一种乳腺癌联合化疗用纳米复合石墨烯水凝胶体系及其制备方法与流程

本发明涉及纳米材料领域和生物技术领域，具体涉及一种具有双重响应性、乳腺癌联合化疗的纳米复合石墨烯水凝胶体系及其制备方法。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国乳腺癌占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，发病率约为18.7人/10万人，近年来增长趋势明显。

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是从短叶红豆杉树皮中分离得到的一种二萜类化合物，水溶性较差，属疏水性药物。它是一种新型的微管稳定剂，它通过诱导和促进微管蛋白聚合，稳定微管而阻止肿瘤细胞的繁殖，临床研究显示紫杉醇治疗乳腺癌具有较好的疗效。表阿霉素(epirubicin，EPI)是阿霉素的半合成衍生物，能溶解在水中，属亲水性药物。在剂量相同和采取相同的给药方式时，表阿霉素和阿霉素抗瘤谱相近，但是表阿霉素对转移性肿瘤的疗效稍高于阿霉素，具有对心脏毒性减低，同时治疗指数增高。相关临床资料显示，紫杉醇在对复发转移性乳腺癌初治时有效率可以达到32％～60％，而对阿霉素具有耐药的复发性转移乳腺癌的有效率也能够达到21％～32％，同时紫杉醇与表阿霉素不存在交叉耐药，并且具有协同抗肿瘤作用，两药联合治疗转移性乳腺癌有效率为50％～70％，完全缓解率12％～15％。临床研究已将表阿霉素和紫杉醇的联合应用作为乳腺癌化疗的首选方案，但存在确定药物用量等不确定因素的影响。

水凝胶是一种能够在水中溶胀并保持大量水而又并不溶解的亲水性聚合物，通过共价键、氢键或范德华力等作用相互交联构成三维网状结构。pH/温度敏感水凝胶是一种既能响应环境温度刺激，又能响应环境pH变化发生体积相变的亲水性聚合物网络。合成该凝胶的原料(单体或聚合物)通常为两种或两种以上，其中一种单体或聚合物在水凝胶中对温度发生响应，而另一种单体或聚合物在水凝胶中对pH值产生应答。

石墨烯是2004年被发现的一种新型二维平面纳米材料，其特殊的单原子层结构决定了它具有丰富而新奇的物理性质。由于石墨烯具有单原子层结构，其比表面积很大，非常适合用作药物载体。但结构完整的石墨烯化学稳定性高，其表面呈惰性状态，必修对其进行有效的功能化才能进一步应用。为了改善水凝胶的机械强度，已有研究报道将石墨烯作为添加剂参与水凝胶的合成过程。

CN201110458092.4公布了一种氧化石墨烯/聚(N-异丙基丙烯酰胺)复合水凝胶的制备方法，首先制成氧化石墨烯胶体溶液，然后向氧化石墨烯胶体溶液中加入N-异丙基丙烯酰胺、 交联剂、引发剂发生聚合反应，得到复合水凝胶。该复合水凝胶具有良好的温度响应性与力学性能，在药物控释方面具有广泛的应用前景。

CN201410378230.1公布了一种氧化石墨烯/壳聚糖接枝型双网络水凝胶的制备方法，首先合成氧化石墨烯/壳聚糖接枝水凝胶第一层网络，第二网络穿插在第一网络的内部，在紫外光照射下合成双网络水凝胶。该水凝胶不仅保持了传统水凝胶优异的物理性能，而且获得了较高的压缩强度和拉伸强度，提高了该双网络水凝胶在生物医药领域的应用潜力。

目前为止，国内外尚未见纳米复合石墨烯水凝胶同时运载表阿霉素(亲水性)和紫杉醇(疏水)两种抗癌药物并用于乳腺癌联合化疗的报道。本发明开发了一种具有pH/温度双重响应性，可以同时运载表阿霉素和紫杉醇的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系，并进行其对乳腺癌MCF-7的抗癌活性研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有pH/温度双重响应性，可以同时运载乳腺癌联合化疗药物紫杉醇和表阿霉素的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系的制备方法。该方法合成的纳米复合石墨烯药物载体呈三维多孔立体结构，生物相容性好、药物负载量高等优点，在纳米药物载体领域具有广泛的应用。

