20S蛋白酶体抑制剂在制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物中的用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及20S蛋白酶体抑制剂在制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物中的用途。

背景技术：

日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属黄病毒科黄病毒属，是引起神经系统传染病——日本乙型脑炎的病原体，同属的其他成员还有西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、黄热病毒(Yellowfever virus，YFV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)1-4型、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)等。该病毒主要通过携带病毒的蚊虫叮咬进行传播，而三带喙库蚊是该病毒最主要的传播媒介，因此，该病毒的流行呈现明显的季节性，夏秋季节多发。

日本乙型脑炎病毒主要感染猪、马、牛等动物以及人类。猪是日本乙型脑炎病毒的中间宿主，妊娠母猪感染日本乙型脑炎病毒后会出现突发性的流产，流产胎儿多为死胎或木乃伊胎；仔猪感染后呈稽留热、精神沉郁、嗜睡、食欲减退，个别表现为明显的神经症状；公猪感染后除具有以上症状外，还表现出睾丸炎症状，严重者可能丧失配种能力。人群对乙脑病毒普遍易感，在感染日本乙型脑炎病毒后会出现急性脑炎症状，主要表现为持续性的高热、意识障碍、运动失调，严重者还会出现癫痫、呼吸衰竭等症状，甚至可能引起病人死亡。

日本乙型脑炎病毒流行区域广泛，其流行区主要分布于亚洲及西太平洋地区，严重危害人类健康。据统计，全球每年约有5万人感染此病，约1.5万人患病死亡，约二分之一的幸存者因此病而遭受严重的后遗症。目前，尚没有药物可以有效的治疗日本乙型脑炎病毒感染，但已有较多关于抗炎药、抗生素等“老药新用”的研究关注于该病的治疗。

硼替佐米(Bortezomib)的CA登记号为179324-69-7，其化学名为N-(2-吡嗪羰基)-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸，是一种硼酸二肽，是20S蛋白酶体的高选择性可逆抑制剂，其作用于错误折叠蛋白的降解；埃沙佐米的CA登记号为1072833-77-2，其化学名为B-[(1R)-1-[[2-[(2,5-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸，是氮端加帽的二肽亮氨酸硼酸，抑制20S蛋白酶体的糜蛋白酶类(β5)水解位点；卡非佐米的CA登记号为868540-17-4，其化学名为(S)-2-((S)-2-(2-(2H-1,4-恶嗪-4(3H)-基)乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺)-4-甲基-N-((S)-1-((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)戊酰胺，是一种四肽基还氧骨架蛋白酶体抑制剂，主要抑制20S蛋白酶体的糜蛋白酶，临床上多将这几种药物用于治疗多发性骨髓瘤。目前，尚无将硼替佐米、卡非佐米、埃沙佐米用于治疗日本乙型脑炎病毒感染的先例。

技术实现要素：

针对目前临床上对日本乙型脑炎病毒感染治疗药物的需求，本发明提供了20S蛋白酶体抑制剂在制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物中的用途，为日本乙型脑炎病毒感染治疗的临床用药提供了新的选择。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明提供了20S蛋白酶体抑制剂在制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物中的用途，所述20S蛋白酶体抑制剂为硼酸类20S蛋白酶体抑制剂或环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂。

发明人研究发现，硼酸类或环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂能够有效治疗日本乙型脑炎病毒感染，可用于制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物，为临床用药提供了新的选择。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述硼酸类20S蛋白酶体抑制剂包括如下(a)或(b):

(a)硼替佐米或其药学上可接受的盐；

(b)埃沙佐米或其药学上可接受的盐。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂包括卡非佐米或其药学上可接受的盐。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述硼酸类20S蛋白酶体抑制剂为硼替佐米或埃沙佐米；所述环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂为卡非佐米。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述20S蛋白酶体抑制剂的成人使用剂量范围为0.5～2mg/kg。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述载体为葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸钠、吐温、琼脂、碳酸钙、淀粉类及其衍生物、纤维素及其衍生物中的至少一种。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述稀释剂为水、林格氏液或缓冲盐水。

作为本发明所述的用途的优选实施方式，所述药物的剂型为注射液、口服液或胶囊剂。

相比现有技术中的方案，本发明的优点在于：

本发明通过建立感染日本乙型脑炎病毒的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠的存活率、临床症状及脑组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染日本乙型脑炎病毒后未给药治疗的小鼠作为参比，通过数据统计分析，在存活率、脑组织病变方面，硼酸类或环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂对日本乙型脑炎病毒感染有一定的治疗效果。本发明的硼酸类或环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂能够有效治疗日本乙型脑炎病毒感染，为临床用药提供了新的选择。

附图说明

图1是硼替佐米对JEV感染小鼠存活率的影响。

图2是硼替佐米对JEV感染小鼠脑组织病理症状的影响。

图3是卡非佐米对JEV感染小鼠存活率的影响。

图4是卡非佐米对JEV感染小鼠脑组织病理症状的影响。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好地理解本发明，下面提供相关的解释和说明：

