多因子组合试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及多因子组合试剂盒。
背景技术：
：皮肤作为人体的最大器官，具有屏障、保护、调节体温和感觉的功能。由于炎症、溃疡、烫伤、烧伤等因素造成的皮肤缺损，严重的可危及生命。然而，目前针对皮肤损伤的治疗方法及药物仍有待开发。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：目前临床通常采用自体皮瓣或皮肤移植的方法治疗缺损创面，但面临供皮区新的创伤缺陷，以及供皮区来源的不足等问题。此外移植物与移植部位临近的皮肤存在颜色、质地、功能上的差异。研究发现，干细胞能够产生一种称之为外泌体的囊泡结构。外泌体直径介于30-150nm之间，是一种体积较小的细胞外泌囊泡，并具有脂质双层膜结构。外泌体含有多种细胞特异性蛋白、脂类物质及核酸物质，能够释放信号分子并将其传递给其他细胞，从而改变其生理功能。有鉴于此，发明人将外泌体作用于受损皮肤，发现处理后的皮肤的表皮细胞及真皮细胞的增殖速度明显加快，从而加速受损皮肤的修复，皮肤生理功能有所改善。进一步地，发明人意外地发现，将外泌体与细胞因子共同作用于受损皮肤，表皮及真皮细胞的增殖速度及受损皮肤的修复速度均明显快于外泌体单独作用，且生理功能明显改善。为此，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：外泌体和细胞因子。发明人将外泌体作用于受损皮肤，发现受损皮肤的修复速度加快，生理功能有所改善。发明人意外地发现，将外泌体与细胞因子共同作用于受损皮肤，受损皮肤的修复速度明显快于外泌体单独作用，且生理功能明显改善。发明人经过深入研究发现，外泌体可被受损组织处的表皮及真皮细胞所吞噬，外泌体内含物，例如蛋白质、核酸等物质会释放到细胞内发挥其调控作用，同时，细胞因子通过与细胞表面受体相结合，将刺激信号传递至细胞内，会与外泌体协同修复并重构受损组织的再生微环境，调控细胞增殖分化并促进组织再生。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。本领域技术人员所公知的，“细胞因子”是指由细胞合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子量蛋白质或多肽类物质。需要说明的是，本发明所使用的术语“多因子”是指外泌体和细胞因子。根据本发明的实施例，所述试剂盒还可以具有下列附加技术特征：根据本发明的实施例，所述细胞因子包括下列至少之一：碱性成纤维生长因子；以及表皮生长因子。发明人经过大量实验得到上述细胞因子的较优组合，各细胞因子之间会起到较好的协同作用，修复并重构受损组织的再生微环境，调控细胞增殖分化。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：2～100μg/ml的外泌体；10～50ng/ml的碱性成纤维生长因子；以及10～50ng/ml的表皮生长因子。在一些实施例中，所述试剂盒包括：2～70μg/ml的外泌体；10～40ng/ml的碱性成纤维生长因子；以及10～40ng/ml的表皮生长因子。在一些实施例中，所述试剂盒包括：2～50μg/ml的外泌体；10～30ng/ml的碱性成纤维生长因子；以及10～30ng/ml的表皮生长因子。在一些实施例中，所述试剂盒包括：2～20μg/ml的外泌体；10～20ng/ml的碱性成纤维生长因子；以及10～20ng/ml的表皮生长因子。发明人发现，在此条件下能够使得各细胞因子和外泌体协同作用效果较佳，能够快速且有效地修复并重构受损组织的再生微环境，调控细胞增殖分化。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：5μg/ml外泌体；10ng/ml的碱性成纤维生长因子；以及20ng/ml的表皮生长因子。发明人发现，在此条件下能够使得各细胞因子和外泌体协同作用效果较佳，能够快速且有效地修复并重构受损组织的再生微环境，调控细胞增殖分化。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。需要说明的是，对于外泌体的获得来源不作严格限定。根据本发明的实施例，外泌体来源于间充质干细胞。发明人发现，外泌体内含物的组成差异是导致不同组织或细胞来源外泌体具备不同生理功能的主要原因。进而，发明人经过大量实验发现，间充质干细胞来源的外泌体对于受损组织的修复能力较强。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。根据本发明的实施例，所述外泌体是通过下列步骤所得到的：将间充质干细胞接种于含有细胞生长培养基的细胞培养皿中，进行培养至所述间充质干细胞处于生长对数期且细胞汇合度达到90％以上，将细胞生长培养基更换为外泌体收集培养基，添加量为6ml/皿，于37℃，5％二氧化碳培养条件下培养细胞48小时，收集培养液；将所述培养液于4℃，300g离心10分钟，收集第一上清液；将所述第一上清液于4℃，2000g离心10分钟，收集第二上清液；将所述第二上清液于4℃，10000g离心30分钟，收集第三上清液；将所述第三上清液于4℃，110000g离心2小时，收集第一沉淀物；用35mlPBS缓冲液重悬所述第一沉淀物，并于4℃，110000g离心2小时，收集第二沉淀物；以及用100～200μlPBS缓冲液重悬所述第二沉淀物，以便得到所述外泌体。