为达到本发明的目的，本发明的技术方案包括以下步骤：

步骤1：采用两亲性聚合物PF127修饰，并用水合肼将氧化石墨烯还原为石墨烯，进而负载疏水性药物PTX，得到负载疏水性药物紫杉醇的石墨烯PTX@GN；

步骤2：将PTX@GN作为添加剂，再选用温敏性的N-异丙基丙烯酰胺NIPAM单体为第一网络，通过自由基聚合反应制备得到单网络水凝胶GSL；再选用pH响应性的丙烯酸AA单体作为第二网络，通过紫外辐照的方法合成pH/温度双重响应性的纳米复合石墨烯双网络水凝胶GDL；

步骤3：将纳米复合石墨烯水凝胶再负载亲水性药物表阿霉素EPI，得到负载双重药物PTX和EPI的纳米复合石墨烯水凝胶双载药体系EPI@PTX@GDL；

步骤4：对单载表阿霉素双网络水凝胶体系EPI@GDL、单载紫杉醇的石墨烯体系PTX@GN、纳米复合石墨烯水凝胶双载药体系EPI@PTX@GDL都进行了细胞毒性实验，将其与乳腺癌MCF-7细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性，并用荧光显微镜进行观察活细胞形态。

具体步骤为：

步骤1：采用两亲性聚合物PF127修饰氧化石墨烯，并用水合肼将氧化石墨烯还原为石墨烯，进而负载疏水性药物PTX，得到负载疏水性药物紫杉醇的石墨烯(PTX@GN)。

将300～400mg PF127加入到10～20mL，0.5～1.5mg/mL石墨烯(GO)水溶液中，室温搅拌下加入300～500μL水合肼，于30～50℃下超声搅拌反应12～36h，将氧化石墨烯(GO)还原为石墨烯(GN)。反应结束后将混合液进行压滤即得PF127修饰的石墨烯。将0.008～0.012g PF127修饰的GN加入到20～40mL，0.8～1.2mg/mL PTX的PBS缓冲液中，25℃下避光搅拌14～18h，离心并洗涤，冷冻干燥得到载紫杉醇的石墨烯(PTX@GN)。

步骤2：将PTX@GN作为添加剂，再选用温敏性的NIPAM为第一网络单体，通过自由基聚合反应制备得到单网络石墨烯水凝胶(graphene single-network hydrogel,GSL)；然后选用pH响应性AA作为第二网络单体，通过紫外辐照的方法合成pH/温度双重响应性的纳米复合石墨烯双网络水凝胶(graphene double-network hydrogel,GDL)。

将0.8～1.2g NIPAM、0.01～0.03g PTX@GN、0.01～0.03g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于8～12mL水中，在冰水浴中持续搅拌1～3h至单体完全溶解。然后加入10～30μL促进剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，继续搅拌5～15min。最后，称取0.01～0.03g过硫酸胺(APS)加入溶液中，搅拌至溶解，将溶液移放至18～22℃的水浴中静置22～26h，得到第一网络水凝胶GSL。将制备得到的第一网络水凝胶用去离子水洗涤，置于0.04～0.06g2-氧代戊二酸(2-OG)、0.01～0.03g BIS、1～3mol/L的AA溶液中，静置44～52h后紫外辐照8～12h(灯与凝胶间距18～22cm)，得双重响应性双网络纳米复合石墨烯水凝胶GDL。

步骤3：纳米复合石墨烯水凝胶对表阿霉素的负载

将7～8mg EPI和150～170mg纳米复合石墨烯水凝胶添加到20～40mL的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，室温避光振荡22～26h后，离心并洗涤，得到负载双重药物PTX和EPI的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系(EPI@PTX@GDL)。

为了更好地进行对比实验，步骤2中可直接将PF127修饰的GN作为添加剂，合成出不载紫杉醇的纳米复合石墨烯水凝胶GDL，再进行负载表阿霉素的实验，就可以得到负载表阿霉素单药的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系(EPI@GDL)。

步骤4：对a.空白石墨烯双网络水凝胶GDL、b.空白石墨烯GN、c.双网络水凝胶单载表阿霉素体系EPI@GDL、d.石墨烯单载紫杉醇体系PTX@GN、e.双网络石墨烯水凝胶双载药体系(EPI@PTX@GDL)都进行了细胞毒性实验，将其与乳腺癌MCF-7细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性。

