EGCG功能化的壳多糖衍生物、其载和厚朴酚纳米颗粒及制备方法与流程

本发明属于生物医用材料领域，涉及EGCG功能化的壳多糖衍生物、其载和厚朴酚纳米颗粒及制备方法。

背景技术：

纳米药物因具有靶向性、缓释性、低毒性等特殊性质而成为近些年的研究热点。壳多糖，大量存在于甲壳类动物外壳中，其部分或全部脱乙酰基产物壳聚糖具有大量的阳离子，具有良好的生物相容性和生物降解性，基于壳多糖脱乙酰基产物的纳米粒在食品及医药领域都得到了实际应用。脱乙酰壳多糖载药纳米粒体现出了较好的增溶或缓释效果，但是，现有载药纳米粒基本上是直接采用壳聚糖(脱乙酰壳多糖)作为载体，并未对壳多糖进行结构修饰，导致无法提升载药体系中被负载分子的生物活性。因此基于壳多糖的进一步修饰，使修饰产物具有壳多糖易纳米化性质的同时具有增强药物疗效的作用，具有重要的意义。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9％-13％，由于具有特殊的立体化学结构，EGCG具有非常强的抗氧化活性，在抗癌和心血管疾病方面担当了重要的角色，其具有明显的抗肺癌和肝癌作用并且不损伤正常体细胞。

Fei Lei等制备了一种壳聚糖-EGCG的共价结合物(见Journal of Applied Polumer Science,2014,131,39732)，直接采用脱乙酰的壳多糖与EGCG反应共价结合，其存在的不足是脱乙酰壳多糖的氨基并未被完整保留，大部分的氨基都接枝了一些EGCG，这会严重影响壳多糖-EGCG的纳米化性能，难以形成纳米颗粒，无法用于纳米载药体系。

和厚朴酚(Honokiol)是从中药厚朴中分离的木脂素类成分。和厚朴酚具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、及抗肿瘤活性，但由于水溶性极差，在体内的生物利用度低，因而需要加大用量且长期服用，这极大的限制了其临床应用。CN 104095817 A公开了一种直接用脱乙酰壳多糖负载厚朴酚及和厚朴酚的纳米粒，该纳米粒提高了和厚朴酚溶解性及溶出度，但其生物活性并未得到提升。

基于上述技术现状，若能开发出易于纳米化的EGCG修饰的壳多糖衍生物，并基于该易于纳米化的衍生物开发出具有缓释性能且能有效提高和厚朴酚生物活性的纳米颗粒，对生物医药领域将积极的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供EGCG功能化的壳多糖衍生物、EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒及制备方法，以提高EGCG修饰的壳多糖衍生物的纳米成型性能，并有效提高和厚朴酚的生物活性。

本发明提供的EGCG功能化的壳多糖衍生物，结构式如下：

上述结构式中，EGCG含量为10％～60％，脱乙酰度为50％～98％，氨基含量为50％～98％。

本发明提供的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒，该纳米颗粒由上述EGCG功能化的壳多糖衍生物与和厚朴酚组成，和厚朴酚与EGCG功能化的壳多糖衍生物通过电荷作用形成纳米颗粒，和厚朴酚包裹在纳米颗粒内部。

上述纳米颗粒中，和厚朴酚含量为10～500μg/mg，即每毫克纳米颗粒中含有和厚朴酚10～500微克。

上述纳米颗粒的粒径为20～300nm。

上述纳米颗粒的分散性指数为0.091～0.253。

本发明还提供了上述EGCG功能化的壳多糖衍生物的制备方法，步骤如下：

(1)将壳多糖溶解在盐酸中形成壳多糖浓度为2～20mg/mL的壳多糖盐酸溶液，将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶解在水中形成浓度为2～15mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液；

(2)将壳多糖盐酸溶液100重量份加入容器中，然后加入5～30重量份溶解有氧化保护剂的氧化剂，于20～50℃下搅拌至少10min，再加入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液15～80份，搅拌30～120min，将所得反应液透析并冷冻干燥得到中间产物；

