一种靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子及其制备方法与流程

本发明涉及抗癌药物靶向传递技术领域，特别是一种靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子及其制备方法。

背景技术：

当今社会由于环境污染、食品安全问题以及不健康生活方式等因素的影响，使得癌症的发病率正在逐年上升，而治疗方法的不完善使得癌症的死亡率居高不下。虽然近几年来免疫疗法、基因疗法等新兴治疗方法被科学家开发出来，有的已经进入到了临床试验，但是这些方法真正进入实际应用还有很长的路要走，目前对于癌症的治疗手段还仅限于手术、放疗和化疗这些传统疗法。其中化疗方法是术后最常用的肿瘤抑制方法，但是其强烈的毒副作用带给患者很大的痛苦。因此若干新型靶向药物传递体系被开发出来并投入临床应用，展现出了良好的靶向治疗效果和更低的毒副作用，而临床上对于这类新型靶向传递不同药物的传递体系的需求还是十分强烈的。喜树碱是一类十分常见的广谱临床化疗药物，对于治疗结肠癌、胃癌、头颈部癌有很好的疗效，但是其毒副作用也是十分强烈的，包括神经毒性、肝肾毒性和骨髓抑制等。此外，其不良的溶解性能也大大限制了它的应用范围，喜树碱不光不溶于水，也不溶于绝大部分的有机溶剂。故而一系列喜树碱衍生物包括10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康被合成出来用以提高药物活性和增加药物的有机溶剂溶解度。除此之外，喜树碱及其衍生物在碱性水溶液条件下会水解开环继而失活，这也是让医药工作者十分头疼的问题。因此，设计和构筑这样一种既有靶向功能、溶于水环境而又不会被水解，同时能够在病灶内进行酶促药物释放的喜树碱药物传递体系就变的意义重大了。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子及其制备方法，该纳米粒子能够大大增加喜树碱在水中的溶解性、对于癌细胞的选择性和杀伤作用强，不易失活，对正常细胞毒副作用低；其制备方法简单且产率较高，适于放大合成和实际生产应用。

本发明的技术方案：

一种靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子，为基于环糊精修饰喜树碱和金刚烷修饰透明质酸合成的二元超分子组装体，其中金刚烷修饰透明质酸分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₁)₂₃₉(C₂₇H₄₁N₃O₁₁)₃₆，平均一条高分子链上修饰36个金刚烷单元，环糊精修饰喜树碱化学分子式为C₇₃H₁₀₁N₅O₃₉；该二元超分子组装体以环糊精与金刚烷间强的非共价相互作用和分子间的两亲作用，形成以亲水的透明质酸为外壳、疏水的喜树碱为内核的超分子纳米粒子，纳米粒子粒径为70-90nm。

一种所述靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子的制备方法，步骤如下：

1)将分子量为110000的透明质酸溶于二甲基亚砜中，加热至60℃，待透明质酸完全溶解后，将溶液冷却至室温。加入三乙胺，搅拌10分钟后加入氯甲酸乙酯并在室温下搅拌1小时，然后加入N-(2-氨乙基)-1-金刚烷甲酰胺，室温下搅拌反应24小时，然后向反应液中加入蒸馏水进行稀释，将所得溶液装入截留范围为8000-14000的透析袋中连续透析7天，将所得溶液冻干制得金刚烷修饰的透明质酸；

2)将喜树碱悬浮于N,N-二甲基甲酰胺中制成悬浊液，然后依次加入N,N’-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和10-炔基十一酸，避光常温下搅拌24小时。抽滤后将滤液经减压蒸馏除去溶剂后加入三氯甲烷，用水洗涤三次后收集有机相并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂得到十一炔修饰的喜树碱粗品，然后以石油醚和乙酸乙酯混合液为展开剂，该混合液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:3，用200-300目硅胶柱进行分离，制得十一炔修饰的喜树碱纯品；

3)将十一炔修饰的喜树碱和6-脱氧-6-叠氮-β-环糊精溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入五水合硫酸铜，将溶液持续搅拌并升温到65℃，然后加入抗坏血酸钠的水溶液，然后在65℃、氩气保护条件下避光反应24小时，抽滤后将滤液加入到丙酮中搅拌，析出沉淀，然后再进行抽滤得到滤饼，得到环糊精修饰喜树碱的粗品；再以正丙醇、水和25wt％的氨水混合液为展开剂，该混合液中正丙醇、水和25wt％氨水的体积比为6:3:1，用200-300目硅胶柱进行分离，制得环糊精修饰的喜树碱纯品；

4)将步骤1)制得的金刚烷修饰透明质酸溶于水中得到溶液a，将步骤3)制得的环糊精修饰喜树碱溶于二甲基亚砜中得到溶液b，然后将溶液a和溶液b均匀混合，制得靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子。

