本发明涉及兽用生物制品和疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种可增强口蹄疫亚单位疫苗免疫效力的T细胞表位合成肽佐剂。
背景技术：
佐剂是添加在疫苗中用来增强体液免疫或细胞免疫效力的一类免疫增强物质。目前，在国内动物疫苗中常见的佐剂主要有铝盐佐剂、聚肌胞甘酸、水/油佐剂等，但是，上述佐剂成本高、免疫增强效果差、保存不便、提取工艺复杂等缺点给疫苗产业的发展带来一定困难。T细胞表位合成肽佐剂具有性质稳定、成本低廉、易溶性良好、生产工艺简便、方便保存等优点。国外已经有运用于各畜禽病毒亚单位疫苗的通用型T细胞表位，并已用于商业生产中，我国的科研工作者也对这方面进行了相关探索。
由于亚单位疫苗免疫原性差，不能产生较高水平的抗体滴度，必须加入免疫增强剂才能有效提高亚单位疫苗免疫增强。在兽用疫苗中，佐剂也可以像抗原一样刺激机体的免疫机能而产生免疫反应。佐剂是疫苗的辅助添加成分，它甚至能够通过化工合成成为携带抗原的载体，还它是疫苗免疫成功不可或缺的条件。如果合理搭配佐剂，疫苗会比任何疫苗单独使用的免疫效果都好，既能减少疫苗生产成本，又能提高机体抵抗病毒的能力。理想的免疫佐剂应满足既不对免疫机体造成免疫损伤，又能极大地刺激免疫反应的条件。近年来，为了更好地应对各类病毒的侵袭，对于新型疫苗的需求也在不断升级，佐剂的发展已向创新、多元的特征发展，其中基因疫苗、核酸疫苗及合成肽疫苗的搭配佐剂研究日益突显。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种可增强口蹄疫亚单位疫苗免疫效力的T细胞表位合成肽佐剂，以解决现有技术的常规佐剂产品对口蹄疫亚单位疫苗的免疫促进作用不明显的技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种可增强口蹄疫亚单位疫苗免疫效力的T细胞表位合成肽佐剂，其中的合成肽由序列为SEQ ID No:1～SEQ ID No:6其中之一的肽段与序列为SEQ ID No:7～SEQ ID No:12其中之一的肽段利用多肽固相合成法连接而成。
作为现有，序列为SEQ ID No:1～SEQ ID No:6其中之一的肽段与序列为SEQ ID No:7～SEQ ID No:12其中之一的肽段之间是通过两相连的甘氨酸连接的。
作为优选，所述佐剂中合成肽的含量为5～50μg/ml。
作为优选，所述佐剂中含有NaCl和NaOH。
本发明提供了一种可增强口蹄疫亚单位疫苗免疫效力的T细胞表位合成肽佐剂，在该技术方案中：
1、为提高口蹄疫病毒亚单位疫苗免疫效力，降低成本，简化生产工艺，本发明使用的是固相合成肽方法。
2、在口蹄疫病毒亚单位疫苗中添加Th表位合成肽，本发明合成了位于3D非结构蛋白及vp1结构蛋白上的同源性较高的Th表位序列，并用两相连甘氨酸(-G-G-)采用串联技术将表位进行随机组合串联。(任意VP1蛋白与3D蛋白T细胞表位序列两两随机组合或交叉串联组合均可)
表1本发明选用的3D非结构蛋白及vp1结构蛋白上的Th表位序列
3、为了防止合成肽不溶于ph为7.0的纯水，加入了NaCl和NaOH作为缓冲稀释液。
4、本发明的Th表位合成肽添加剂量保持在5ug/ml--50ug/ml，并能够保证在最低添加量5ug/ml时仍能达到较高抗体滴度。
附图说明
图1是添加了不同批次本发明佐剂的口蹄疫亚单位乳化疫苗，在使用后实验动物CD4+/CD8+T细胞分型情况；图中，A部分是添加了批号为20150601的佐剂的疫苗使用情况；B部分是添加了批号为20150823的佐剂的疫苗使用情况；C部分是添加了批号为20151023的佐剂的疫苗使用情况；D部分是添加了批号为20151203的佐剂的疫苗使用情况；E部分是添加了批号为20160211的佐剂的疫苗使用情况；F部分是添加了批号为20160405的佐剂的疫苗使用情况；
