剂量取决于受试者的年龄、体重，以及此疫苗和治疗领域所熟知的一般健康状况。本发明更提供抑制猪只由性成熟所引发的特征的方法，包含投予本发明的疫苗组合物的有效量。在本发明方法中，剂量投予次数与时机并无特别限制。普遍来说，本发明的方法包含至少一剂量，较佳为二、三、四、五剂量或更多，更佳为二剂量或更多。此领域之技术者可轻易知道增加剂量投予次数以引发功效。第一剂可投予任何时期的猪只(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周龄)。疫苗接种时间点可依猪只种类、剂量、佐剂和投予方式而改变或修改。普遍来说，是于3周龄后进行初次免疫(第一剂)，以于3至8周龄为较佳。于初次免疫后3至13周间进行加强免疫(第二剂)为较佳。接种时程表于初免和加强免疫间有3至13周。在一实施例中，较佳的疫苗接种时程表可依据以下事项：于约8周龄进行初次免疫，于约16周龄进行加强免疫，在某些状况下于加强免疫后6至8周屠宰猪只。本发明的初免/加强免疫疫苗接种时程表适用于猪只。其取决于不同国家的生产方法，在许多状况下，猪只并不会生长到21周龄。本发明的特定实施例包含，但不限于，以下事项：(1)用于去势猪只的疫苗组合物，包含肽免疫原以及兽医学上可接受的输送载体或佐剂，其中肽免疫原包含(a)seqidno：1的lhrh肽，以及(b)选自由seqidno：2、3、4以及5组成的群组的至少一th抗原表位，以及，任选地，seqidno：6的免疫刺激肽，其中lhrh肽经由其氨基端残基共价连结至th抗原表位。(2)依据(1)的疫苗组合物，其中lhrh肽、th抗原表位，以及，任选地，免疫刺激肽，是利用gly-gly、εnlys、lys-εnlys、lys-lys-εnlys、lys-lys-lys-εnlys(seqidno：11)、εnlys-lys-lys或εnlys-lys-lys-lys(seqidno：12)加以连接。(3)依据(1)的疫苗组合物，其中肽免疫原包含seqidno：7、8、9和/或10，或其混合物。(4)依据(1)的疫苗组合物，其中兽医学上可接受的佐剂包含isa50、isa50v2或emulsigend。(5)依据(1)的疫苗组合物，其中每一剂量的肽免疫原的总量为约12.5μg至200μg。(6)用以抑制猪只由性成熟所引发的特性的方法，包含投予(1)的疫苗组合物的有效量给猪只。(7)依据(6)的方法，其中特性包含公猪臭、性活动力、性行为、生育力以及发情行为。(8)依据(6)的方法，其中疫苗组合物是以肌肉或皮下注射投予。(9)依据(6)的方法，其中疫苗组合物的第一剂是施用于3周龄至8周龄的猪只。(10)依据(6)的方法，其中疫苗组合物的第二剂是施用于6周龄至16周龄的猪只。本发明的额外的特定实施例包含，但不限于，以下事项：(1)兽医学组合物包含：肽免疫原，选自以下所组成的群组(i)seqidno：7、8以及9的混合物，(ii)seqidno：10，以及(iii)(i)和(ii)的结合；以及兽医学上可接受的输送载体或佐剂。(2)依据(1)的兽医学组合物，其中(a)中的肽免疫原为(i)seqidno：7、8和9的混合物。(3)依据(2)的组合物，其中兽医学上可接受的佐剂包含isa50、isa50v2或emulsigend。(4)依据(2)的组合物，其中每一剂量的肽免疫原的总量为约12.5μg至200μg。(5)用以抑制猪只由性成熟所引发的特性的方法，包含投予(2)的组合物的有效量给猪只。(6)依据(5)的方法，其中特性包含公猪臭、性活动力、性行为、生育力以及发情行为。(7)依据(5)的方法，其中组合物是以肌肉或皮下注射投予。(8)依据(5)的方法，其中组合物的第一剂是施用于3周龄至8周龄的猪只。(9)依据(5)的方法，其中组合物的第二剂是施用于6周龄至16周龄的猪只。(10)用以减少动物睾固酮及其衍生物产量的方法，包含投予(2)的组合物的有效量给动物。(11)依据(1)的兽医学组合物，其中(a)中的肽免疫原为(ii)seqidno：10。(12)依据(11)的组合物，其中兽医学上可接受的佐剂包含isa50、isa50v2或emulsigend。(13)依据(11)的组合物，其中每一剂量的肽免疫原的总量为约12.5μg至200μg。(14)用以抑制猪只由性成熟所引发的特性的方法，包含投予(11)的组合物的有效量给猪只。(15)依据(14)的方法，其中特性包含公猪臭、性活动力、性行为、生育力以及发情行为。(16)依据(14)的方法，其中组合物是以肌肉或皮下注射投予。(17)依据(14)的方法，其中组合物的第一剂是施用于3周龄至8周龄的猪只。(18)依据(14)的方法，其中组合物的第二剂是施用于6周龄至16周龄的猪只。(19)用以减少动物睾固酮及其衍生物产量的方法，包含投予(11)的组合物的有效量给动物。【实施例】实施例1lhrh肽的合成关于有效的lhrh疫苗设计和制剂的开发工作中的lhrh相关肽结构的合成方法于下文描述。此肽可于小规模合成以进行实验室试验和现场研究，以及大规模(公斤)量产以进行工/商业的疫苗制剂生产和血清学测定。设计lhrh相关抗原性肽的大型体系(长度介于约10至40个氨基酸)，以筛选和选择供有效lhrh疫苗使用的最优化肽结构。每一个结构含有合成地连接至特定th抗原表位或免疫刺激肽(记载于表1，seqidno：2至6)的lhrh肽(seqidno：1)。用于本发明lhrh疫苗的lhrh肽为seqidno：7至10。