根据本发明的具体实施例，所述外泌体收集培养基含有αMEM培养基、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺及1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物。发明人意外地发现，在此条件下所得到的外泌体能够较好地修复并重构受损组织的再生微环境，从而有效调控受损组织表皮细胞及真皮成纤维细胞的增殖及分化。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。根据本发明的实施例，所述外泌体及细胞因子是以混合溶液的形式提供的。由此，以便于外泌体和细胞因子协同修复并重构受损组织的再生微环境，调控细胞增殖分化。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。根据本发明的实施例，所述混合溶液的溶剂为生理盐水。该溶剂能够有效溶解外泌体及细胞因子，并对皮肤创面无刺激或其他副作用。根据本发明的实施例，所述外泌体及细胞因子密封于喷雾瓶。由此，便于用药及给药剂量控制。另外，本发明提出了前面所描述的试剂盒在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗皮肤缺损。由此，所述药物能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。根据本发明的实施例，所述皮肤缺损由糖尿病足、烧烫伤、机械性物理损伤或手术创伤所致。由此，所述药物能够有效地促进创面表皮细胞及真皮细胞增殖，加快皮肤损伤的修复及愈合。本发明的药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、病人年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防皮肤损伤)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述试剂盒的药物给予有需要的个体。根据本发明的实施例，本发明的药物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物可包含本发明的试剂盒、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。本领域技术人员能够理解的是，前面针对试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒在制备药物中的用途，在此不再赘述。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和强理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的放大40倍的间充质干细胞的显微照片；图2显示了根据本发明一个实施例的间充质干细胞表面标志蛋白表达分析图；图3显示了根据本发明一个实施例的外泌体的透射电镜照片；图4显示了根据本发明一个实施例的放大100倍的表皮细胞系HaCaT细胞的显微照片；图5显示了根据本发明一个实施例的热损伤处理后放大40倍的HaCaT细胞的显微照片；图6显示了根据本发明一个实施例放大100倍热损伤修复后HaCaT细胞Ki67荧光染色的显微照片；图7显示了根据本发明一个实施例的放大100倍的成纤维细胞系BJ细胞的显微镜照片；图8显示了根据本发明一个实施例的放大40倍的热损伤处理后的成纤维细胞系BJ细胞的显微镜照片；以及图9显示了根据本发明一个实施例放大100倍热损伤修复后BJ细胞Ki67荧光染色的显微照片。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1外泌体的获得与鉴定1、外泌体的获得(1)提供间充质干细胞将间充质干细胞(形态如图1所示)培养于含无血清培养基(购自三有利公司，中国)的10cm细胞培养皿中，长满平皿后，吸弃培养基并用PBS缓冲液润洗细胞，随后加入TrypLeExpress酶消化细胞，待细胞变圆并从培养板上脱落时及时用含10％胎牛血清的αMEM培养基终止消化，收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm离心5分钟。吸弃上清后用PBS缓冲液洗涤细胞一次，并随后用100μl/管PBS缓冲液重悬细胞，分别向各管中加入2μl对应的流式抗体(HLA-CR、CD14、CD34、CD45、CD19、CD105、CD73、CD90)，4℃避光孵育细胞40分钟，并随后用PBS缓冲液洗涤细胞两次，并最终将细胞重悬至300μlPBS缓冲液中进行流式分析，其结果如图2所示，其中(A)～(H)分别为HLA-CR、CD14、CD19、CD105、CD34、CD45、CD73、CD90抗体。由表1能够确定所得到的细胞为间充质干细胞。