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
(1)一种可增强口蹄疫亚单位疫苗免疫效力的T细胞表位合成肽佐剂，其中的合成肽由序列为SEQ ID No:1～SEQ ID No:6其中之一的肽段与序列为SEQ ID No:7～SEQ ID No:12其中之一的肽段利用多肽固相合成法连接而成。所述佐剂中合成肽的含量为5～50μg/ml。
(2)按照口蹄疫病毒亚单位疫苗2ml-50ml、串联表位合成肽表位肽5ug/ml--50ug/ml，将配方原液配制好后，0.22ul滤膜除菌，并在无菌条件下充分乳化混匀。
(3)取乳化完成的疫苗装瓶，压盖。
(4)疫苗质量检验
随机抽取不同批次乳化疫苗成品分别按照以下方案检测，结果表明乳化疫苗成品质量均合格(如表1所示)。
表1添加Th表位合成肽口蹄疫亚单位乳化疫苗质量检验结果
无菌检验：按《中国生物制品规程》通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，取1mL分别至50mL硫乙醇酸盐培养基、酪胨琼脂培养基和葡萄糖蛋白胨培养基中，并将玻璃管置37℃温箱内培养3d，对培养后培养基的颜色和纯净度进行观察，培养后应为淡黄色、澄清透明状。
安全性实验：用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml(乳化疫苗成品)，观察7d，动物应健存，每只体重增加判为合格；
外观检测：观察乳化疫苗外观呈白色乳状液体，40倍光镜观察油、液颗粒应均匀；
复溶效果监测：取Th表位合成肽成品加生理盐水1ml，并加入了0.2gNaCl和0.22gNa(OH)2，1min后观察是否完全溶解以及有无无肉眼可见颗粒，如无则判为合格；
(4)口蹄疫病毒乳化疫苗4℃保存稳定性试验
如表2所示：随机抽取各批次口蹄疫病毒乳化疫苗，放置于4℃环境中，1月后不出现分层为合格。
表2添加Th表位合成肽口蹄疫亚单位乳化疫苗VP1抗体滴度检测结果
(5)免疫效力检测
实验小鼠的分组免疫：将试验BALB/c小鼠随机分为A、B、C三组，10只/组，A组为含串联Th表位合成肽佐剂的乳化疫苗，B组为不含任何佐剂的乳化疫苗，C组为生理盐水空白对照组，采用皮下多点免疫，0.2mL/组。随机抽取不同批次乳化疫苗成品分别按照以下方案检测，结果表明乳化疫苗成品质量均合格(如表2、3、4所示)。
表3添加Th表位合成肽口蹄疫亚单位乳化疫苗细胞因子含量检测结果
表4添加Th表位合成肽口蹄疫亚单位乳化疫苗T淋巴细胞增殖SI系数检测结果
VP1抗体滴度检测：
(1)抗原包被：根据包被孔数计算出所需包被抗原的用量，称取一定量病毒抗原合成肽作为包被抗原，用包被液稀释至5μg/mL，分加到96孔板内，100μL/孔。之后将96孔酶标板于4℃过夜。
(2)洗涤：包被结束后弃掉包被液，用PBST加满每孔，静置3-5min，弃掉洗涤液，重复5次，最后拍干96孔板。
(3)封闭：取含1％BSA的封闭液至少200μL/孔置96孔板中，之后将其放置于37℃孵育1h。
(4)洗涤：封闭结束后洗涤96孔板，方法同上。
(5)加样：对各孔编号后，分别加入待测样品100μL/孔，同时设置阴性、阳性空白对照。轻轻晃动均匀后，37℃孵育1h。
(6)洗涤：孵育结束后洗涤96孔板，方法同上，每次间隔30s后弃去洗涤液。
(7)加二抗：将HRP-羊抗鼠二抗按说明书要求稀释至1:5000，以100μL/孔加入到各孔中，(空白对照孔除外)。37℃孵育1h。
(8)洗涤：孵育结束后洗涤96孔板，方法同上。
(9)显色：每孔加50μL TMB单组份显色液，37℃避光显色15min。
(10)终止：每孔加入50μL终止液，终止反应，此时蓝色变为黄色。
(11)检测：以空白调零，于酶标仪450nm波长测量各孔吸光度值(OD450nm值)，测定应在加入终止液15min内进行。OD450nm值＝样本OD450nm-空白OD450nm。