用于侦测及/或测定抗-lhrh抗体的免疫原性的研究或相关血清学试验的所有肽是使用应用生物系统自动肽合成仪(型号430a、431及/或433型)，以fmoc化学法小规模合成。借由在固相支持物上独立合成以制造每一个肽，其在氨基端和侧链具有fmoc保护，用以保护三官能团氨基酸的基团。由固相支持物上切下完整的肽，且借由90％三氟乙酸(tfa)移除侧链保护基团。利用基质辅助激光脱附游离飞行时间(maldi-tof)质谱仪评估合成肽制备以确认其正确氨基酸型式。另外也借由逆相高效能液相层析(rp-hplc)评估每一个合成肽以确认其合成概况和制品浓度。尽管严格控制合成过程(包括阶段性监测耦合效率)，但在延长循环期间的意外的事件(包括氨基酸插入、删除、置换，和提前终止)也制造了肽相似物。因此，合成的制剂通常包含多种肽相似物和目标肽。即使包含这些非预期的肽相似物，得到的合成肽制剂仍然适合免疫学应用(包括免疫诊断(作为抗体捕获抗原)和疫苗接种(作为肽免疫原)的使用)。一般来说，这样的肽相似物，无论是有意设计，或是在合成过程所生成作为副产物的混合物，经常如所欲肽的纯化制剂般有效，只要利用具鉴别力的品质管理程序监控制程和产品评估过程，以保证采用这些肽的最终产品的再现性和效力。数百至千公克量的大规模肽合成可于商业化自动合成仪ubi2003上，以15mmole至50mmole规模，依据相同的固态肽合成原理加以实行。为了获得田间试验中最终疫苗制剂的活性成分，利用浅洗脱梯度以逆相高效能液相层析纯化lhrh肽结构，以maldi-tof质谱仪分析特性，并以氨基酸分析和逆相高效能液相层析分析纯度和一致性。实施例2疫苗制剂的制备三个lhrh肽免疫原(lhrh3：seqidno：7、8和9)的混合物和单一肽免疫原(lhrh1：seqidno：10)分别配制于使用seppic(france)的isa佐剂的油包水(w/o)乳化液，或mvp(usa)的emulsigend的水包油包水(w/o/w)乳化液。简而言之，以等摩尔比率混合在生理食盐水中的肽(20％重量/体积氯化钠溶液)，经无菌过滤(以0.22micron的过滤器)，并以均质方式与isa50v2或emulsigend佐剂混合。全程监测制备过程中的粘度。以鉴别测试(identitytest)、物理测试和无菌试验分析最终产物的特性。在无尘室中进行所有配制、充填和包装程序以维持无菌状态。实施例3利用不同剂量的lhrh3(seqidno：7、8和9)疫苗制剂免疫接种公猪本实施例总共使用40只8周龄的公猪和8只手术去势公猪。如表3和表4所示，这些猪只以每组8只分组，lhrh3(seqidno：7、8和9)以油质基底佐剂(montanidetmisa50v或isa50v2)配制以形成油包水(w/o)乳化液(如表3第1至4组所示)，或以油质基底佐剂emulsigend配制形成水包油包水(w/o/w)乳化液(如表4第8至11组所示)，以加强疫苗产品的免疫原性。三个对照组包含接受生理食盐水的阴性对照组(第5和12组)、接受手术去势的阳性对照组(第6和13组)，以及接受最先进市售lhrh疫苗的功效对照组(第7和14组)。血液样品于初免后(或免疫接种后周数(wpi))0、4、8、10、12、14，和16周收集，分别测量猪只抗-lhrh抗体的血清效价和睾固酮的血清浓度。a.利用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)分析血清抗-lhrh抗体效价开发用于评估抗-lhrh抗体血清效价的酶联免疫吸附分析法如以下所述。除非特别说明，96-孔平底微盘的各孔洞分别以100μl的各目标肽于37℃下涂覆1小时(以各2μg/ml或等摩尔混合物，于10mm的碳酸氢钠缓冲液(ph9.5)中)。涂覆肽的孔洞以250μl含3％(重量)的明胶的pbs于37℃下培育1小时，以阻断非特异性蛋白结合位点，随后以含有0.05％(体积)20的pbs洗涤三次并干燥。将100μl稀释的血清样品加入到每个孔洞中，并于37℃下反应60分钟。随后以含有0.05％(体积)的20的pbs洗涤孔洞六次以移除未结合的抗体。加入100μl预先滴定为最佳稀释浓度的以过氧化酶标示的山羊-抗-猪igg抗体(置于含有1％(体积)的正常山羊血清与0.05％(体积)的20的pbs中)于每个孔洞中，并在37℃下再培育30分钟。这些孔洞以含有0.05％(体积)的20的pbs洗涤六次以移除未结合的抗体，并以100μl受质混合物(含0.04％(重量)的3’,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(tmb)和0.12％(体积)过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中)反应15分钟。此受质混合物借由形成有色的产物以检测过氧化酶标示。加入100μl的1.0m硫酸停止反应并测定于450nm的吸光值(a450)。根据测定lhrh抗体血清效价的目的实行血清稀释。为测定接受lhrh肽疫苗制剂猪只的抗体效价，将血清10倍连续稀释(介于1:10至1:10,000)后，进行酶联免疫吸附分析，且所测定的血清效价以log10表示，其由a450的线性回归分析计算而来。依据图1a和图1b，除了阴性(第5和12组)和手术去势(第6和13组)组，包含seqidno：7、8以及9的试验组证明在加强免疫后两周于10wpi(18周龄)具有高效价的lhrh抗体。接受疫苗接种组别(不仅是配制于isa50v2的组别(第1至4组)，也包括配制于emulsigend的组别(第8至11组))的抗体效价维持于接近或高于3.0(log10)直到16wpi(24周龄)(市场贩售猪只的时间)。