(3)将步骤(2)所得中间产物溶解在40wt％～60wt％氢氧化钠溶液中，在100～180℃，0.5～1MPa蒸煮8～16h，然后沥干，将所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物。

上述EGCG功能化的壳多糖衍生物的制备方法中，所述盐酸的浓度为0.5wt％～10wt％。

上述EGCG功能化的壳多糖衍生物的制备方法中，所述氧化剂为H₂O₂或者二甲基亚砜(DMSO)，上述氧化保护剂为抗坏血酸，通常，溶解有氧化保护剂的氧化剂的制备方法为：将1～20重量份的氧化保护剂溶解在1～40重量份的氧化剂中。

本发明还提供了一种EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

(1)将壳多糖溶解在盐酸中形成壳多糖浓度为2～20mg/mL的壳多糖盐酸溶液，将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶解在水中形成浓度为2～15mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液，将和厚朴酚溶解在乙醇体积分数为30％～80％的乙醇-水溶液中形和厚朴酚浓度为2～20mg/mL溶液；

(2)将壳多糖盐酸溶液100重量份加入容器中，然后加入5～30重量份溶解有氧化保护剂的氧化剂，于20～50℃下搅拌至少10min，再加入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液15～80份，搅拌30～120min，将所得反应液透析并冷冻干燥得到中间产物；

(3)将步骤(2)所得中间产物溶解在40wt％～60wt％氢氧化钠溶液中，在100～180℃，0.5～1MPa蒸煮8～16h，然后沥干，将所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物；

(4)将步骤(3)所得EGCG功能化的壳多糖衍生物溶解在乙酸溶液中形成EGCG功能化的壳多糖衍生物为2～10mg/mL的EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液，向10～50重量份EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚朴酚溶液10～50重量份，调节pH值为2～6.5，搅拌10～40min，滴加5～20重量份浓度为1～5mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌30～120min，将所得悬浮液离心，弃掉上清液后加入冻干保护剂，冷冻干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒。

上述EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法中，所述冻干保护剂为甘露醇、山梨醇、乳酸或者明胶，通常，冻干保护剂的加入量应使离心弃掉上清液后的物料与冻干保护剂的体积比达到5:3～20:1。

上述EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法中，离心操作的条件为12000～16000rpm的转速下离心10～60min。

上述EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法中，所述乙酸溶液的浓度为0.5wt％～5wt％，所述盐酸的浓度为0.5wt％～10wt％。

上述EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法中，所述氧化剂为H₂O₂或者二甲基亚砜(DMSO)，上述氧化保护剂为抗坏血酸，通常，溶解有氧化保护剂的氧化剂的制备方法为：将1～20重量份的氧化保护剂溶解在1～40重量份的氧化剂中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种新型结构的EGCG功能化的壳多糖衍生物及其制备方法，由于该方法先用EGCG与壳多糖反应，再对产物进行脱乙酰化，从而制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物中保留了脱乙酰壳多糖中的氨基，其中氨基含量高达50％～98％，高氨基含量有利于其形成纳米颗粒，因而该衍生物具有易于纳米化的特点。

2.试验表明，本发明提供的EGCG功能化的壳多糖衍生物对人体正常肝、肾、肺体细胞无毒性，生物相容性好。

3.试验表明，本发明提供的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒具有明显的缓释性能，和厚朴酚的生物活性得到了有效提高，尤其是和厚朴酚的抗肝癌和肺癌活性被显著增强。

4.本发明提供的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的粒径分布均一，分散性指数可达0.091～0.253，有利于纳米颗粒的质量控制。

附图说明

图1是实施例3制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物的FT-IR图；

图2是实施例3制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的TEM图；

图3是实施例5中EGCG功能化的壳多糖衍生物对LO2，MRC-5，HK-2细胞存活率的影响图；

图4是实施例5中经过空白对照组和2mg/mL的衍生物组处理后的LO2，MRC-5，HK-2细胞生长情况的显微镜照片；

图5实施例6中和厚朴酚以及实施例3制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒中和厚朴酚的释放曲线；

图6是实施例7中和厚朴酚及实施例3制备的纳米颗粒对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞存活率的影响图；

