一种提高免疫抑制动物免疫水平的中药组合物及其提取物和应用的制作方法

本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种提高免疫抑制动物免疫水平的中药组合物及其提取物和应用。

背景技术：

免疫系统是人和高等动物识别自我和危险信号、引发免疫应答、发挥免疫效应和最终维持自身稳定的组织系统，是机体抵御外界因素侵害的重要屏障，许多致病因素可通过削弱甚至摧毁机体的免疫功能而致病。免疫系统是一个非常复杂的生理系统，它能对环境中千差万别的、各式各样的抗原刺激作出相应的反应，这种反应的发生、发展、强度和类型又受多种因素的影响和调节，以使反应和谐而协调的进行，从而维持机体内环境的稳定性，亦即通过免疫调节机制来控制免疫应答正常进行。

相反如果动物机体在单一或多种致病因素的共同作用下，免疫系统受到损害，导致机体暂时性的或持久性的免疫应答功能紊乱，以及对疾病表现高度的易感性，说明动物免疫功能异常，即免疫抑制。一旦免疫抑制造成免疫系统崩解，其它病原则会侵危害机体，最终导致死亡等，常被称为免疫抑制综合征，具有普遍性、整体性及隐蔽性。当前各种引起免疫抑制的因素广泛存在于我国畜禽养殖中.是造成特异性免疫失败(疫苗免疫)及诱发各种疾病的元凶之一。因此提高免疫抑制动物机体的特异性与非特异性免疫力，减少由于疾病而造成的重大损失。

目前用于临床治疗免疫功能低下疾病的药物并不多，按有无免疫原性分为具有免疫原性和非免疫原性。具有免疫原性的免疫增强剂有卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌和细胞因子等，这类增强剂以注射剂型为主，使用受到一定限制，且易引起超敏反应或自身免疫反应等副作用。非免疫原性有铝剂、左旋咪唑、羊毛脂、维生素和维生素等等。这一类的增强剂效果较弱，常只能增强细胞或体液免疫中的某一方面。

中药是我国传统的医学瑰宝，一方面，中药可以增强机体细胞免疫及体液免疫功能，促进淋巴细胞、单核巨噬细胞以及造血干细胞的生理功能；另一方面，中药也具有免疫抑制功能，能减少炎性因子的释放，抑制或消除抗体的产生，抑制细胞的增殖等。目前研究发现，大多数中药具有免疫双向调节功能，使过高或过低的免疫反应恢复正常。这种双向免疫调节作用，实际上正体现了中医所强调的整体观与阴阳平衡理论。机体的免疫功能属于中医学正气的范畴，即机体的抗病防病能力。人体正气旺盛时，防病抗病能力强，即古人所言：正气存内、邪不可干；正气低下时，防病抗病能力下降，邪气乘虚而入，即古人所言：邪之所凑，其气必虚。

而且中药因资源丰富价格低廉毒副作用小无有害残留等在动物规模化生产中被广泛重视，随着中药研究的发展，我们已经逐步意识到中药在机体免疫系统调节方面的作用，因此筛选具有增强畜禽免疫功能的中药复方有广阔的应用前景。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于：

(1)提供一种提高免疫抑制小鼠免疫水平的中药组合物；

(2)提供一种提高免疫抑制小鼠免疫水平的中药组合物的提取物。

为达到上述目的，根据我国传统医学理论，结合现代医学药理研究和临床实践经验而组成的方剂，由黄芪、当归、白术、甘草、大枣、苦参、金银花、鱼腥草组成。通过探讨该复方对免疫抑制小鼠免疫器官、腹腔巨噬细胞吞噬能力、外周血溶血素及免疫球蛋白含量等方面进行研究，本发明提供如下技术方案：

1、一种提高免疫抑制小鼠免疫水平的中药组合物，按重量份量计由以下组分组成：黄芪12份、当归10份、白术10份、甘草8份、大枣5份、苦参3份、金银花3份、鱼腥草3份。

2、由所述的提高免疫抑制小鼠免疫水平的中药组合物制得的提取物。

优选的，所述提取物采用以下方法制得：按照中药组合物的组成称取各味药材，粉碎并过12目筛，加水煎煮3次，合并煎煮液，95～100℃下蒸发浓缩至浓度为1.0g/ml，即制得提取物。