表1流式细胞仪检测细胞表型检测值正常参考值CD90100％>95％CD7399.95％>95％CD10599.66％>95％CD340.90％<2％CD450.02％<2％CD140％<2％CD190.06％<2％HLA-DR0％<2％(2)间充质干细胞的扩增：将间充质干细胞(形态如图1所示)培养于含无血清培养基(购自三有利公司，中国)的10cm细胞培养皿中。待细胞生长并达到90％以上汇合度时，吸弃培养基后用PBS缓冲液润洗细胞一次，加入TrypLeExpress酶消化细胞，待细胞变圆并从培养板上脱落时及时用含10％胎牛血清的αMEM培养基终止消化，收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm离心5分钟。吸弃上清后用新鲜无血清培养基重悬细胞，按1:5的传代比例将细胞接种至新的培养皿中，传代培养7～10代。(3)待扩增最后一代的间充质干细胞生长达到90％以上的汇合度时，吸弃培养基，更换为外泌体收集培养基，添加量为6ml/皿。外泌体收集培养基的配方为αMEM(购自Gibco)+1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(购自Gibco)+1％非必需氨基酸(购自Gibco)+1％谷氨酰胺(购自Gibco)。继续培养48小时后收集培养液，依次按下述步骤进行离心操作：4℃，300g离心10分钟，收集上清液；4℃，2000g离心10分钟，收集上清液；4℃，10000g离心30分钟，收集上清液；4℃，110000g离心2小时，收集沉淀物并用35mlPBS缓冲液重悬沉淀；4℃，110000g离心2小时，收集沉淀物并用100～200μlPBS缓冲液重悬沉淀，以便得到外泌体。2、外泌体的鉴定利用透射电镜观察经固定及染色后的外泌体的形态外观，在15000-25000倍放大倍率下观察样本，结果如图3所示。外泌体外观呈中央微凹的圆盘形或单侧凹陷的椭球型，直径介于50～150nm之间。实施例2外泌体与细胞因子用于促进表皮细胞增殖的研究1、表皮细胞培养：表皮细胞系HaCaT细胞(形态如图4所示)培养于含10％胎牛血清的MEM培养基中，待细胞生长汇合达到90％以上时，吸弃培养基，用PBS缓冲液润洗细胞一次后加入预热的含0.03％EDTANa2的0.25％胰蛋白酶，消化10分钟，待细胞变圆且脱离培养皿底部时用含10％胎牛血清的MEM培养基终止消化，收集细胞悬液至离心管中，1200rpm离心5分钟，吸弃上清后用新鲜的培养基重悬细胞，细胞计数后按3000细胞/孔的接种量将细胞加至96孔板中培养8小时，HaCaT细胞完全贴壁。2、HaCaT细胞热损伤处理及培养：将含有完全贴壁的HaCaT细胞的孔板置于45℃培养箱中处理90分钟(细胞形态如图5所示)，随后吸弃培养基，并按如下组别加入0.15mL相应的处理培养基，于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养24小时。处理组a.对照组(MEM培养基+10％胎牛血清)；b.实验组1(MEM培养基+10％胎牛血清+20ng/ml表皮生长因子)；c.实验组2(MEM培养基+10％胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子)；d.实验组3(MEM培养基+10％胎牛血清+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)；e.实验组4(MEM培养基+10％胎牛血清+20ng/ml表皮生长因子+10ng/ml碱性成纤维生长因子)；f.实验组5(MEM培养基+10％胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)；g.实验组6(MEM培养基+10％胎牛血清+20ng/ml表皮生长因子+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)；h.实验组7(MEM培养基+10％胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子+20ng/ml表皮生长因子+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)。3、细胞免疫荧光检测：培养结束后，吸弃培养基，用PBS缓冲液润洗一次，加入4％多聚甲醛溶液室温固定细胞15分钟。用PBS缓冲液润洗细胞三次，加入含0.25％TritonX100的PBS缓冲液对细胞进行穿膜处理15分钟(室温)。用含10％驴血清、0.3％TritonX100的PBS缓冲液(封闭液)对细胞进行抗原封闭1小时(室温)。用封闭液按1:400体积比稀释兔抗人Ki67抗体(CST公司)，并将所得到的抗体稀释液在孵育细胞过夜(4℃)。吸弃Ki67抗体稀释液并用PBS缓冲液润洗细胞三次，每次5分钟。用封闭液按1:400体积比稀释驴抗兔荧光二抗AlexaFluor488IgG(H+L)(Invitrogen公司)，并用所得到的抗体稀释液室温避光孵育细胞1小时。吸弃二抗稀释液并用PBS缓冲液润洗细胞三次，每次5分钟。用PBS缓冲液按1：300体积比稀释DAPI，并用所得到的DAPI稀释液室温避光孵育细胞3分钟。