JEV：日本乙型脑炎病毒；

Bortezomib:硼替佐米；

Carfilzomib:卡非佐米。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基于本实验室的药物发现新技术，以PheWAS所得致病基因打分作为初始热度，结合PPI网络，基于HotNet2算法构建致病基因互作网络。从构建的致病基因互作网络出发，通过查询药物-靶标数据库找到靶向同一子网络的多靶标药物，靶向20S蛋白酶体的药物，初步获得对日本乙型脑炎病毒有潜在治疗活性的药物——硼替佐米、埃沙佐米和卡非佐米，其有效药物剂量应该根据病程的严重程度、施药途径和其他相关因素决定。

硼替佐米的化学名为N-(2-吡嗪羰基)-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸，其化学结构式如式Ⅰ所示；埃沙佐米的化学名为B-[(1R)-1-[[2-[(2,5-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸，其化学结构式如Ⅱ所示；卡非佐米的化学名为(S)-2-((S)-2-(2-(2H-1,4-恶嗪-4(3H)-基)乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺)-4-甲基-N-((S)-1-((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)戊酰胺，其化学结构式如Ⅲ所示。

实施例1硼替佐米在治疗感染日本乙型脑炎病毒的小鼠中的应用

一、建立感染日本乙型脑炎病毒的小鼠模型

1、实验材料

(1)实验动物：四周龄Balb/c雌鼠。

(2)毒株：JEV P3株

(3)其他试剂：

1)0.01M PBS缓冲液：称取NaH₂PO₄ 0.593g，Na₂HPO₄ 5.802g，NaCl 17.0g，去离子水(ddH₂O)定容至2L，室温保存备用。

2)DMEM基础培养基：DMEM粉末一瓶，称取NaHCO₃ 3.7g，HEPES 5.95g，加入800mL ddH₂O，充分搅拌溶解，定容至1000mL，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。

2、实验步骤

小鼠腹腔注射10⁶PFU乙脑病毒，对照组小鼠腹腔注射同等剂量的DMEM培养基。在随后的时间里，观察并记录小鼠的死亡数量。

3、实验结果

在攻毒后的5-14天里，部分感染日本乙型脑炎病毒的小鼠死亡，且表现出瘫痪、划水、全身颤抖等临床症状。在感染后第6天症状最为严重，而在感染23天后基本恢复。

二、硼替佐米对感染日本乙型脑炎病毒的小鼠的治疗效果评价

1、实验药品

硼替佐米，性状：白色粉末，使用方法：使用2％DMSO+30％PEG 300+ddH₂O溶解，静脉注射。

2、具体实验步骤

(1)动物实验分组与收样

四周龄Balb/c雌鼠分为四组：PBS组(空白对照组，15只)、硼替佐米组(药物参照组，15只)、JEV组(P3株感染组，15只)、JEV+硼替佐米组(P3株感染治疗组，15只)。

小鼠腹腔注射10⁶PFU乙脑病毒，在接毒第1、2、4、6、8、10、12天分别尾静脉注射1mg/kg的硼替佐米。观察并记录小鼠的死亡数量。

在病毒感染后第6天与第23天收样。每组3只取脑组织匀浆，另取2只进行石蜡包埋，剩余10只用于统计死亡率。

(2)脑组织固定与包埋，HE染色检测小鼠脑组织的病理症状

用颈椎脱位法处死小鼠，置70％乙醇中浸泡3-5min，取出后消毒颈背处皮肤，无菌取出脑组织，于基础DMEM中清洗一次，沿正中矢状面垂直横切，放入4％多聚甲醛中固定48h。流水冲洗24h，修块并用梯度酒精脱水，水杨酸甲酯处理透化2h，入蜡包埋。制作石蜡切片(4μm)，并进行HE染色。将制备成功的鼠脑切片依次进行脱蜡、苏木精染色，用50％、75％、80％的酒精脱水后用伊红染色，再分别用95％、100％的酒精对切片进行漂洗，最后用二甲苯做切片透明处理，用中性树胶封存。

3、实验结果

(1)硼替佐米对JEV感染小鼠存活率的影响。

攻毒实验持续至感染后23天，存活小鼠基本无明显的神经症状。由图1可知，在感染5-10天，JEV组死亡数量急剧上升，直到第14天才未出现死亡小鼠，最终死亡率达到90％。而JEV+硼替佐米组小鼠死亡数量明显少于JEV组，最终死亡率为60％，说明硼替佐米可有效降低JEV感染引起的小鼠死亡。PBS组与硼替佐米组未见任何死亡，说明硼替佐米对小鼠的健康无影响。

(2)硼替佐米对JEV感染小鼠脑组织病变的影响。

通过对小鼠脑组织切片进行比对分析，结果如图2所示，在病毒感染后第6天，JEV组脑膜明显有大量炎性细胞聚集，且皮质细胞层紊乱，此外，在其脑皮质还可观察到大量血管袖套、胶质细胞结节、神经元空泡样坏死等现象。同一时间点JEV+硼替佐米组的病理变化有所轻缓，而PBS组与硼替佐米组都没有明显病变。