相对来说，接受猪只(第7组)的抗体效价只于14wpi(加强免疫后两周)时上升，其抗体效价低于本发明的肽疫苗(第1至4组和第8至11组)。b.血清睾固酮浓度的评估借由市售酶联免疫吸附分析法或放射免疫分析检测血清睾固酮(tt)浓度。此试剂包括睾固酮酶联免疫吸附分析法试剂(型号：eia-5179)、biovendor酶联免疫吸附分析法试剂，以及seamans的放射免疫分析试剂。配制于isa50v2或emulsigend的第1至4组和第8至11组的血清中睾固酮浓度于特定实施例中分别地利用睾固酮酶联免疫吸附分析法试剂加以测定，其与猪只相对应的血清抗体效价呈逆相关，猪只于加强免疫后两周(即10wpi或18周龄)具有低于去势边界值的浓度(去势边界值一般为1.87nmol/l，或更严格的标准为1.0nmol/l)。在配制于isa50v2或emulsigend之所有其他组别的猪只则维持睾固酮的去势程度，如图2a和图2b所示，直到16wpi(即24周龄)，市场上猪只出售的时期。结果显示本发明的lhrh3疫苗制剂对睾固酮具有剂量依赖性抑制，且第4和11组提供相对其他组别更高的抑制程度。与接受疫苗制剂的猪只相比，阴性和去势对照组的猪只总是维持低抗-lhrh抗体效价的背景值水平，于作为未去势动物之阴性对照组(第5和12组)具血清睾固酮浓度波动。对手术去势阳性对照组的猪只(第6和13组)而言，血清睾固酮浓度均保持于低去势程度。接受lhrh疫苗的猪只直到12wpi仍维持高浓度的血清睾固酮，此时给予加强免疫，血清睾固酮浓度于14wpi(即加强免疫后两周)后下降。结果清楚地显示，对猪只去势而言并不如本发明的疫苗制剂(第1至4组和第8至11组，包含配制于isa50v2或emulsigend的seqidno：7、8和9肽)般具有效力。c.体重依据图3a和图3b，全程监测从免疫接种前(3周龄)至本试验结束(16wpi，24周龄)的猪只体重。结果显示疫苗接种对动物体重的影响。阴性对照组(接受生理食盐水)和阳性对照组(接受手术去势)的猪只于24周龄都具有显著较低的平均体重，分别为94.9kg(阴性对照组，第5和12组)和88.8kg(手术去势对照组，第6和13组)。相较于接受手术去势的猪只(第6和13组)，接受200μg/ml/剂量之本发明疫苗制剂的猪只(第4和11组)具有显著较高的经济效益，其于体重增加约27.9％。实施例4利用不同剂量lhrh1(seqidno：10)疫苗制剂免疫接种公猪在本实施例中，使用与实施例3类似的试验方法，除了将疫苗制剂中的肽免疫原改成seqidno：10，并根据表5和表6调整剂量。免疫接种后，在多个时间点收集来自所有动物的血清以测定lhrh抗体效价和血清睾固酮的相对应浓度。此外，在牺牲时，也收集于24周龄猪只的性器官(睾丸和副睾)分析重量。a.利用酶联免疫吸附分析法分析血清抗-lhrh抗体效价依据图4a和图4b，除了阴性(生理食盐水)和阳性(手术去势)对照组，包含seqidno：10之肽免疫原的所有试验组于加强免疫后二周的10wpi(18周龄)具有高效价的抗-lhrh抗体。不仅配制于佐剂isa50v2的第1至4组的猪只，也包括配制于emulsigend的第7至10组的猪只，此抗体效价维持于接近或高于3.0(log10)直到16wpi(24周龄)，即市场上猪只出售的时期。b.血清睾固酮浓度的评估依据图5a和图5b，配制于isa50v2的第1至4组或配制于emulsigend的第7至10组猪只的血清睾固酮浓度均与相对应的抗体效价呈逆相关，且于加强免疫后两周(即10wpi，18周龄)均达到低于去势边界值(<1.87nmol/l)的水准。除了第1和7组的最低剂量，配制于isa50v2或emulsigend的所有其他组别的猪只均维持血清睾酮的去势程度直到16wpi(24周龄)，此为市场上猪只出售的时期。c.体重依据图6a和图6b，全程监测从免疫接种前(3周龄)至本试验结束(16wpi，24周龄)的猪只体重。结果显示疫苗接种对动物体重的影响。接受生理盐水的阴性对照组和接受手术去势的阳性对照组猪只于24周龄都具有显著较低的平均体重，分别为94.9kg(阴性对照组，第5和11组)和88.8kg(手术去势对照组，第6和12组)。相较于接受手术去势的猪只(第6和12组)，接受本发明疫苗制剂的猪只(第4和10组)具有显著较高的经济效益，体重增加约20.3％。实施例5接受不同剂量lhrh1(seqidno：10)疫苗制剂猪只的免疫持续性在本实施例中，使用与实施例3类似的试验方法，除了将肽免疫原改成seqidno：10，且根据表7调整剂量。于免疫接种后，在多个时间点收集血清以测定lhrh抗体效价和相对应的血清睾固酮浓度。此外，在猪只于32周龄牺牲时，收集猪只性器官(睾丸和副睾)测量重量。此试验的目的是延长田间试验至24wpi或32周龄，收集血清样品以测定lhrh抗体效价和相对应的血清睾固酮浓度，用以评估依循标准免疫接种试验方法(于8周龄(0wpi)初免和于16周龄(8wpi)加强免疫)使用本发明疫苗制剂的免疫去势效力的持续性。a.利用elisa分析血清抗-lhrh抗体效价如图7所示，收集来自第1至4组猪只于加强免疫后两周(即10wpi)的血清样品，并测定其抗-lhrh抗体效价。所有样本的抗-lhrh抗体效价均超过3.0(log10)，且此效价在10周的期间，直到20wpi(即28周龄)，仍维持于约3.0(log10)。此外，第2和3组维持抗-lhrh抗体效价于3.0(log10)直到24wpi(即32周龄)。