图7是实施例7中经过空白对照组、20μg/mL的和厚朴酚用药组以及20μg/mL实施例3制备的纳米颗粒用药组处理后的人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞生长情况的显微镜照片。

具体实施方式

以下通过实施例并结合附图对本发明所述EGCG功能化的壳多糖衍生物、其载和厚朴酚纳米颗粒及制备方法作进一步说明。

实施例1

本实施例中，提供EGCG功能化的壳多糖衍生物以及EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

(1)将壳多糖溶解在0.5wt％的盐酸中形成壳多糖浓度为2mg/mL的壳多糖盐酸溶液，将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶解在水中形成浓度为2mg/mL的EGCG水溶液，将和厚朴酚溶解在乙醇体积分数为50％的乙醇-水溶液中形和厚朴酚浓度为2mg/mL溶液。

(2)将壳多糖盐酸溶液100重量份加入容器中，然后加入5重量份溶解有抗坏血酸的H₂O₂(将1重量份抗坏血酸溶解在8重量份H₂O₂中)，于20℃下磁力搅拌10min，再加入EGCG溶液15份，磁力搅拌30min，将所得反应液透析2次并冷冻干燥得到中间产物。

(3)将步骤(2)所得中间产物溶解在40wt％氢氧化钠溶液中，在100℃，0.5MPa蒸煮8h，然后沥干，将所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物，该衍生物的结构式如下：

该结构式中，EGCG含量为12％，脱乙酰度为80％，氨基含量为80％。

(4)将步骤(3)所得EGCG功能化的壳多糖衍生物溶解在0.5wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的壳多糖衍生物为2mg/mL的EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液，向10重量份EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚朴酚溶液10重量份，调节pH值为2，搅拌10min，滴加5重量份浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌30min，将所得悬浮液离心，弃掉上清液后加入冻干保护剂甘露醇，离心弃掉上清液后的样品与甘露醇的体积比为20:1，冷冻干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒。

本实施例制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的平均粒径约为300nm，纳米颗粒的分散性指数为0.253，该纳米颗粒中和厚朴酚的含量为140.5μg/mg，其包封率为68.3±3.2％。

实施例2

本实施例中，提供EGCG功能化的壳多糖衍生物以及EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

(1)将壳多糖溶解在5wt％的盐酸中形成壳多糖浓度为8mg/mL的壳多糖盐酸溶液，将EGCG溶解在水中形成浓度为6mg/mL的EGCG水溶液，将和厚朴酚溶解在乙醇体积分数为30％的乙醇-水溶液中形和厚朴酚浓度为6mg/mL溶液。

(2)将壳多糖盐酸溶液100重量份加入容器中，然后加入10重量份溶解有抗坏血酸的DMSO(将1重量份抗坏血酸溶解在15重量份DMSO中)，于30℃下磁力搅拌60min，再加入EGCG溶液30份，磁力搅拌60min，将所得反应液透析5次并冷冻干燥得到中间产物。

(3)将步骤(2)所得中间产物溶解在50wt％氢氧化钠溶液中，在130℃，0.7MPa蒸煮10h，然后沥干，将所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物，该衍生物的结构式如下：

该结构式中，EGCG含量为23％，脱乙酰度为90％，氨基含量为90％。

(4)将步骤(3)所得EGCG功能化的壳多糖衍生物溶解在3wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的壳多糖衍生物为6mg/mL的EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液，向20重量份EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚朴酚溶液10重量份，调节pH值为4，搅拌20min，滴加10重量份浓度为3mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌60min，将所得悬浮液在13000rpm下离心20min，弃掉上清液后加入冻干保护剂甘露醇，离心弃掉上清液后的样品与甘露醇的体积比为5:3，冷冻干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒。

本实施例制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的平均粒径约为90nm，纳米颗粒的分散性指数为0.205，该纳米颗粒中和厚朴酚的含量为130.5μg/mg，其包封率为75.6±5.5％。