(1)在装有上述各载体的EP管中，加入100μL75％乙醇消毒，12000rpm/min，离心5min，随后用PBS清洗，离心，重复2次，备用。

(2)将MCF-7细胞培养于DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO₂恒温培养箱中贴壁培养，每2～3天换液体一次，每3～5天传代一次。当细胞贴壁生长密度达到80％～90％后，弃 去细胞培养基，加入2mL PBS洗涤2次，弃去PBS，加入2mL含有0.25％的胰蛋白酶与0.02％EDTA的消化液消化，消化30～60s后弃去大部分消化液，剩下的消化液再继续消化大约l～2min；镜下观察，细胞完全从细胞壁上分离并尽可能吹打成单个细胞，将细胞的密度调到1×10⁴个/mL，然后加入细胞瓶或者培养板中传代培养。

(3)称取25mg MTT(3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，噻唑蓝，Sigma公司)溶于5mL PBS，配成浓度为5mg/mL的MTT溶液。用0.22μm多孔滤膜过滤灭菌，用前现配。将对数期生长的MCF-7细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，培养24h后，分别加入不同浓度的上述载体，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入20μL、5mg/mL的MTT溶液，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡10min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算：

细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％

取25mg荧光素二乙酸酯(Fluorescein Diacetate，FDA)溶于5mL丙酮中配制成母液，使用时将母液按1：1000的体积比稀释于PBS中。MCF-7细胞用5μg/mL的FDA/PBS溶液孵育10min，在这个过程中，FDA进入活细胞膜，在488nm的激发下发出荧光。培养3天后的活细胞通过荧光显微镜(Zeiss Axovert 200)观察。

所述步骤1中，所述的PF127质量优选400mg，石墨烯质量浓度优选1.0mg/mL，水合肼体积优选400μL。PF127修饰GN的质量优选0.01g，PTX药物的浓度优选1mg/mL。

所述步骤2中，NIPAM质量优选1g，PTX@GN质量优选0.02g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)质量优选0.02g。丙烯酸AA的浓度优选2mol/L。紫外辐照时间优选10h。灯与凝胶间距优选20cm。

所述步骤3中，EPI的质量优选7.5mg，纳米复合石墨烯水凝胶GDL的质量优选160.9mg，PBS体积优选30mL，室温振荡时间优选24h。

本发明所取得的有益效果：

(1)本发明通过紫外辐照法，合成了一种具有pH/温度双重响应性，可以同时运载乳腺癌联合化疗药物紫杉醇和表阿霉素的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系GDL，制备方法操作简单，实验条件温和。

(2)本发明该方法合成的纳米复合石墨烯水凝胶呈三维多孔立体结构，具有生物相容性好、双重响应性、药物负载量高等优点，在纳米药物载体领域具有广泛的应用。

(3)本发明首次采用纳米复合石墨烯水凝胶同时负载乳腺癌联合化疗药物PTX和EPI， 尚未见到有探讨石墨烯水凝胶对乳腺癌MCF-7细胞毒性的研究报道。本发明合成的纳米复合石墨烯水凝胶在用量较少的情况下10μg/mL就表现出对MCF-7乳腺癌细胞较好的抑制作用。

附图说明

图1为具体实施例所制备的样品的FTIR图谱：a.石墨烯单网络水凝胶GSL；b.石墨烯双网络水凝胶GDL。

图2为具体实施例所制备样品的SEM图：a.氧化石墨烯(GO)；b.石墨烯单网络水凝胶GSL；c.d.石墨烯双网络水凝胶GDL，为双网络水凝胶GDL不同放大倍数5000倍和2000倍的SEM图片。

