本发明属于生物医药领域，具体涉及一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法。
背景技术：
止血是紧急医疗救治的一个重要步骤，病人在手术治疗过程、日常生活中出现突发性创伤时，均需进行快速的止血。手术过程中创面止血，及术后伤口的换药是十分重要的环节，传统的敷料如纱布、敷伤巾等，不仅吸附性差，抑菌作用、与机体的相容性、透气、透湿等方面存在缺陷，创面肉芽组织容易长入敷料的网眼中，更换敷料时容易与创面的伤口粘连，损伤新生的肉芽组织和上皮组织，引起再次损伤和出血，加大了细菌感染的机率，不仅降低了伤口的愈合速度还会产生严重的并发症，不仅增加了患者的痛苦，又增加患者的经济负担。
随着医疗技术的发展，可溶性止血材料得到了广泛关注。壳聚糖[(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D葡聚糖]是甲壳素[(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D葡聚糖]经碱处理脱去乙酰基而制成的天然生物多糖分子，是天然多糖中唯一的碱性氨基多糖。壳聚糖具有良好的生物相容性，可生物降解，可促进凝血和血栓的形成，能抑制多种细菌和真菌的生长，而且具有促进创伤组织再生、修复、愈合，易于形成凝胶，来源广泛，价格低廉等优点。该类材料易于加工成型，适合作为敷料使用，成为新型医用生物止血材料的研究热点。
现在市场根据壳聚糖的生物特性，制成可溶性纱布，虽然抗菌性能优异，但成本很高，加重了病人的负担。也有将壳聚糖制成凝胶，但孔径在50μm左右，无法提供细胞生长和营养血管的空间，影响细胞分泌基质和营养物质的渗入，所以只适合皮肤表面的止血，无法满足适合体内止血的要求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法，在壳聚糖形成凝胶的基础上，加入富血小板血浆(platelet-rich plasma)，制备一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布，孔径在130-160μm之间，内含大量的生长因子和丰富的纤维蛋白网络，不仅易被人体吸收，无毒副作用，能抑制多种细菌和真菌的生长，为细胞生长提供了更多的结构空间，在体内、体外均可释放各种生长因子，更利于组织的修复和血管重塑。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法，包括如下步骤：
S1、按照重量比例称取辅料配置血小板预处理液；
S2、制备血小板冻干缓冲液；
S3、制备预处理的富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)；
S4、配置羧甲基壳聚糖(carboxyethyl chitosan，CC)溶液；
S5、制备富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布。
所述的辅料由包含以下重量份的原料组成：3.214gNaCl、0.157gKCl、0.078gCaCl2、0.271gMgSO4、2.604gNaHCO3、0.714g柠檬酸、1.970g柠檬酸钠、1.230g乙酸钠、2.120g葡萄糖、17.117g海藻糖。
S1中所述血小板预处理液的配置方法包括：将3.214gNaCl、0.157gKCl、0.078gCaCl2、0.271gMgSO4、2.604gNaHCO3、0.714g柠檬酸、1.970g柠檬酸钠、1.230g乙酸钠、2.120g葡萄糖、17.117g海藻糖均匀混合后，用超纯水溶解并定容至1L，按1ml所述血小板预处理液加入1ul可逆性血小板激活抑制剂的比例加入可逆性血小板激活抑制剂前列腺素E1，然后加入NaHCO3来调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用。
S2中所述血小板冻干缓冲液的制备方法包括：在S1中所述血小板预处理液中加入体积分数为30％(vol/vol)的蛋白质类保护剂调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用。
S2中所述蛋白质类保护剂选自血浆。
S3中所述预处理的富血小板血浆的制备方法包括：汇集6-8人份的血小板，通过离心处理并移去上层清液得沉淀A，然后用S1中所述血小板预处理液重悬所述沉淀A，调整所述沉淀A中的血小板计数，在37℃水浴震荡4h，使血小板保持悬浮状态，将上述血小板悬液离心处理并移去上层清液得沉淀B；然后将S2中所述血小板冻干缓冲液离心处理并移去上层清液得沉淀C，将所述沉淀B和沉淀C按照等体积混合重悬血小板，即得预处理的富血小板血浆。