优选的，所述提取物采用以下方法制得：按照中药组合物的组成称取各味药材，粉碎并过12目筛，加入相当于8味药材总重量6.5倍量的水，浸泡1.0h，煎煮1.0h，过滤，收集滤液，药渣再加入相当于8味药材总重量6.5倍量的水，煎煮30min，过滤，收集滤液，药渣再加入相当于8味药材总重量6.5倍量的水，煎煮30min，过滤，收集滤液，合并三次滤液，100℃下蒸发浓缩至浓度为1.0g/ml，即制得提取物。

本发明的有益效果在于：机体的免疫功能属于中医学正气的范畴，本发明主要以黄芪、当归补气、补血为主，辅以白术、甘草、大枣补脾益气、燥湿利水，从而提高机体正气。该中药组合物配伍独特、疗效确切、毒副作用低、成本低廉。动物试验结果显示，该复方能够有效提高免疫抑制小鼠的免疫水平，从而为增强畜禽机体的免疫功能提供了更好的备选药物。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为各试验组小鼠死亡率；

图2为各试验组小鼠体重变化情况。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

小鼠免疫抑制模型的建立

1、试验方法

用无菌水配制质量浓度为10mg/mL的环磷酰胺溶液(CY)，密封，4℃保存。取70只小鼠，雌雄各半，腹腔注射CY(按小鼠体重每次100mg/kg)，1次/d，连用3d，构建小鼠免疫抑制模型。另取20只小鼠为健康对照，腹腔注射生理盐水(0.2ml/10g)。与正常小鼠比较，若造模小鼠出现严重脱毛、精神不振、食欲明显下降等现象，随机取其中几只小鼠进行解剖检查，发现脾脏萎缩，肝脏发白，胸腺受损等，则表明免疫低下小鼠模型建立成功。

2、试验结果

与空白组比较观察发现：注射环磷酰胺组小鼠出现精神不振、被毛逆立、脱毛、食欲下降、体重下降等现象；随机抽取其中几只小鼠进行解剖检查发现：小鼠胸腺、脾脏萎缩，肝脏发白等，表明免疫低下小鼠模型建立成功。

实施例2

从免疫抑制小鼠免疫器官、腹腔巨噬细胞吞噬能力、外周血溶血素及免疫球蛋白含量等方面进行研究提高免疫抑制小鼠免疫水平的中药组合物对免疫抑制小鼠的防治作用。

1、试验方法

(1)中药组合物的制备

按照中药组合物的组成称取黄芪60g、当归50g、白术50g、甘草40g、大枣25g、苦参15g、金银花15g、鱼腥草15g，粉碎并过12目筛，加入1775g水，浸泡1.0h，煎煮1.0h，过滤，收集滤液，药渣再加入1775g，煎煮30min，过滤，收集滤液，药渣再加入1775g的水，煎煮30min，过滤，收集滤液，合并三次滤液，100℃下蒸发浓缩至浓度为1.0g/ml，即制得提取物。

(2)试验分组与处理

将建模成功且体重在18-22g之间的小鼠随机分为阳性药物组(黄芪多糖30mg/kg灌胃给药)、中药复方组(高、中、低剂量组分别按40g/kg、20g/kg、10g/kg灌胃给药)，模型组(灌服生理盐水，0.2ml/10g)，注射生理盐水的小鼠为空白对照组(灌服生理盐水，0.2ml/10g)，每组10只。连续灌服7d，每天1次。同时每天定时观察并记录小鼠的精神状况、饮食、死亡等临床表现等,并于试验前后记录小鼠体重、死亡率等。

(3)免疫器官指数测定

各组分别于给药7d后称重，取各组小鼠脾和胸腺称重，按以下公式计算各组小鼠脾脏指数及胸腺指数。

(4)腹腔巨噬细胞吞噬功能

鸡BRC悬液的制备

于无菌操作下，肝素抗凝自鸡翼下静脉采血，用生理盐水洗涤3次，前2次离心速度为1500rpm/min，离心5min，弃去上清液和界面的白细胞层，最后应连续2次离心，速度2000rpm/min，离心5min，直至鸡红细胞压积值恒定，用生理盐水配成5％的鸡红细胞悬液。