图3为石墨烯双网络水凝胶GDL在不同温度下的溶胀曲线：a.25℃；b.37℃；c.50℃。

图4为石墨烯双网络水凝胶GDL在水中的溶胀度与温度的关系图。

图5为石墨烯双网络水凝胶GDL在不同pH值缓冲溶液中溶胀度与pH值的关系图。

图6为具体实施例所制备的石墨烯双网络水凝胶GDL在保持T＝25℃不变，分别在pH＝5.4和pH＝7.4条件下所测的药物缓释曲线：(A)EPI；(B)PTX。

图7为具体实施例所制备的石墨烯双网络水凝胶GDL在保持pH＝5.4不变，分别在T＝25℃、T＝37℃条件下所测的药物缓释曲线：(A)EPI；(B)PTX。

图8为MCF-7细胞加入样品后的细胞毒性图：a.空白双网络水凝胶GDL、b.空白石墨烯GN、c.双网络水凝胶单载表阿霉素体系EPI@GDL、d.石墨烯单载紫杉醇体系PTX@GN、e.双网络石墨烯水凝胶双载药体系(EPI@PTX@GDL)。

图9为MCF-7细胞加入不同浓度载药体系后的荧光显微镜图片：a.0μg/mL；b.10μg/mL(b-1.EPI@GDL；b-2.PTX@GN；b-3.EPI@PTX@GDL)；c.100μg/mL(c-1.EPI@GDL；c-2.PTX@GN；c-3.EPI@PTX@GDL)；d.500μg/mL(d-1.EPI@GDL；d-2.PTX@GN；d-3.EPI@PTX@GDL)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例对本发明的保护范围并无明确限制。

实施例1

步骤1：单载紫杉醇的石墨烯体系的制备(PTX@GN)

将0.12g的GO加入到100mL1％的CTAB蒸馏水溶液中，在冰浴中超声分散30min后，搅拌6h，于10000r min^-1下离心分离，并用蒸馏水多次离心洗涤。将产物与0.24g的PSS溶液200mL混合，超声分散30min，搅拌6h，继续用蒸馏水离心清洗2～3次，于40℃真空干燥，所得样品即为表面带负电荷的改性氧化石墨烯f-GO。

将400mg的PF127加入到15mL，1.0mg/mL的f-GO水溶液中，室温搅拌下加入400μL的水合肼，于40℃下超声搅拌反应24h，将氧化石墨烯(GO)还原为石墨烯(GN)。反应结束后将混合液进行压滤即得PF127修饰的GN。将PF127修饰的GN加入到30mL，1mg/mLPTX的PBS缓冲液中，25℃下避光搅拌16h，离心并洗涤，冷冻干燥得到载紫杉醇的石墨烯(PTX@GN)。

步骤2：负载PTX的纳米复合石墨烯水凝胶的制备

将1.0g NIPAM、0.02g PTX@GN、0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于10mL水中，在冰水浴中持续搅拌2h至单体完全溶解。然后加入20μL促进剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，继续搅拌10min。最后，称取0.02g过硫酸胺(APS)加入溶液中，搅拌至溶解，将溶液移放至20℃的水浴中静置24h，得到第一网络水凝胶。将制备得到的第一网络水凝胶用去离子水洗涤，置于0.05g 2-氧代戊二酸(2-OG)、0.02g BIS、2.0mol/L的AA溶液中，静置48h后紫外辐照10h(灯与凝胶间距20cm)，得双重响应性双网络纳米复合石墨烯水凝胶GDL。

步骤3：纳米复合石墨烯双载药体系的制备(EPI@PTX@GDL)

将7.5mg EPI和160.9mg纳米复合石墨烯水凝胶添加到30mL的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，室温避光振荡24h后，离心并洗涤，得到负载双重药物PTX和EPI的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系(EPI@PTX@GDL)。

步骤4：药物载体的细胞毒性评价

将对数期生长的MCF-7细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，每孔200μL(细胞的密度1×104个/mL)，培养24h后，分别加入不同浓度的载体：单载紫杉醇的石墨烯体系(PTX@GN)、双网络石墨烯水凝胶双载药体系(EPI@PTX@GDL)。载体浓度分别为(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基的MCF-7作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡10min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算:细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％。

取25mg荧光素二乙酸酯(Fluorescein Diacetate，FDA)溶于5mL丙酮中配制成母液，使用时将母液按1：1000的体积比稀释于PBS中。MCF-7细胞用5μg/mL的FDA/PBS溶液孵育10min，在这个过程中，FDA进入活细胞膜，在488nm的激发下发出荧光。培养3天后的活细胞通过荧光显微镜(Zeiss Axovert 200)观察。