实施例3

本实施例中，提供EGCG功能化的壳多糖衍生物以及EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

(1)将壳多糖溶解在10wt％的盐酸中形成壳多糖浓度为15mg/mL的壳多糖盐酸溶液，将EGCG溶解在水中形成浓度为10mg/mL的EGCG水溶液，将和厚朴酚溶解在乙醇体积分数为80％的乙醇-水溶液中形和厚朴酚浓度为12mg/mL溶液。

(2)将壳多糖盐酸溶液100重量份加入容器中，然后加入20重量份溶解有抗坏血酸的H₂O₂(将10重量份抗坏血酸溶解在30重量份H₂O₂中)，于40℃下磁力搅拌50min，再加入EGCG溶液60份，磁力搅拌90min，将所得反应液透析8次并冷冻干燥得到中间产物。

(3)将步骤(2)所得中间产物溶解在55wt％氢氧化钠溶液中，在160℃，0.9MPa蒸煮13h，然后沥干，将所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物，该衍生物的FT-IR图如图1所示，该衍生物的结构式如下：

该结构式中，EGCG含量为40％，脱乙酰度为95％，氨基含量为95％。

(4)将步骤(3)所得EGCG功能化的壳多糖衍生物溶解在5wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的壳多糖衍生物为10mg/mL的EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液，向40重量份EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚朴酚溶液30重量份，调节pH值为4.5，搅拌30min，滴加15重量份浓度为5mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌90min，将所得悬浮液在15000rpm下离心40min，弃掉上清液后加入冻干保护剂甘露醇，离心弃掉上清液后的样品与甘露醇的体积比为10:1，冷冻干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒。

本实施例制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的平均粒径约为60nm，纳米颗粒的分散性指数为0.091，该纳米颗粒的TEM照片如图2所示，该纳米颗粒中和厚朴酚的含量为190.5μg/mg，其包封率为88.3±5.1％。

实施例4

本实施例中，提供EGCG功能化的壳多糖衍生物以及EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

(1)将壳多糖溶解在10wt％的盐酸中形成壳多糖浓度为20mg/mL的壳多糖盐酸溶液，将EGCG溶解在水中形成浓度为15mg/mL的EGCG水溶液，将和厚朴酚溶解在乙醇体积分数为50％的乙醇-水溶液中形和厚朴酚浓度为20mg/mL溶液。

(2)将壳多糖盐酸溶液100重量份加入容器中，然后加入30重量份溶解有抗坏血酸的H₂O₂(将1重量份抗坏血酸溶解在40重量份H₂O₂中)，于50℃下磁力搅拌60min，再加入EGCG溶液80份，磁力搅拌90min，将所得反应液透析10次并冷冻干燥得到中间产物。

(3)将步骤(2)所得中间产物溶解在60wt％氢氧化钠溶液中，在180℃，1MPa蒸煮16h，然后沥干，将所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物，该衍生物的结构式如下：

该结构式中，EGCG含量为55％，脱乙酰度为96％，氨基含量为96％。

(4)将步骤(3)所得EGCG功能化的壳多糖衍生物溶解在5wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的壳多糖衍生物为10mg/mL的EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液，向50重量份EGCG功能化的壳多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚朴酚溶液10重量份，调节pH值为6.5，搅拌40min，滴加20重量份浓度为3mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌120min，将所得悬浮液在16000rpm下离心60min，弃掉上清液后加入冻干保护剂甘露醇，离心弃掉上清液后的样品与甘露醇的体积比为20:1，冷冻干燥即得EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒。

本实施例制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒的平均粒径约为130nm，纳米颗粒的分散性指数为0.195，该纳米颗粒中和厚朴酚的含量为110.5μg/mg，其包封率为56.2±4.2％。