吸弃稀释液后用PBS缓冲液润洗细胞两次后置于倒置荧光显微镜下观察细胞的染色情况，并随机计数三个视野计算Ki67的染色阳性率。染色结果如图6所示，其中，(1)、(3)、(5)、(7)、(9)、(11)、(13)和(15)分别为对照组、实验组1～7的Ki67蛋白荧光染色结果，白点代表Ki67蛋白阳性；(2)、(4)、(6)、(8)、(10)、(12)、(14)和(16)分别为对照组、实验组1～7的细胞核染料DAPI的染色结果，白点代表细胞核。Ki67蛋白是一种与细胞增殖相关的核抗原，参与调控细胞有丝分裂过程，表达于G0期外的所有细胞周期阶段，是标记细胞增殖状态的标志蛋白。HaCaT细胞在接受热损伤后细胞状态显著下降，细胞增殖停滞。与对照组相比，表皮生长因子或碱性成纤维生长因子以及外泌体共同处理后，细胞核内Ki67阳性细胞比例显著提高，表明更多的细胞进入细胞周期并处于增殖状态，而经过实验组4～7处理后，Ki67的阳性率均高于实验组1～3，经过实验组7处理后，Ki67的阳性率最高，进一步表明外泌体、碱性成纤维生长因子及表皮生长因子协同作用，能够发挥更好地修复效果。实施例3外泌体与细胞因子用于促进真皮细胞增殖的研究1、细胞培养：真皮细胞系BJ细胞(形态如图7所示)培养于含10％胎牛血清的HDMEM培养基中，待细胞生长汇合达到90％以上时，吸弃培养基，用PBS缓冲液润洗细胞一次后加入预热的TrypLEExpress酶，消化2分钟，待细胞变圆且脱离培养皿底部时用含10％胎牛血清的HDMEM培养基终止消化，收集细胞悬液至离心管中，1200rpm离心5分钟，吸弃上清后用新鲜的含10％胎牛血清的HDMEM培养基重悬细胞，细胞计数后按3000细胞/孔的接种量将细胞加至96孔板中培养8小时，BJ细胞完全贴壁。2、BJ细胞热损伤处理及培养：将含有完全贴壁的BJ细胞的孔板置于45℃培养箱中处理90分钟(形态如图8所示)，随后吸弃培养基，并按如下组别加入0.15mL相应的处理培养基，于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养24小时。处理组a.对照组(HDMEM培养基+10％胎牛血清)；b.实验组1(HDMEM培养基+10％胎牛血清+20ng/ml表皮生长因子)；c.实验组2(HDMEM培养基+10％胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子)；d.实验组3(HDMEM培养基+10％胎牛血清+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)e.实验组4(HDMEM培养基+10％胎牛血清+20ng/ml表皮生长因子+10ng/ml碱性成纤维生长因子)；f.实验组5(HDMEM培养基+10％胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)；g.实验组6(HDMEM培养基+10％胎牛血清+20ng/ml表皮生长因子+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)；h.实验组7(HDMEM培养基+10％胎牛血清+10ng/ml碱性成纤维生长因子+20ng/ml表皮生长因子+5μg/ml实施例1所得到的外泌体)。3、细胞免疫荧光检测：培养结束后，吸弃培养基，用PBS缓冲液润洗一次，加入4％多聚甲醛溶液室温固定细胞15分钟。用PBS缓冲液润洗细胞三次，加入含0.25％TritonX100的PBS缓冲液对细胞进行穿膜处理15分钟(室温)。用含10％驴血清、0.3％TritonX100的PBS缓冲液(封闭液)对细胞进行抗原封闭1小时(室温)。用封闭液按1:400体积比稀释兔抗人Ki67抗体(CST公司)，并将所得到的稀释液在4℃孵育细胞过夜。吸弃稀释液并用PBS缓冲液润洗细胞三次，每次5分钟。用封闭液按1:400体积比稀释驴抗兔荧光二抗AlexaFluor488IgG(H+L)(Invitrogen公司)，并将所得到的稀释液在室温避光孵育细胞1小时。吸弃稀释液并用PBS缓冲液润洗细胞三次，每次5分钟。用PBS缓冲液按1:300体积比稀释DAPI，室温避光孵育细胞3分钟。吸弃DAPI溶液后用PBS缓冲液润洗细胞两次后置于倒置荧光显微镜下观察细胞的染色情况，并随机计数三个视野计算Ki67的染色阳性率。染色结果如图9所示，其中，(1)、(3)、(5)、(7)、(9)、(11)、(13)和(15)分别为对照组、实验组1～7的Ki67蛋白荧光染色结果，白点代表Ki67蛋白阳性；(2)、(4)、(6)、(8)、(10)、(12)、(14)和(16)分别为对照组、实验组1～7的细胞核染料DAPI的染色结果，白点代表细胞核。与对照组相比，外泌体、表皮生长因子或碱性成纤维生长因子处理后，细胞核内Ki67阳性细胞比例显著提高，表明更多的细胞进入细胞周期并处于增殖状态，而经过实验组4～7处理后，Ki67的阳性率均高于实验组1～3，经过实验组7处理后，Ki67的阳性率最高，进一步表明外泌体、碱性成纤维生长因子及表皮生长因子协同作用，能够发挥更好地修复效果。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 2 3