相反地，阴性对照组(第5组)和去势对照组(第6组)的抗体效价总是维持在低浓度的背景值程度。b.血清睾固酮浓度的评估如图8所示，收集第1至4组猪只于加强免疫后两周(即10wpi)的血清样品，并测定血清睾固酮浓度。第1至4组猪只的所有样品因为高效价抗-lhrh抗体的抑制，而具有位于去势程度的血清睾固酮浓度。直到20wpi(即28周龄)，第1至4组的睾固酮浓度皆维持与手术去势对照组(第6组)一样低的程度。c.经lhrh1疫苗制剂免疫去势后的性器官(睾丸和副睾)萎缩在于24wpi(即32周龄)的扩大试验结束时，牺牲猪只并分析其性器官(包括睾丸和副睾)的重量，以评估免疫去势效力。第1至4组猪只的睾丸和副睾萎缩至无功能的尺寸，如图9至图10所示。睾丸和副睾的重量也与血清睾固酮浓度相关。d.体重如图11所示，第1至4组猪只相较于对照组(第5和6组)于体重增加上具有较佳的表现。e.以腹部脂肪的雄甾烯酮和粪臭素浓度衡量公猪臭的消除在试验期间，由试验结束时的公猪臭因子定量证明腹部脂肪的公猪臭的有效消除可延长猪只出售的时期至24wpi(即32周龄)。在此试验中，于猪只牺牲时由腹部脂肪萃取出雄甾烯酮和粪臭素，并以高效能液相层析侦测。参照图12，来自第1至4组猪只脂肪中雄甾烯酮浓度控制于0.5μg/g脂肪以下。特别在第3组，雄甾烯酮的平均值降低到0.1384μg/g脂肪。参照图13，第1至3组猪只的粪臭素浓度控制在0.1μg/g脂肪以下。对第3组猪只而言，其粪臭素的平均值为最低，为0.0514μg/g脂肪。此外，绘制特定样品的个别雄甾烯酮和粪臭素浓度以评估公猪臭的风险因子，如图14所示，将试验所收集的所有样品分成如低度、中度/低度、中度/高度和高度四个区域。依照图14，手术去势组(第6组)总是维持最低浓度的公猪臭因子。来自第3组猪只的样品具有出色表现，其所有样品均分布于低度风险区域直到24wpi。来自第2组猪只的样品具有良好的表现直到24wpi，此时7/8的样品分布于低度风险区域，以及一个样品位于高度风险区域。来自第1组与第2组的样品具有相似表现，其中7/8的样品分布于低度风险区域，且一个样品出现于中度/高度风险区域。相反地，生理食盐水对照组只有2/8样品位于低度风险区域，2/8位于中度风险区域，且4/8位于高度风险区域(图14)。本发明的lhrh1疫苗制剂证实其公猪臭消除效力可持续到24wpi(即32周龄)。本试验结果明确指出，接受不同剂量的本发明lhrh1疫苗制剂的猪只可有效地抑制雄甾烯酮和粪臭素的产生，以消除相对应肉制品的公猪臭。实施例6以lhrh1疫苗制剂于不同时间间隔实行初免与加强免疫的免疫接种时程表对免疫去势的影响在本实施例中，使用与实施例3类似的试验方法，除了使用于疫苗制剂的肽免疫原改成seqidno：10和使用佐剂isa50v2外，根据表8修改初免与加强免疫接种的时间点。收集不同时间点的血清以测定抗-lhrh抗体效价与睾固酮的血清浓度。如图15所示，第1组猪只证实了高度免疫原性，在22周龄猪只测得为3.556(log10)的抗lhrh平均抗体效价，且此效价维持于3.235(log10)直到26周龄。对第2组猪只而言，最高抗体效价为在18周龄的3.526(log10)，且在26周龄时维持在2.869(log10)。对第3组猪只而言，因为在22周龄之晚期加强免疫接种时程表，最高抗体效价为于24周龄(即加强免疫后两周)的3.219(log10)，且效价维持于2.682(log10)直到26周龄。此外，如图16所示，第1组的猪只在20周龄(即加强免疫后两周)时显现免疫去势效应(睾固酮浓度≦1.0nmol/l)，免疫去势效应持续至少6周至26周龄。第2组猪只也显现高度免疫去势效力。第2组猪只的睾固酮浓度于加强免疫后2至6周(即在22周龄)期间为低于1.0nmol/l，且维持相对低浓度(睾固酮浓度≦1.644nmol/l)直到26周龄。于加强免疫后两周，第3组猪只的平均睾固酮浓度为4.535nmol/l。第3组猪只的睾固酮浓度在26周龄抑制至1.968nmol/l。此对猪农有利，因为可于年龄较小的猪只进行疫苗初次免疫，较佳于约3周龄，以方便进行动物管理。猪农也可以对年龄较大的猪只进行加强免疫，因此对工作者提供缓冲时间以免疫猪只。对于猪场实际的免疫去势操作而言，可确保将睾固酮浓度稳定地维持在低的去势程度。本试验的结果指出，本发明疫苗制剂的应用可提早至3至4周龄，以及迟至在18周龄提供加强免疫。初免和加强免疫时程表均可诱导高免疫原性，有效抑制于22至26周龄猪只的血清睾固酮浓度，此为肉品市场上一般猪只出售的时期。实施例7借由lhrh3疫苗制剂消除公猪臭于肉品产业建立谨慎和对消费者友好的方法，设定雄甾烯酮的边界值为0.5μg/g脂肪供公猪臭风险因子的评估。以中度雄甾烯酮水平(0.5-1.0μg/g脂肪)结合低度粪臭素水平(<0.1μg/g脂肪)，或以低度雄甾烯酮水平(<0.5μg/g脂肪)结合中度粪臭素水平(0.1-0.22μg/g脂肪)，表示发生公猪臭的低度风险。当公猪臭的参数(生物标记)均于中度水准(雄甾烯酮0.5-1.0μg/g脂肪；粪臭素0.1-0.22μg/g脂肪)时，表示发生公猪臭的中度风险。当生物标记(雄甾烯酮和粪臭素)同时超过此些边界值时，其意谓着视肉品为具有发生公猪臭的高度风险(表9)。在此实施例中，使用与实施例3类似的试验方法。猪只以配制于佐剂isa50v2的lhrh3(seqidno：7、8和9)的油包水(w/o)乳化液进行免疫接种(如表10所示)。免疫接种后，收集多个时间点的血清以测定血清睾固酮浓度和抗-lhrh抗体效价。