S4中所述羧甲基壳聚糖溶液的配置方法包括：将4g羧甲基壳聚糖用200ml灭菌水彻底溶解，持续搅拌12h，使其彻底溶解，然后用0.45um滤器过滤除菌，终浓度为2％(wt/vol)，并调整pH至7～8。
S5中所述富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法包括：将S3中所述预处理的富血小板血浆与S4中所述羧甲基壳聚糖按体积比为1：2搅拌混合均匀后加入培养皿中，厚度为4mm，密封保存在-80℃冰箱预冻过夜后，转移至冷冻干燥机冻干24h，然后裁剪成不同大小纱布，加入血小板激活剂溶液即可形成富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布。
S5中所述的血小板激活剂溶液为用5ml葡萄糖酸钙溶解500U凝血酶所配制的溶液。
本发明具有如下优点：
1、本发明的可溶性纱布孔径在130-160μm之间，内含大量的生长因子和丰富的纤维蛋白网络，易被人体吸收，无毒副作用，能抑制多种细菌和真菌的生长，为细胞生长提供了更多的结构空间，在体内、体外均可释放各种生长因子，利于组织的修复和血管重塑，抗菌性能优异。
2、原料来源广泛、价格低廉，易于加工成型，是性价比高的新型医用生物止血材料。
附图说明
图1为本申请的工艺流程图。
具体实施方式
本申请实施例提供一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
图1是本申请所述一种富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布的制备方法的工艺流程图，虽然本申请提供了如下述实施例或附图所示的方法操作步骤，但基于常规或者无需创造性的劳动在所述方法中可以包括更多或者更少的操作步骤，在逻辑性上不存在必要因果关系的步骤中，这些步骤的执行顺序不限于本申请实施例或附图所示的执行顺序，所述的方法在实际应用时，可以按照实施例或者附图所示的方法进行顺序执行或者并行执行。
S1、按照重量比例称取辅料配置血小板预处理液：将3.214gNaCl、0.157gKCl、0.078gCaCl2、0.271gMgSO4、2.604gNaHCO3、0.714g柠檬酸、1.970g柠檬酸钠、1.230g乙酸钠、2.120g葡萄糖、17.117g海藻糖均匀混合后，用超纯水溶解并定容至1L，按1ml所述血小板预处理液加入1ul可逆性血小板激活抑制剂的比例加入可逆性血小板激活抑制剂前列腺素E1，然后加入NaHCO3来调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用。
S2、制备血小板冻干缓冲液：在S1中所述血小板预处理液中加入体积分数为30％(vol/vol)的蛋白质类保护剂调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用；其中，蛋白质类保护剂选自血浆。
S3、制备预处理的富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)：汇集6-8人份的血小板，通过离心处理并移去上层清液得沉淀A，然后用S1中所述血小板预处理液重悬所述沉淀A，调整所述沉淀A中的血小板计数，在37℃水浴震荡4h，使血小板保持悬浮状态，将上述血小板悬液离心处理并移去上层清液得沉淀B；然后将S2中所述血小板冻干缓冲液离心处理并移去上层清液得沉淀C，将所述沉淀B和沉淀C按照等体积混合重悬血小板，即得预处理的富血小板血浆。
S4、配置羧甲基壳聚糖(carboxyethyl chitosan，CC)溶液：将4g羧甲基壳聚糖用200ml灭菌水彻底溶解，持续搅拌12h，使其彻底溶解，然后用0.45um滤器过滤除菌，终浓度为2％(wt/vol)，并调整pH至7～8。
S5、制备富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布：将S3中所述预处理的富血小板血浆与S4中所述羧甲基壳聚糖按体积比为1：2搅拌混合均匀后加入培养皿中，厚度为4mm，密封保存在-80℃冰箱预冻过夜后，转移至冷冻干燥机冻干24h，然后裁剪成不同大小纱布，加入血小板激活剂溶液即可形成富含生长因子的壳聚糖可溶性纱布；其中，血小板激活剂溶液为用5ml葡萄糖酸钙溶解500U凝血酶所配制的溶液。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。