实施例2

为了更好地进行对比实验，步骤2中可直接将PF127修饰的GN作为添加剂合成出不载紫杉醇的纳米复合石墨烯水凝胶GDL，再进行负载表阿霉素的实验，就可以得到负载表阿霉素单药的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系(EPI@GDL)。

步骤1：PF127修饰石墨烯体系的制备(空白GN载体)

将0.12g的GO加入到100mL1％的CTAB蒸馏水溶液中，在冰浴中超声分散30min后，搅拌6h，于10000r min^-1下离心分离，并用蒸馏水多次离心洗涤。将产物与0.24g的PSS溶液200mL混合，超声分散30min，搅拌6h，继续用蒸馏水离心清洗2～3次，于40℃真空干燥，所得样品即为表面带负电荷的改性氧化石墨烯f-GO。

将400mg的PF127加入到15mL，1.0mg/mL的f-GO水溶液中，室温搅拌下加入400μL的水合肼，于40℃下超声搅拌反应24h，将氧化石墨烯(GO)还原为石墨烯(GN)。反应结束后将混合液进行压滤即得PF127修饰的GN。

步骤2：纳米复合石墨烯水凝胶的制备(空白GDL载体)

将1.0g NIPAM、0.02g GN、0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于10mL水中，在冰水浴中持续搅拌2h至单体完全溶解。然后加入20μL促进剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，继续搅拌10min。最后，称取0.02g过硫酸胺(APS)加入溶液中，搅拌至溶解，将溶液移放至20℃的水浴中静置24h，得到第一网络水凝胶。将制备得到的第一网络水凝胶用去离子水洗涤，置于0.05g 2-氧代戊二酸(2-OG)、0.02g BIS、2.0mol/L的AA溶液中，静置48h后紫外辐照10h(灯与凝胶间距20cm)，得不负载紫杉醇的双重响应性双网络纳米复合石墨烯水凝胶GDL。

步骤3：单载EPI的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系的制备(EPI@GDL)

将7.5mg EPI和160.9mg纳米复合石墨烯水凝胶添加到30mL的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，室温避光振荡24h后，离心并洗涤，得到单载EPI的纳米复合石墨烯水凝胶载药体系(EPI@GDL)。

步骤4：

将对数期生长的MCF-7细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，每孔200μL(细胞的密度1×104个/mL)，培养24h后，分别加入不同浓度的载体空白石墨烯双网络水凝胶GDL、空白石墨烯GN、单载表阿霉素双网络水凝胶体系EPI@GDL。载体浓度分别为(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基的MCF-7作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基， 然后每孔加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡10min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算:细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％。

取25mg荧光素二乙酸酯(Fluorescein Diacetate，FDA)溶于5mL丙酮中配制成母液，使用时将母液按1：1000的体积比稀释于PBS中。MCF-7细胞用5μg/mL的FDA/PBS溶液孵育10min，在这个过程中，FDA进入活细胞膜，在488nm的激发下发出荧光。培养3天后的活细胞通过荧光显微镜(Zeiss Axovert 200)观察。

对制备过程中的中间产物及本发明最终产物进行性能分析。

纳米复合石墨烯水凝胶的性能测试

(1)溶胀性能测试：

将干燥后的凝胶切成小片，准确称重。将切好的干凝胶小片分别放在不同温度下的蒸馏水中，每隔一段时间取出称重，直至凝胶恒重。凝胶各时刻的溶胀度(swelling rate，SR)可由式①计算：

SR＝(Ws-Wq)/Wq ①

式中：Ws为凝胶吸水一段时间后的质量；Wq为干凝胶的干重。

(2)温敏性测试：

将干燥后的凝胶切成2mm×1cm×1cm的小片，准确称重，放入容器中。将容器置于水浴锅中，逐渐升高温度，每隔一段温度区间取出水凝胶并擦干表面水分后称重，直至凝胶恒重。凝胶各时刻的溶胀度可由式②计算：