所述步骤1)中透明质酸与二甲基亚砜的用量比为0.091mmol/L，三乙胺、氯甲酸乙酯和二甲基亚砜的体积比为0.92:0.377:50，透明质酸与N-(2-氨乙基)-1-金刚烷甲酰胺的摩尔比为0.0069:1，处理反应所加的蒸馏水与溶剂二甲基亚砜的体积比为1:1。

所述步骤2)中喜树碱与N,N-二甲基甲酰胺的用量比为40mmol/L，喜树碱、N,N’-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶与10-炔基十一酸的摩尔比为1:1.2:0.2:3。

所述步骤3)中十一炔修饰的喜树碱与N,N-二甲基甲酰胺的用量比为6.5mmol/L，抗坏血酸钠与水的用量比为0.2mol/L，十一炔修饰的喜树碱、6-脱氧-6-叠氮-β-环糊精、五水合硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比为0.195:0.4:0.8:2，溶剂N,N-二甲基甲酰胺与丙酮的体积比为3:40。

所述步骤4)中溶液a中金刚烷修饰透明质酸与水的用量比为14.5μmol/L，溶液b中环糊精修饰喜树碱与二甲基亚砜的用量比为16.7mmol/L，溶液a和溶液b的体积比为100:3。

本发明的优点是：该靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子，利用透明质酸与癌细胞表面过量表达的透明质酸受体间强的抗原-抗体作用，将载有喜树碱的超分子纳米粒子通过细胞的内吞作用特异性地带入到癌细胞当中，从而实现对癌细胞的选择性杀伤而不损伤正常细胞；该靶向药物传递体系在保持了喜树碱抗癌活性的前提下大大降低了对正常细胞的毒副作用；该超分子纳米粒子的制备工艺简单、易于实施且材料成本低，在癌症的靶向治疗领域有较大的应用前景。

附图说明

图1为该超分子纳米粒子HACPTPs的合成路线示意图。

图2为超分子纳米粒子HACPTPs的透射电子显微镜图。

图3为HCT-116细胞的细胞毒性实验结果。

图4为NIH3T3细胞的细胞毒性实验结果。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步的说明：

实施例：

一种靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子，为基于环糊精修饰喜树碱和金刚烷修饰透明质酸合成的二元超分子组装体，其中金刚烷修饰透明质酸分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₁)₂₃₉(C₂₇H₄₁N₃O₁₁)₃₆，平均一条高分子链上修饰36个金刚烷单元，环糊精修饰喜树碱化学分子式为C₇₃H₁₀₁N₅O₃₉；该二元超分子组装体以环糊精与金刚烷间强的非共价相互作用和分子间的两亲作用，形成以亲水的透明质酸为外壳、疏水的喜树碱为内核的超分子纳米粒子，纳米粒子粒径为70-90nm。

所述靶向传递喜树碱超分子纳米粒子的制备方法，步骤如下：

1)将500mg(4.5μmol)分子量为110000的透明质酸溶于50mL二甲基亚砜中，加热至60℃，待透明质酸完全溶解后，将溶液冷却至室温。加入0.92mL三乙胺，搅拌10分钟后加入0.377mL氯甲酸乙酯，室温下搅拌1小时。然后加入146.6mg(0.66mmol)N-(2-氨乙基)-1-金刚烷甲酰胺，室温下搅拌反应24小时。向反应液中加入50mL蒸馏水进行稀释，将所得溶液装入截留范围为8000-14000的透析袋中连续透析7天，将所得溶液冻干，制得金刚烷修饰的透明质酸；

检测显示制备的金刚烷修饰透明质酸的核磁表征如下：¹H NMR(400MHz,D₂O,TMS,ppm):δ＝1.51-1.75(m,1.61H),1.90(s,3.3H),3.05-3.99(m,10.62H),4.24-4.63(m,2H)。通过对核磁谱图积分计算可以得到金刚烷修饰透明质酸的分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₁)₂₃₉(C₂₇H₄₁N₃O₁₁)₃₆，平均一条高分子链上修饰36个金刚烷单元。

2)将348.4mg(1mmol)喜树碱悬浮于25mL的N,N-二甲基甲酰胺中制成悬浊液，然后依次加入247.4mg(1.2mmol)N,N’-二环己基碳二亚胺、25mg(0.2mmol)4-二甲氨基吡啶和546.9mg(3mmol)10-炔基十一酸，避光常温下搅拌24小时，抽滤后将滤液经减压蒸馏除去溶剂后加入100mL三氯甲烷，用100mL水洗涤三次后收集有机相并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂得到十一炔修饰的喜树碱粗品，然后以石油醚和乙酸乙酯混合液为展开剂，该混合液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:3，用200-300目硅胶柱进行分离，制得十一炔修饰的喜树碱纯品；