此外，收集猪只的组织和器官以测定睾丸和副睾的重量，并利用高效能液相层析测定腹部脂肪的粪臭素和雄甾烯酮量。a.睾丸和副睾的萎缩由不同时间点(即于本研究中分别为10、12、14和16wpi)牺牲的猪只所分离器官的重量，可观察到睾丸和副睾的萎缩(分别如图17a至图17d所示)。以本发明的疫苗制剂(lhrh3)免疫接种时，于本试验期间，在增加浓度的抗-lhrh抗体的抑制性影响下，睾丸和副睾随时间萎缩，于10wpi时的副睾和于12wpi(p<0.05)时的睾丸的重量显著地减少，如图17所示。b.公猪臭的测定由接种的猪只或未去势的公猪收集5g背部脂肪，分别加入1.5ml的100％甲醇。然后将脂肪磨碎直到完全均质化。将脂肪萃取物置于15ml离心管中，并在室温下超音波震荡5分钟。将脂肪萃取物置于冰上冷却15分钟，然后在5℃下以4,000rpm离心20分钟，以分离组织碎片。将上清液转移至另一个1.5ml的离心管中。猪只以疫苗制剂免疫接种后，抗-lhrh抗体的最高效价出现在10wpi(即加强免疫后两周)，睾固酮浓度抑制至接近去势程度，为约或低于1.0nmol/l，其造成之脂肪中雄甾烯酮浓度的减少如图18a所示。接受本发明的lhrh3疫苗制剂猪只的雄甾烯酮浓度为少于0.02至0.53μg/g脂肪，相较之下，接受生理食盐水的阴性对照组猪只的雄甾烯酮浓度为约少于0.02至2.12μg/g脂肪。相对于对照组，其雄甾烯酮浓度于10wpi显著地被抑制(p<0.05)直到16wpi(24周龄)本试验结束。此外，当与阴性对照组的粪臭素浓度(为约0.04至0.36μg/g脂肪)(图19a)比较时，接受本发明的lhrh3疫苗制剂猪只的粪臭素浓度介于约0.004至0.2μg/g脂肪(图19b)。因为常进行猪只食物摄取和代谢衍生物(例如：储存于相对应脂肪组织的粪臭素)的控制，接受本发明的lhrh3疫苗制剂猪只的粪臭素浓度只有于14wpi显著地减少。依照产业结论，当雄甾烯酮和粪臭素二者同时超过边界值(雄甾烯酮：0.5μg/g脂肪；粪臭素：0.22μg/g脂肪)时，其意谓着视肉品为发生公猪臭的高度风险。图19的结果指出，由疫苗接种组别提供的所有脂肪样品于对厌恶气味的敏化评估中属于低度风险区域，其不论于10wpi或于16wpi具有低雄甾烯酮浓度(<0.5μg/g脂肪)和低粪臭素浓度(<0.22μg/g脂肪)；然而，阴性对照组猪只中有约50％的肉品曝露于发生公猪臭的风险中。实施例8本发明lhrh1疫苗制剂的免疫接种时程表的适应性在本实施例中，使用与实施例3类似的试验方法，除了剂量为25μg/2ml之外，以如表11所示配制于佐剂isa50v2以形成油包水(w/o)乳化液的lhrh1(seqidno：10)肽进行免疫接种，且疫苗接种时间点如表11所示。a.利用elisa分析血清抗-lhrh抗体效价实施例初始阶段的抗-lhrh抗体的效价为1.458±0.007(log10)(平均值±标准差)，以其作为背景值。初免和加强免疫接种后(第1至3组)，其抗体效价逐渐增加且均于加强免疫后两周达到最高水准。第1组的平均抗体效价从10wpi的最高水准3.636±0.577(log10)下降到在试验结束时的2.418±0.742(log10)。第2组的平均抗体效价从此四组中的最高水准3.868±0.221(log10)下降到研究结束时的2.806±0.213(log10)。第3组和第4组的抗体浓度曲线相似。此结果显示，第一次免疫接种可优选地于8周龄到3周龄时投予(图20)。b.血清睾固酮浓度的评估如图21所示，所有组别于试验起始阶段的睾固酮浓度为2.943±2.854(平均值±标准差)nmol/l。设定疫苗效力评估的时间点为加强免疫后两周，其通常为免疫去势中最低睾固酮(tt)浓度。基于此观察，第1至4组的平均睾固酮浓度分别为1.265±0.353、1.329±0.636、1.904±2.297以及1.222±0.445(平均值±标准差)nmol/l。借由克-瓦二氏单因子等级变异数分析法(kruskal-wallisonewayanalysisofvarianceonranks)分析，显示组别间不具有统计上显著性差异(p＝0.992)。此外，抗-lhrh抗体效价与睾固酮浓度呈现负相关，具有-0.72的相关系数。在此，在加强免疫后，高抗-lhrh抗体效价造成低睾固酮浓度。为评估免疫持续性，以第3组的猪只表现最佳(即最低睾固酮浓度)，于24周龄的平均血清睾固酮浓度为0.896±0.386nmol/l。第3和4组的间则没有显著差异(p＝0.835)。随时程表推进，睾固酮的浓度增加至1.913±0.930nmol/l(第2组)和4.149±3.603nmol/l(第1组)。通过邓恩法(dunn’smethod)分析，显示第1和3组之间具有显著差异(p＝0.010)。c.性器官测量从12周龄起测量睾丸尺寸(长度和宽度)，并使用下述公式计算体积：睾丸体积＝1/2xaxb2，此处“a”为睾丸的长度“b”为睾丸的宽度性器官的测量包含：(1)活体的睾丸长度和宽度，以及(2)在尸体剖检的睾丸和副睾重量、长度和宽度。根据图22和图23，第1至4组间的成对睾丸重量、成对副睾重量和睾丸长度没有差异。活体的睾丸长度和体积(如图22a和图22b所示)在22周龄前均高度地被抑制。然而，于每一个参数中，第2组猪只均具有最佳结果。于24周龄的雄甾烯酮和粪臭素浓度分布如图24所示。依据讨人喜欢的公猪臭因子浓度的类别，第1、3和4组中87.5％的猪只为“低度风险”，其对人类的味觉和嗅觉并不敏感。