实施例5

本实施例中，EGCG功能化的壳多糖衍生物对正常人体肝、肾、肺体细胞的毒性。

将实施例3制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物用DMSO分散，并用DMEM培养液稀释至一定浓度形成衍生物溶液。分别取对数生长期LO2，MRC-5，HK-2细胞株，制备密度约为4×10⁴/L的细胞悬液，以每孔体积100μL接种于96孔培养板上，在CO₂培养箱中培养24h，细胞贴壁以后，加入前述衍生物溶液，使EGCG功能化的壳多糖衍生物的终浓度为0mg/mL(空白对照组)，0.5、1、2mg/mL(衍生物组)，各孔中DMSO含量均小于0.5％，每个浓度设6个平行孔，在CO₂培养箱中培养48h后，按照每孔50μL的量加入加入2mg/mL的MTT，在CO₂培养箱中继续培养4h后终止培养。吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO液，充分振荡，使蓝紫色沉淀充分溶解，在30min内用酶标仪测定490nm波长处的光吸收值，计算细胞存活率，细胞存活率(％)＝(A-A₀)×100％，A₀为空白对照组的吸光度值，A为衍生物组的吸光度值，结果如图3所示，由图3可知，EGCG功能化的壳多糖衍生物对LO2，MRC-5，HK-2细胞均无生长抑制作用。经过空白对照组和2mg/mL的衍生物组处理后的LO2，MRC-5，HK-2细胞生长情况的显微镜照片如图4所示，由图4可知，EGCG功能化的壳多糖衍生物对LO2，MRC-5，HK-2细胞均无生长抑制作用。上述内容说明本发明提供的EGCG功能化的壳多糖衍生物具有良好的生物相容性。

实施例6

分别称取5mg和厚朴酚及实施例3制备的载有5mg和厚朴酚的纳米颗粒，将它们分别分散于5mLpH值为6.8的溶出介质(根据中国药典配制)中，然后转移到截留分子量为12000～14000的透析袋中，将透析袋置于50mL溶出介质中，在37℃下搅拌，在第0.5,1,2,3,4,8,12,16,20,24小时从50mL溶出介质中取出2mL溶液，测量其紫外吸光度值并计算和厚朴酚的浓度，绘制和厚朴酚释放曲线，结果如图5所示，由图5可知，单一和厚朴酚具有很低的溶出速率，而制备成纳米颗粒之后，和厚朴酚溶出度大大改善，同时纳米颗粒显示出明显的和厚朴酚缓释作用。

实施例7

本实施例中，测试EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒肝癌和肺癌细胞增殖抑制活性。

将和厚朴酚及实施例3制备的EGCG功能化的壳多糖衍生物载和厚朴酚纳米颗粒分散于DMSO中，配制成一定浓度的储备液。取对数生长期人肺癌A549细胞株和人肝癌HepG2细胞株，加入25g/L胰蛋白酶消化，吹打制成单个细胞悬液，将细胞密度调整约4×10⁴/L，以每孔体积100μL接种于96孔培养板上，置于CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，向各孔分别加入不同浓度的和厚朴酚及实施例3制备的纳米颗粒溶液，使和厚朴酚及负载和实施例3制备的纳米颗粒的终浓度分别为0μg/mL(空白对照组)，5、10、15、20、30、40μg/mL(和厚朴酚用药组、纳米颗粒用药组)，每个浓度设6个平行孔，培养48h后，按照每孔50μL的量加入2mg/mL的MTT，置于CO₂培养箱中继续培养4h后终止培养。吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO，充分振荡，使蓝紫色沉淀充分溶解，在30min内用酶标仪测定490nm波长处的吸光度值。不同浓度的和厚朴酚及实施例3制备的纳米颗粒对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞的增殖抑制率＝(对照组吸光度值-用药组吸光度值)/对照组吸光度值×100％，结果分别如图6(A)和(B)所示，由图6可知，与和厚朴酚相比，实施例3制备的纳米颗粒对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞具有更高的癌细胞生长抑制率。经过空白对照组、20μg/mL的和厚朴酚用药组以及20μg/mL实施例3制备的纳米颗粒用药组处理后的人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞生长情况的显微镜照片如图7所示，由图7可知，纳米颗粒用药组对人肺癌A549细胞的生长抑制作用明显强于和厚朴酚，纳米颗粒用药组对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用也强于和厚朴酚。以上内容说明将和厚朴酚负载在本发明所述EGCG功能化的壳多糖衍生物中形成纳米颗粒，能够提高和厚朴酚的生物活性。