由此可见，本专利涉及的硼酸类20S蛋白酶体抑制剂硼替佐米对于日本乙型脑炎病毒感染确实有一定的治疗效果。

本实施例中的硼替佐米可替换为其它的硼酸类20S蛋白酶体抑制剂具有类似的效果，如硼替佐米药学上可接受的盐、埃沙佐米或其药学上可接受的盐。

实施例2卡非佐米在治疗感染日本乙型脑炎病毒的小鼠中的应用

一、建立感染日本乙型脑炎病毒的小鼠模型

建立感染日本乙型脑炎病毒的小鼠模型的步骤同实施例1，卡非佐米对感染日本乙型脑炎病毒的小鼠治疗效果如下：

二、卡非佐米对感染日本乙型脑炎病毒的小鼠的治疗效果评价

1、实验材料

(1)药品：卡非佐米，性状：白色粉末，使用方法：使用2％DMSO+30％PEG 300+2％Tween 80+ddH₂O溶解，静脉注射。

(2)其他试剂：4％多聚甲醛。

2、具体实验步骤

(1)动物实验分组与收样：

四周龄Balb/c雌鼠分为四组：PBS组(空白对照组，15只)、卡非佐米组(药物参照组，15只)、JEV组(P3株感染组，15只)、JEV+卡非佐米组(P3株感染治疗组，15只)。

小鼠腹腔注射10⁶PFU乙脑病毒，对照组小鼠腹腔注射同体积的DMEM培养基。在接毒第1、2、4、6、8、10、12天分别尾静脉注射2mg/kg的卡非佐米。观察并记录小鼠的死亡数量。

在病毒感染后第6天与第23天收样。每组3只取脑组织匀浆，另取2只进行石蜡包埋，剩余10只用于统计死亡率。

(2)脑组织固定与包埋，HE染色检测小鼠脑组织的病理症状

用颈椎脱位法处死小鼠，置70％乙醇中浸泡3-5min，取出后消毒颈背处皮肤，无菌取出脑组织，于基础DMEM中清洗一次，沿正中矢状面垂直横切，放入4％多聚甲醛中固定48h。流水冲洗24h，修块并用梯度酒精脱水，水杨酸甲酯处理透化2h，入蜡包埋。制作石蜡切片(4μm)，并进行HE染色。将制备成功的鼠脑切片依次进行脱蜡、苏木精染色，用50％、75％、80％的酒精脱水后用伊红染色，再分别用95％、100％的酒精对切片进行漂洗，最后用二甲苯做切片透明处理，用中性树胶封存。

3、实验结果

(1)卡非佐米对JEV感染小鼠存活率的影响。

攻毒实验持续至感染后23天，存活小鼠基本无明显的神经症状。由图3可知，在感染5-10天，JEV组死亡数量急剧上升，直到第14天才未出现死亡小鼠，最终死亡率达到80％。而JEV+卡非佐米组小鼠死亡数量明显少于JEV组，最终死亡率为60％，说明卡非佐米可有效降低JEV感染引起的小鼠死亡。PBS组与卡非佐米组未见任何死亡，说明卡非佐米对小鼠的健康无影响。

(2)卡非佐米对JEV感染小鼠脑组织病变的影响。

通过对小鼠脑组织切片进行比对分析，结果如4所示。在病毒感染后第6天，JEV组脑膜明显有大量炎性细胞聚集，且皮质细胞层紊乱，此外，在其脑皮质还可观察到大量血管袖套、胶质细胞结节、神经元空泡样坏死等现象。同一时间点JEV+卡非佐米组的病理变化有所轻缓，而PBS组与卡非佐米组都没有明显病变。

由此可见，本专利涉及的20S蛋白酶体抑制剂卡非佐米对于日本乙型脑炎病毒感染确实有一定的治疗效果。

本实施例中的卡非佐米可替换为其它的环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂，如卡非佐米药学上可接受的盐。

本发明涉及的药物可以制备为任何形式，例如颗粒、粉末、片剂、胶囊、注射液或口服液。

本发明的药物可进一步包括一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂，这些载体将适当配制以便于给药，药学上可接受的稀释剂可以为水、林格氏液、缓冲盐水；药学上可接受的载体为葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸钠、吐温、琼脂、碳酸钙、淀粉类及其衍生物、纤维素及其衍生物中的至少一种。

综上，本发明通过建立感染日本乙型脑炎病毒的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠的存活率、临床症状及脑组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染日本乙型脑炎病毒后未给药治疗的小鼠作为参比，通过数据统计分析，在存活率、脑组织病变方面，硼酸类或环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂对日本乙型脑炎病毒感染有一定的治疗效果。本发明的硼酸类或环氧酮类20S蛋白酶体抑制剂能够有效治疗日本乙型脑炎病毒感染，为临床用药提供了新的选择。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。