第2组的所有猪只落于“低度风险”区域，因此呈现100％有效。d.体重测定本试验中每头猪只的体重。各分组猪只的生长模式类似。台湾市场上贩售猪只的平均重量为约115kg，此可在26周龄前达成。总之，相较分别于8和16周龄实行初免和加强免疫的定期免疫接种计划，本发明的初免时程表可弹性地改变至于3周龄的猪只施用。此外，如本试验所示，加强免疫的时程表可迟至于14至16周龄时施用。实施例9利用lhrh1疫苗制剂分析早期适应性处理在本实施例中，使用与实施例3类似的试验方法，除了于疫苗制剂使用的肽免疫原改成seqidno：10之外，疫苗接种时间点如表12所示。本实施例的目的为评估若疫苗制剂投予非常幼小猪仔时的去势持续性，以及导致性器官萎缩的免疫治疗。此试验可评估非常早期的“弹性治疗方案”，以决定免疫接种方案的最早初免时间。a.血清抗-lhrh抗体效价分析如图25所示，第1组(于3日龄(d3)进行初免，并于3周龄进行加强免疫)于12周龄的平均抗-lhrh抗体效价为2.346±0.451(log10)。另外，第2组(于7日龄进行初免，并于3周龄进行加强免疫)于6周龄的抗-lhrh抗体效价为2.173±0.527(log10)。于这些组别中，只有第3组的猪只(于3周龄进行初次免疫且于6周龄进行加强免疫)于8周龄的抗-lhrh抗体效价高达2.767±0.476(log10)。对在第1至3组的猪只而言，于加强免疫二周后达到最高的抗-lhrh抗体效价之后，第1、2和3组的抗体效价分别高于1.718±0.297、1.765±0.340和1.770±0.283(log10)。第4组猪只于3周龄实行初免，但于16周龄加强免疫。第4和5组的猪只于16周龄进行加强免疫后二周(在18周龄)可达到较高的抗体效价，分别为3.249±0.346和2.893±0.786。接受市售疫苗的猪只(第6组)，抗-lhrh抗体效价在22周龄(即加强免疫后二周)被诱发至高于1.724±0.339(log10)。阳性对照(即接受手术去势的猪只(第7组))和阴性对照(即未接受疫苗接种的猪只(第8组))皆不会引发超过背景水平的抗-lhrh抗体效价，其分别测定数值为1.451±0.006和1.445±0.010(log10)。b.血清睾固酮浓度的评估如图26所描述，第1和2组猪只的血清睾固酮浓度分别减少至最低浓度2.154±0.921nmol/l于10周龄以及2.183±1.231nmol/l于6周龄。第3组于3周龄投予第一剂，且睾固酮浓度曲线与第1和2组相似。第3组的最低睾固酮浓度为于12周龄的3.065±0.205nmol/l。无论是否于3或8周龄投予第一剂，当延迟第4和5组的加强免疫接种至16周龄，第4和5组在20周龄之睾固酮浓度分别抑制至低水准，为约0.586±0.184和0.893±1.192nmol/l。相反地，第6组的猪只依使用说明进行接种，在20周龄猪只的血清中，保持高浓度的睾固酮(约9.415±7.560nmol/l)。对接受手术去势的第7组的猪只而言，每头猪的睾固酮浓度始终保持在背景值(约0.559±0.372nmol/l)。对于未接受疫苗接种以作为阴性对照组(第8组)的猪只而言，试验期间中的平均睾固酮浓度维持在正常浓度(介于3.546±2.409nmol/l和7.380±3.269nmol/l之间)。综上所述，抗-lhrh抗体效价可利用早在3周龄的初免和之后的加强免疫有效地诱导，其维持高抗体效价至试验结束，与依循常规疫苗接种时程表(于8周龄初免和16周龄加强免疫)者具有相似的抗体浓度曲线。因此，于3周龄至8周龄给予初次免疫，而于16周龄给予加强免疫时，血清睾酮浓度可有效地抑制至低水平。因此方便猪农可于3周龄猪只(此时猪只要投予许多其他一般疫苗)实行具弹性的早期阶段免疫去势时程表。实施例10以100μg/ml/剂量的lhrh3疫苗制剂于田间试验(于8和16周龄分别进行初免和加强免疫并在22周龄结束)评估免疫去势效力于台湾南部的猪场施行大规模的田间试验，利用二个gmp批次的lhrh3疫苗制剂于田间试验评估免疫去势效力。在此实施例中，于猪场内准备36头公猪和8至9周龄的8只去势猪只。将猪只分为4组，并于0、8、10、12以及14wpi称重。所有猪只在0和8wpi免疫接种，且于0、8、10、12以及14wpi抽血以测定抗-lhrh抗体的血清效价和血清睾固酮浓度(如表13所示)。牺牲后，测量性器官(睾丸、副睾、精囊和前列腺腺体)重量、背部脂肪厚度和腰眼面积(最长肌)。a.利用elisa分析血清抗-lhrh抗体效价如图27和表14所示，第1和2组猪只的抗-lhrh抗体效价明显高于第3组(未去势对照组(公猪))和第4组(手术去势对照组(阉猪))的猪只。例如，第1组的抗-lhrh抗体效价约为1.52±0.12(log10)至2.90±0.42(log10)，以及第2组的抗-lhrh抗体效价约为1.45±0.01(log10)至3.09±0.37(log10)。相较之下，第3和4组的所有抗-lhrh抗体效价显著地低在第1和2组。b.对免疫去势的血清睾固酮浓度的评估如图28和表15所示，第1和2组所有猪只在以每剂量100μg/ml的lhrh3疫苗制剂免疫接种后，具有100％的免疫去势率。第1和2组所有猪只的睾固酮浓度从8wpi起抑制至非常低的水平，达到免疫去势。试验结果证实本发明的lhrh3疫苗制剂可有效地抑制猪只性成熟的特性。c.于接受疫苗接种猪只的体重增加猪只体重的测定如表16所示。第1和2组猪只体重高于第3组。如图29和表17所示，与去势对照组(第4组)相比，接种疫苗的猪只(第1和2组)的平均日增重(adg)较高。