SR＝W_m/W₀×100％ ②

式中：W_m为凝胶在不同温度区间达到溶胀平衡时的质量；W₀为干凝胶的初始质量。

(3)pH敏感性测试

将干燥后的凝胶切成2mm×1cm×1cm的小片，准确称重。放入不同pH值的溶液中，浸泡48h后取出擦干表面水分，称重。凝胶的溶胀度可由式③计算：

SR＝W_n/W₀×100％ ③

式中：W_n为凝胶在不同pH溶液中达到溶胀平衡时的质量；W₀为干凝胶的初始湿重。

纳米复合石墨烯水凝胶载药体系的缓释研究：

(1)表阿霉素和紫杉醇标准曲线的绘制

紫杉醇标准曲线的绘制：

精确称量紫杉醇5.00mg置于l00mL容量瓶中，用含0.1％(w/v)Tween 80的PBS溶解，并稀释成一系列已知浓度的溶液，用紫外-可见分光光度计测定这些溶液在230nm处的吸光度，以吸光度对药物浓度作图，得到紫杉醇的吸光度-浓度标准曲线，该标准曲线的方程为: Y＝16.032X+0.0766，(相关系数R²＝0.981)。借助包封率衡量体系的载药能力，载药率＝(药物的质量/投药量)×100％，计算出紫杉醇的包封率为72.6％。

表阿霉素标准曲线的绘制：

精确称量表阿霉素5.00mg置于l00mL容量瓶中，用PBS溶解，并稀释成一系列已知浓度的溶液，用紫外-可见分光光度计测定这些溶液在480nm处的吸光度，以吸光度对药物浓度作图，得到表阿霉素的吸光度-浓度标准曲线，该标准曲线的方程为:Y＝18.483X+0.0615，(相关系数R²＝0.999)。借助包封率衡量体系的载药能力，载药率＝(药物的质量/投药量)×100％，计算出表阿霉素的包封率为67.0％。

(2)纳米复合石墨烯水凝胶载药体系在不同温度下的缓释研究

将载药后的水凝胶分别放在不同温度的PBS缓冲溶液中，然后放入摇床中缓释，每隔一段时间从摇床取3mL缓冲液，并加入3mL新的缓冲液，持续缓释48h。记录每次取样时间，并利用紫外分光光度计和标准曲线计算纳米复合石墨烯水凝胶的药物累计释放率。

通过线性回归方程得到各个时间点样品的浓度，根据以下公式计算药物累积释放率并得到其关于时间的曲线。W_n＝(50C_n+3×∑C_n-1)/m₀×100％，其中W_n表示第n次药物的累积释放率，C_n是第n次取样的质量浓度，m₀是载药体系中药物的质量。

(3)纳米复合石墨烯水凝胶载药体系在不同pH下的缓释研究

将载药后的纳米石墨烯水凝胶载药体系分别放在不同pH值的PBS缓冲溶液中，然后放入摇床中缓释，每隔一段时间从摇床取3mL缓冲液，并加入3mL新的缓冲液，持续缓释48h。记录每次取样时间，并利用紫外分光光度计和标准曲线计算纳米复合石墨烯水凝胶载药体系的药物累计释放率。

图1为具体实施例所制备的样品的FTIR图谱：a.石墨烯单网络水凝胶GSL；b.石墨烯双网络水凝胶GDL。图1a中，1637cm^-1为NIPAM中C＝O的伸缩振动峰(酰胺I)，1540cm^-1为N-H弯曲振动峰(酰胺II)，1050cm^-1是NIPAM中C-OH的伸缩振动峰，这表明成功合成了以PNIPAM作为第一网络的水凝胶。对比图1a，图1b中在1720cm^-1处出现了新峰，它对应着AA上羧基的特征吸收峰。这意味着在交联过程中，AA上的很多-COOH未参与反应，这些基团为水凝胶的pH响应性提供了有力的保证。

图2为具体实施例所制备样品的SEM图：a.氧化石墨烯(GO)；b.石墨烯单网络水凝胶GSL；c.d.石墨烯双网络水凝胶GDL，为双网络水凝胶GDL不同放大倍数5000倍和2000倍的SEM图片。从图2a中可明显看出改性后氧化石墨烯具有类似的层状结构，分布较均匀，无明显团聚现象。从图2b可以看出单网络水凝胶GSL具有呈三维多孔结构。从图2c和2d为双网络水凝胶GDL不同放大倍数5000倍和2000倍的SEM图片，可以看出成功合成了相 互贯穿的双网络水凝胶GDL。对比图2b，随着凝胶组成中丙烯酸AA的加入增加了水凝胶结构的相对交联密度，双网络水凝胶具有更加致密的孔洞结构。而且所制备的双网络水凝胶具有相互贯穿的孔洞结构，由于孔洞结构的存在，为水分子的进出提供了通道，有利于水凝胶的快速溶胀与退溶胀。