腹腔巨噬细胞吞噬功能

各组分别于给药后7d称重，并腹腔注射5％鸡红细胞0.5ml，8h后处死小鼠，腹腔注入PBS2ml，轻揉小鼠腹部1min，吸取腹腔液体0.5ml于载玻片上在37℃孵育30min，甲醇固定5min，Giemsa染色，每张涂片油镜下计数200个巨噬细胞，按以下公式计算吞噬率和吞噬指数。

(5)血清溶血素的测定

在给药第3d时，各组小鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.2ml，连续5d，末次给药24h，各组小鼠摘眼球采血，3500r/min进行离心分离得血清，于4℃冷藏备用。取部分血清用生理盐水稀释100倍，取其1ml与0.5ml 5％鸡红细胞悬液和0.5ml 10％豚鼠补体混匀，对照管以1ml生理盐水代替，其余步骤同上。上述样品放置于37℃恒温箱中30min，于4℃冰箱终止反应，最后2000r/min离心10min，取上清液1mL，放置10min后，以对照管作为空白调零，于540nm处测样品A值。按以下公式计算HC-50。溶血素半数溶血值HC50＝(样品吸光度值/鸡红细胞半数溶血时吸光值)×稀释倍数。

(6)中药复方对免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白IgG、IGM含量的影响

取(5)中分离血清采用酶联免疫吸附法进行测定(Mouse IgG ELISA kit，Mouse IgM ELISA kit试剂盒购买于上海瑶韵生物科技有限公司)，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，如表1。最后用全自动酶标仪在450nm波长处测定吸光度(OD值)，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

表1各孔加样标准

2、试验结果

(1)临床表现及死亡率

给药前，与空白组比较，模型组、阳性药物组、复方高、中、低剂量组小鼠出现精神不振、被毛逆立、脱毛、食欲下降等临床表现。给药第4d发现，复方中剂量组小鼠较其它给药组小鼠精神好转，活动量增加，被毛光滑，无掉毛，食欲开始恢复等现象。与给药组比较，模型组小鼠精神较沉郁，聚堆，被毛逆立，掉毛现象严重，食欲减退。据图1可知：空白组、阳性药物组、复方高、中剂量组小鼠死亡率均低于模型组小鼠死亡率；据图2可知：试验期间，各试验组小鼠体重均增加，与模型组比较，复方中、低剂量组体重增长数较高。

(2)免疫器官指数测定

由表2可知，各试验组小鼠胸腺指数均无显著性差异(P>0.05)，无统计学意义；模型组小鼠脾脏指数为2.49，与空白组比较有显著差异(P<0.05)，与模型组比较，复方中、低剂量组小鼠脾脏指数显著性升高(P<0.05)。

表2中药复方对小鼠免疫器官的影响

注：同一列肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

(3)腹腔巨噬细胞吞噬功能

由表3可知，模型组小鼠吞噬率、吞噬指数分别为15.67、0.19，与空白组比较具有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较，复方高、中、低剂量组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数均显著性升高(P<0.05)。

表3中药复方对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数的影响

注：同一列肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

(4)血清溶血素的测定

由表4可知，与模型组相比复方中剂量组小鼠血清溶血素含量极显著性升高(P<0.05)，与空白组比较没有极显著性差异(P>0.05)。

表4中药复方对小鼠血清溶血素的影响

注：同一列肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同一列肩标相同大写字母表示没有极显著差异(P>0.01)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

(5)中药复方对免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白含量的影响

由表5可知，模型组小鼠血清中IgG、IgM含量与空白组比较，极显著降低(p＜0.01)；与模型组比较，中药复方高、中、剂量组IgG、IgM含量均升高，差异极显著(p＜0.01)。

表5中药复方对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响

注：同一列肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同一列肩标相同大写字母表示没有极显著差异(P>0.01)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

中草药具有残毒低，能够调节机体的免疫机能，生产无公害的绿色产品，在畜牧业生产中发挥着越来越重要的作用。本发明基于以上试验结果，可以得出结论：当由组方黄芪12份、当归10份、白术10份、甘草8份、大枣5份、苦参3份、金银花3份、鱼腥草3份中药组合物制备的提取物对提高免疫抑制小鼠的免疫水平有较好的效果。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。