检测显示制备的十一炔修饰喜树碱的核磁表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ＝0.95-0.99(t,J＝7.5Hz,3H),1.25-1.44(m,10H),1.63-1.66(m,2H),1.90-1.92(t,J＝2.6Hz,1H),2.07-2.32(m,4H),2.46-2.51(m,2H),5.29(s,2H),5.39-5.44(ABq,J＝17.2Hz,1H),5.66-5.70(ABq,J＝17.2Hz,1H),7.22(s,1H),7.66-7.69(t,J＝7.4Hz,1H),7.82-7.86(t,J＝7.6Hz,1H),7.94-7.96(d,J＝8.3Hz,1H),8.20-8.23(d,J＝8.5Hz,1H),8.40ppm(s,1H)。ESI-MS:513.24[M+H]⁺。

3)将100mg(0.195mmol)十一炔修饰的喜树碱和464mg(0.4mmol)6-脱氧-6-叠氮-β-环糊精溶于30mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入200mg(0.8mmol)五水合硫酸铜，将溶液持续搅拌并升温到65℃，然后加入400mg(2mmol)抗坏血酸钠的10mL水溶液，然后在65℃、氩气保护条件下避光反应24小时。抽滤后将滤液加入到400mL丙酮中搅拌，析出沉淀，然后再进行抽滤得到滤饼，得到环糊精修饰喜树碱的粗品，再以正丙醇、水和25wt％的氨水混合液为展开剂，该混合液中正丙醇、水和25wt％氨水的体积比为6:3:1，用200-300目硅胶柱进行分离，制得环糊精修饰的喜树碱纯品；

检测显示制备的环糊精修饰喜树碱的核磁表征如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,TMS):δ＝0.90-1.57(m,19H),2.08-2.25(m,3H),3.56-4.01(m,42H,H of C3,C5,C6,C2,C4inβ-CD),4.46-4.51(m,6H,H of C6-OH inβ-CD),4.76-4.83(m,7H,H of C1inβ-CD),5.26-5.37(m,2H),5.43-5.49(m,2H),5.70-5.78(m,14H,H of C2-OH and C3-OH inβ-CD),7.06(s,1H),7.70-7.77(m,2H),7.84-7.88(t,J＝7.4Hz,1H),8.11-8.17(m,2H),8.70ppm(s,1H)。ESI-MS:1672.6129[M+H]⁺。通过核磁及质谱表征可以得到制得的环糊精修饰喜树碱化学分子式为C₇₃H₁₀₁N₅O₃₉。

4)将1.62mg(0.014μmol)金刚烷修饰透明质酸(HA-ADA)溶于1mL水中得到溶液a，将0.84mg(0.5μmol)环糊精修饰喜树碱(CPT-CD)溶于30μL二甲基亚砜中得到溶液b，然后将溶液a和溶液b均匀混合，制得靶向传递喜树碱的超分子纳米粒子(HACPTPs)。

图1为该超分子纳米粒子HACPTPs的合成路线示意图。

图2为超分子纳米粒子HACPTPs的透射电子显微镜图，通过透射电子显微镜表征可以得出该超分子纳米粒子以环糊精与金刚烷间强的非共价相互作用和分子间的两亲性作用，形成以亲水的透明质酸为外壳，疏水的喜树碱为内核的超分子纳米粒子，纳米粒子粒径大小为70-90nm。

本发明的具体应用效果如下：

将HCT-116细胞(人类结肠癌细胞)铺在含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基的96孔板中培养24小时，将NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)铺在含有10％胎牛血清的DMEM培养基的96孔板中培养24小时，然后分别加入喜树碱(CPT)，环糊精修饰喜树碱(CPT-CD)，超分子纳米粒子(HACPTPs)，含有过量透明质酸(HA)的HACPTPs，以及金刚烷修饰透明质酸(HA-ADA)，连续培养24小时。用MTT法测量各个实验条件下的细胞生存率。

图3为HCT-116细胞的细胞毒性实验结果，图中表明：在24小时范围内，HACPTPs展现出了与CPT和CPT-CD相近的对HCT-116肿瘤细胞的抑制作用，当加入过量的透明质酸将细胞表面透明质酸受体饱和后，超分子纳米粒子HACPTPs对HCT-116细胞的杀伤作用大大降低，证明这种癌细胞杀伤抑制作用源于癌细胞表面HA受体为媒介的内吞作用将该纳米粒子带入到癌细胞中。

图4为NIH3T3细胞的细胞毒性实验结果，如图4所示，CPT和CPT-CD对其有很大的杀伤作用，然而由于正常细胞表面透明质酸受体的表达远远小于癌细胞，因此HACPTPs对于正常细胞的毒副作用很小，从而实现了在保护正常细胞的前提下对癌细胞的选择性杀伤。