图3为石墨烯双网络水凝胶GDL在不同温度下的溶胀曲线：a.25℃；b.37℃；c.50℃。从图3a中可看出双网络水凝胶GDL在低温25℃时，300min左右达到溶胀平衡，且平衡溶胀度高达600％。由图3b和3c可看出，双网络水凝胶在高温37℃和50℃时基本不溶胀。对比可知，双网络水凝胶在低温时的溶胀度比高温时的溶胀度大。这是因为NIPAAm是一个温敏性的单体，在低温时凝胶处于溶胀状态可以吸收更多的水分，在高温时凝胶会收缩，吸收的水分较少。

图4为石墨烯双网络水凝胶GDL在去离子水中的溶胀度与温度的关系图。如图4所示，所制备的双网络水凝胶在去离子水中的溶胀度都随温度的升高而降低，表现出较为明显的温度敏性，其临界相转变温度(LCST)在33℃左右。AA中的-COOH为亲水性基团，加入AA可以提高水凝胶的LCST，但测试结果表明水凝胶的LCST并没有明显提高，可能是由于石墨烯的引入使得水凝胶的LCST有所降低。

图5为石墨烯双网络水凝胶GDL在不同pH值缓冲溶液中溶胀度与pH值的关系图。如图5所示，在较低和较高的pH值的溶液中其溶胀度低，在偏中性的溶液中的溶胀度较高。这是因为AA单体有-COOH基团，属于阴性敏感型单体。在强酸性溶液中时，由于凝胶中可离子化基团的离解度较低，静电排斥作用小，水凝胶网络处于收缩状态，导致溶胀度降低；当溶液的pH值偏弱酸性时，离解度增大，静电排斥作用增强，水凝胶的溶胀度急剧增大；随着pH的增大，离解度趋于完全，凝胶内、外的离子浓度基本相等，凝胶开始收缩。

图6为具体实施例所制备的石墨烯双网络水凝胶GDL在25℃、pH＝5.4和pH＝7.4条件下所测的药物缓释曲线：(A)EPI；(B)PTX。如图6A所示，在80h之后，双网络水凝胶在pH＝5.4和pH＝7.4分别释放了75％和38％的表阿霉素EPI。如图6B所示，在60h之后，双网络水凝胶在pH＝5.4和pH＝7.4分别释放了51％和41％的紫杉醇PTX。水凝胶复合载药体系在偏酸性条件下的药物累积释放率更大，主要是因为水凝胶具有pH响应性，在偏酸性的溶液中溶胀性能大，药物分子更容易从水凝胶中释放出来。

图7为具体实施例所制备的石墨烯双网络水凝胶GDL在pH＝5.4和T＝25℃，T＝37℃条件下所测的药物缓释曲线：(A)EPI；(B)PTX。如图7A所示，在80h之后，双网络水凝胶在T＝25℃和T＝37℃分别释放了75％和85％的表阿霉素EPI。如图7B所示，在60h之后，双网络水凝胶在T＝25℃和T＝37℃分别释放了51％和72％的紫杉醇PTX。水凝胶复合载药体系在 37℃条件下的药物累积释放率更大，主要是因为水凝胶具有温度响应性，其临界相转变温度(LCST)在33℃左右，当温度为37℃时水凝胶处于溶胀状态，允许所负载药物的快速释放。

细胞毒性实验：

将对数期生长的MCF-7细胞接种于96孔板，利用DMEM高糖完全培养基进行培养，每孔200μL(细胞的密度1×10⁴个/mL)，培养24h后，分别加入不同浓度的载体a.空白石墨烯双网络水凝胶GDL、b.空白石墨烯GN、c.单载表阿霉素双网络水凝胶体系EPI@GDL、d.单载紫杉醇的石墨烯体系PTX@GN、e.双网络石墨烯水凝胶双载药体系(EPI@PTX@GDL)。载体浓度分别为(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基的MCF-7作为对照组，未接种细胞作为空白组，每组设置6个复孔，分别继续培养24h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，培养箱内继续培养4h后，弃去孔内的培养基，然后每孔加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床避光低速振荡10min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在490nm波长下测定吸光值(OD)。将对照组的细胞存活率定义为100％，存活率按公式计算:细胞存活率＝(试验组OD值/对照组OD值)×l00％。