平均日增重增加的主要原因是平均日摄食量(adfi)的增加，而非饲料换肉率(fe)。田间试验的结果证明，本发明的lhrh3疫苗制剂当利用分别于8和16周龄的初免和加强免疫方案以每剂量100μg投予时，可有效地免疫去势及显著地促进公猪生长。此促进生长的结果为猪只可超前常规育种计划二周于市场上贩售，对猪农具有显著的额外经济效益。d.生殖道性器官的萎缩在14wpi(即22周龄)本试验结束时牺牲猪只，对睾丸、副睾、精囊和前列腺称重，以评估免疫去势效力。对第1和2组的猪只而言，生殖道性器官(包括睾丸、副睾、精囊和前列腺)的重量显著地下降(表18)，且这些生殖道性器官萎缩至无功能的尺寸。综上所述，本发明的lhrh肽疫苗制剂具有比市售产品更高的免疫去势效果。于畜牧业领域中，除了因为人道因素将常规的手术去势改变成免疫去势之外，此种免疫去势所造成的显著重量增加还可产生显著的经济效益，故为往后动物去势的趋势。虽然本发明已经通过实施例及较佳实施例加以描述，可被理解的是，本发明并不限于所揭露的实施例。相反的，其意图涵盖各种修改和类似的排列(如对本领域技术人员为显而易见者)。因此，应赋予本案所附的权利要求书最宽的解释，以包含所有此种的修改和类似的排列。所有说明书中所揭示的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示之每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有揭示的特点均只是等同或相似特点的一般系列的实例。由上述可知，熟习此技艺者能轻易地了解本发明的必要特征，在不脱离其精神与范围之下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。表1、lhrh、th抗原表位和协同刺激的侵染素肽结构区域序列表2、本发明lhrh肽免疫原序列表3、配制于isa50v2中的lhrh3制剂的研究设计*周龄；#wpi：疫苗接种后周数(初免后周数)(weekspost(first)immunization)；§lhrh3包含seqidno：7、8以及9的肽。表4、配制于emulsigend中的lhrh3制剂的研究设计*周龄；#wpi：疫苗接种后周数(初免后周数)；§lhrh3包含seqidno：7、8以及9的肽。表5、配制于isa50v2中的lhrh1制剂的研究设计*周龄；#wpi：疫苗接种后周数(初免后周数)；§lhrh1包含seqidno：10的肽。表6、配制于emulsigend中的lhrh1制剂的研究设计*周龄；#wpi：疫苗接种后周数(初免后周数)；§lhrh1包含seqidno：10的肽。表7、免疫持续性的研究设计*周龄；#wpi：疫苗接种后周数(初免后周数)；§lhrh1包含seqidno：10的肽。表8、疫苗接种的时间点疫苗接种：25μg/ml的seqidno：10的肽；b：采血。表9、借由雄甾烯酮和粪臭素的组合的边界值(cut-offvalues)对公猪臭的风险评估表10、公猪臭消除的研究设计*周龄；§lhrh3包含seqidno：7、8以及9的肽。表11、免疫接种适应性研究的时程表表12、早龄适应性研究的时程表日龄；*w:周龄；#wpi：疫苗接种后周数(初免后周数)。表13、免疫持续性的研究设计表14、抗-lhrh抗体的效价分析表15、睾固酮浓度和免疫去势*设定睾固酮的去势程度为在第二次注射后二周(10wpi)≦1.87nmol/l(99％置信区间)。表16、相较于对照组猪只(第3和4组)的接受疫苗制剂猪只(第1和2组)的体重表17、平均日增重、平均日采食量和饲料换肉率组别平均日增重(kg)平均日采食量(kg)饲料换肉率10.9232.4892.69621.0002.6322.63230.9062.2202.45340.8092.2882.828表18、生殖道性器官重量表18(续)、生殖道性器官重量【序列表】<110>美国联合生物医学公司<120>免疫性lhrh组合物及其在猪只中的应用<130>1004263.212wo(2033-wo)<140>tbd<141>2014-07-25<150>pct/us2014048164/<151>2014-07-25<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>10<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(10)<223>lhrh肽<400>1gluhistrpsertyrglyleuargprogly1510<210>2<211>17<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(17)<223>破伤风毒素(aa.830-844)<400>2lyslysglntyrilelysalaasnserlyspheileglyleuthrglu151015leu<210>3<211>17<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(17)<223>麻疹病毒f蛋白质辅助t细胞抗原表位<400>3leusergluilelysglyvalilevalhisargleugluglyvalgly151015gly<210>4<211>15<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(15)<223