(12)判定标准：以OD450nm值>2.1的最小稀释度为抗体滴度，大于1:16为合格。
细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10)检测
(1)加样：设置空白对照(空白孔不加样品及HRP-结合物，其他步骤均相同)，在待测样品孔先加40μL/孔样品稀释液，然后加入10μL待测血清样品，尽量不要接触孔底，缓慢振荡。
(2)温育：封板膜封板后，置于37℃孵育30min。
(3)洗涤：将试剂盒内的洗涤液用纯水稀释20-30倍备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此反复5次，拍干。
(4)加酶：除空白对照外，每孔加入酶标试剂50μL。
(5)温育：封板膜封板后，置于37℃孵育30min。
(6)洗涤：将试剂盒内的洗涤液用纯水稀释20-30倍备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此反复5次，拍干。
(7)显色：每孔加入TMB单组份显色液50μL。轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。
(8)终止：每孔加入终止液50μL，终止反应，此时蓝色立传黄色。
(9)测定：以空白孔调零，于酶标仪上450nm波长依序测量各孔吸光度值(OD值)，测定应在加入终止液15min内进行。
T淋巴细胞增殖检测：
将二免后56d小鼠摘除眼球采血并后颈椎脱臼处死，分离血清作为后期检测样品。将小鼠浸于75％酒精中小于30s，在超净工作台中取出小鼠放置在灭菌的纱布中。固定小鼠后，剪开其腹部皮肤裸露脾脏后，取出脾脏称重记录，并剪取一小块脾脏放入组织固定液中，剩余的放置在有200目不锈钢网的50mL离心管中配以1640培养基研磨，共需4mL。研磨结束后，在15mL离心管中加入2mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液小心沿管壁加入淋巴细胞分离液中，保持界面清晰，1500rpm离心20min。小心吸出中间的白膜层，置于15mL离心管中，再加入5ml PBS重悬混匀，1000rpm 10min，弃上清，加入5mL 1640培养液重悬混匀，1500rpm离心10min。弃上清，加入2mL 1640培养基重悬混匀，在细胞计数板上计数，调整为1x106-1x107个/mL。在96孔细胞板上加100μL/孔ConA，50μL/孔淋巴细胞悬液至96孔板，混匀至37℃5％CO2培养箱分别培养24h、48h、72h、96h。在细胞板分别培养44h时，取出96孔板轻吸出上清液，加入MTS(提前融化)20μL/孔，水平振荡1min，放置于37℃5％CO2培养箱继续孵育4h。4h后轻吸出上清液，加入DMSO 150μL/孔，震荡均匀，室温放置5min，酶标仪上490nm波长测OD值。最终结果以刺激指数(SI)表示,其中SI的计算公式为:SI＝(刺激组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。
CD4+、CD8+细胞流式分型：
将1×105～1×107个细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5min，弃上清；加入PBS缓冲液100μL悬浮细胞。加入CD4-FITC、CD8-PE荧光抗体1μL(0.5mg/mL)，水浴30min。再加入PBS缓冲液350μL，轻轻混匀，3000r/min，离心5min，弃上清，并重复2次。取100μL缓冲液加入获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入流式专用管中，准备上样进行仪器检测和分析。检测结果如图1所示：CD4+细胞占比应>30％。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。