图8为MCF-7细胞加入样品后的细胞毒性图：a.空白双网络水凝胶GDL、b.空白石墨烯GN、c.双网络水凝胶单载表阿霉素体系EPI@GDL、d.石墨烯单载紫杉醇体系PTX@GN、e.双网络石墨烯水凝胶双载药体系(EPI@PTX@GDL)。如图8a和图8b所示，与对照组相比，各浓度的空白双网络水凝胶GDL和空白石墨烯GN载体对MCF-7的细胞活性没有显著影响。如图8c、8d和8e所示，在相同的载体添加浓度为200μg/mL时，单载药体系EPI@GDL将MCF-7细胞活性降低为55％(图8c)；单载药体系PTX@GN将MCF-7细胞活性降低为48％(图8d)；双载药体系EPI@PTX@GDL将MCF-7细胞活性降低为36％(图8e)。结合图8所示，与单载药体系EPI@GDL和PTX@GN相比，在1μg/mL-500μg/mL范围内，双载药体系EPI@PTX@GDL对MCF-7细胞毒性最大。由此证明，同时负载EPI和PTX乳腺癌联合化疗药物的双网络石墨烯水凝胶是一种有效的抗癌双载药体系。而且，在保证与更高剂量EPI和PTX联用取得相同疗效的前提下，双网络石墨烯水凝胶载药体系的使用剂量可以减少，从而也降低了药物的副作用。

细胞形态观察实验：

将对数期生长的MCF-7细胞接种于96孔板，每孔200μL(细胞的密度1×10⁴个/mL)，培养24h后，分别加入不同浓度的磁性石墨烯载药体系，同时设置只加入DMEM高糖完全培养基的MCF-7细胞作为对照组，每组三个复孔，培养24h后，用移液器每孔弃去100μL的培养基，各孔加入10μg/mL的FDA/PBS溶液100μL，使FDA的终浓度为5μg/mL，孵育10min，在这个过程中，FDA进入活细胞膜，10分钟后弃去孔中的所有液体，各孔再加入PBS缓冲液200μL，在 488nm的激发下发出荧光，荧光显微镜拍照。

图9为MCF-7细胞加入不同浓度载药体系后的荧光显微镜图片：a.0μg/mL；b.10μg/mL(b-1.EPI@GDL；b-2.PTX@GN；b-3.EPI@PTX@GDL)；c.100μg/mL(c-1.EPI@GDL；c-2.PTX@GN；c-3.EPI@PTX@GDL)；d.500μg/mL(d-1.EPI@GDL；d-2.PTX@GN；d-3.EPI@PTX@GDL)。如图9a所示，未加入载药体系，控制组具有最多的活细胞数目。如图9b-1、9b-2、9b-3所示，当加入载药体系浓度为10μg/mL，活细胞的数目减少。明显可以看出在相同添加浓度下，双网络石墨烯水凝胶双载药体系EPI@PTX@GDL对癌细胞的毒性最强。如图9c-1、9c-2、9c-3所示，当加入载药体系浓度为100μg/mL，活细胞的数目进一步降低。如图9d-1、9d-2、9d-3所示，当加入载药体系浓度为500μg/mL，活细胞的数目仅剩下很少。由此可见，与图8b的MTT结果一致，在1μg/mL-500μg/ml范围内，随着浓度的升高，细胞活性降低。载药体系对于MCF-7肿瘤细胞的毒性作用大小为：EPI@PTX@GDL>PTX@GN>EPI@GDL。即在1μg/mL-500μg/ml范围内，双网络石墨烯水凝胶双载药体系对MCF-7细胞存活率影响最大。

综上所述，所合成的双网络石墨烯水凝胶双载药体系表现出对乳腺癌MCF-7细胞较好的抑制作用，在生物医药领域有广阔的应用前景。