>b型肝炎表面抗原辅助t细胞抗原表位<400>4phepheleuleuthrargileleuthrileproglnserleuglu151015<210>5<211>19<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(19)<223>结构性合成抗原库(ssal)辅助t细胞抗原表位<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>sort<220><221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>korr<220><221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>gort<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>hort<220><221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>korr<400>5ileserilexaagluilexaaxaavalilevalxaaxaailegluthr151015ileleuphe<210>6<211>16<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>来自侵染素之协同刺激的肽结构区域<400>6thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015<210>7<211>27<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(17)<223>破伤风毒素辅助t细胞抗原表位<220><221>肽<222>(18)..(27)<223>lhrh<400>7lyslysglntyrilelysalaasnserlyspheileglyilethrglu151015leugluhistrpsertyrglyleuargprogly2025<210>8<211>45<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>来自侵染素之协同刺激的肽结构区域<220><221>肽<222>(17)..(18)<223>连接子<220><221>肽<222>(19)..(35)<223>麻疹病毒f蛋白质辅助t细胞抗原表位<220><221>肽<222>(36)..(45)<223>lhrh<400>8thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015glyglyleusergluilelysglyvalilevalhisargleuglugly202530valglyglygluhistrpsertyrglyleuargprogly354045<210>9<211>45<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>来自侵染素之协同刺激的肽结构区域<220><221>肽<222>(17)..(18)<223>连接子<220><221>肽<222>(19)..(33)<223>b型肝炎表面抗原辅助t细胞抗原表位<220><221>肽<222>(34)..(35)<223>连接子<220><221>肽<222>(36)..(45)<223>lhrh<400>9thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015glyglyphepheleuleuthrargileleuthrileproglnserleu202530gluglyglygluhistrpsertyrglyleuargprogly354045<210>10<211>47<212>prt<213>猪<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>来自侵染素之协同刺激的肽结构区域<220><221>肽<222>(17)..(17)<223>epsilonk作为连接子<220><221>肽<222>(18)..(36)<223>结构性合成抗原库1(ssal1)辅助t细胞抗原表位<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>sort<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>rork<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>torg<220><221>misc_feature<222>(29)..(29)<223>torh<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>korr<220><221>肽<222>(37)..(37)<223>epsilonk作为连接子<220><221>肽<222>(38)..(47)<223>lhrh<400>10thralalysserlyslyspheprosertyrthral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