盐酸苄丝肼在制备治疗急性炎症的药物中的应用的制作方法

本发明涉及盐酸苄丝肼在制备治疗急性炎症的药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

炎症是富含血管的组织在局部损伤后发生的一种生理反应。在此过程中，各种可溶性介质及炎性细胞以系统的形式一同发挥作用，以消除引起机体损伤的因素表现为红、肿、热、痛和功能障碍。研究表明，炎症过程参与多种疾病的发病过程，如人体感染、肿瘤、心脑血管病、老年痴呆和神经退行性疾病、变态反应疾病等。临床显示，抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物。血清淀粉样蛋白P成分(SAP)属于五聚体血浆蛋白家族，是一种高度保守的急性反应期蛋白，在炎症刺激物的诱导下，SAP的浓度会显著性升高到几倍到几百倍不等。IL-1、IL-6是SAP表达的主要诱导因子。当机体组织遭到破坏时，TNF-α的分泌诱发体内的IL-1和IL-6大量释放，从而诱导肝细胞快速合成SAP。

盐酸苄丝肼收载于中国药典2010年版(ChP 2010)，欧洲药典7.0版(EP7.0)和日本药典16版(JP16)。盐酸苄丝肼是一种外周脱羧酶抑制剂，常与左旋多巴联合制成复合制剂多巴丝肼用于帕金森病的治疗。但目前尚未有盐酸苄丝肼治疗急性炎症的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供盐酸苄丝肼作为治疗急性炎症药物中的应用。

本发明通过动物实验研究了盐酸苄丝肼对急性炎症的治疗效果，试验结果显示盐酸苄丝肼对脂多糖所致小鼠急性炎症产生的炎症因子有抑制作用。具体是通过脂多糖诱导C57BL/6小鼠构造急性炎症模型，采用不同浓度的盐酸苄丝肼对其进行治疗，结果发现盐酸苄丝肼能够降低C57BL/6小鼠急性炎症时产生的炎症因子水平以及肝组织病变程度，其中，低剂量的盐酸苄丝肼效果最佳。将盐酸苄丝肼通过添加药学上可接受的载体制备成临床需要的各种制剂，其有益效果是：为制备急性炎症药物提供新的途径。

附图说明

图1为空白对照组小鼠肝脏组织HE染色镜检图。

图2为模型对照组小鼠肝脏组织HE染色镜检图。

图3为盐酸苄丝肼高剂量组小鼠肝脏组织HE染色镜检图。

图4为盐酸苄丝肼中剂量组小鼠肝脏组织HE染色镜检图。

图5为盐酸苄丝肼低剂量组小鼠肝脏组织HE染色镜检图。

图6为小鼠血清中SAP表达的ELISA结果。

图7为小鼠血清中TNF-α表达的ELISA结果。

图8为小鼠血清中IL-6表达的ELISA结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例

建立急性炎症动物模型及给药处理

所有小鼠均饲养于SPF级动物房内，并采取自由采食及饮水的饲养方式。将50只C57BL/6小鼠(购自南京大学模式生物研究所)随机分成五组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、盐酸苄丝肼低剂量组(25mg/kg/d)、盐酸苄丝肼中剂量组(50mg/kg/d)、盐酸苄丝肼高剂量组(100mg/kg/d)。

对上述五组小鼠采用基础饲料适应性喂养1周后，盐酸苄丝肼低剂量组小鼠注射盐酸苄丝肼25mg/kg/d、盐酸苄丝肼中剂量组小鼠注射盐酸苄丝肼50mg/kg/d和盐酸苄丝肼高剂量组小鼠注射盐酸苄丝肼100mg/kg/d，空白对照组和模型对照组则注射相应体积的生理盐水。连续给药处理7天后，模型对照组、盐酸苄丝肼低剂量组、盐酸苄丝肼中剂量组、盐酸苄丝肼高剂量组注射3mg/kg脂多糖，而空白对照组小鼠注射相应体积的生理盐水。分别于注射脂多糖后0h，2h，4h，8h收集血液样本，8h取血后处死小鼠，获得肝脏组织样本。随后进行ELISA实验和HE染色。

HE染色实验

实验结束后，剖取肝脏固定于10％福尔马林溶液内，常规取材，脱水，石蜡包埋，切片(4微米厚)。HE染色：(1)石蜡切片常规脱蜡：二甲苯(I)15min→二甲苯(II)(应完全透明)10min；(2)逐级下行梯度乙醇浸泡水化：100％乙醇(I)2min→100％乙醇(II)2min→95％乙醇2min→80％乙醇2min→自来水冲洗片刻；(3)染色：蒸馏水洗片刻→苏木素液染核5min→自来水冲洗片刻→1％盐酸乙醇分化30s(提插数下)→流水冲洗片刻→弱氨水水溶液反蓝数秒→流水冲洗10min→置0.5％伊红水溶液中复染10min；(4)逐级上行梯度乙醇脱水：自来水冲洗片刻(分化伊红)→95％乙醇(I)2min→95％乙醇(II)2min→100％乙醇(I)2min→100％乙醇(II)2min；(5)透明：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min；(6)固定、封片：盖玻片下中性树脂固定、封片。(6)光学显微镜下检查。

光学显微镜下观察结果：空白对照组，肝组织由肝小叶和小叶间的门管区组成，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，门管区可见小叶间胆管，小叶间静脉和小叶间动脉，如图1。模型对照组，肝组织结构同空白组，结构尚清晰。肝细胞脂变，表现为肝细胞胞浆可见细小泡沫状的脂滴空泡；中央静脉内可见白细胞靠边；枯否氏细胞增生；其中1只小鼠可见灶性肝细胞坏死，局灶性炎。如图2。盐酸苄丝肼高剂量组，肝组织结构同空白组，结构清晰，病理改变和模型组一致，病变程度略有减轻，如图3。盐酸苄丝肼中剂量组，肝组织结构同空白组，结构清晰，病理改变和模型组一致，病变程度较高剂量组略有减轻，如图4。盐酸苄丝肼低剂量组，肝组织结构同空白组，结构清晰，病理改变和模型组一致，病变程度较高剂量组略重，如图5。

ELISA检测小鼠血清中SAP、TNF-α、IL-6表达变化

血液标本收集完毕后，立即置于冰上。2h后，3000r/min4℃离心，时间为15min。提取血清后，进行ELISA检测。(1)加样：血清样品每空100μL。(2)加检测抗体：50μL/well加入生物素化抗体工作液。混匀后，盖上封板膜，37℃孵育90分钟。(3)洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入洗涤液；停留1分钟后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。(4)加酶：100μL/well链霉亲和素-HRP工作液。盖上封板膜，37℃孵育30分钟。(5)洗板：重复步骤3。(6)显色：100μL/well加入TMD，37℃避光温育5-30分钟，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟。(7)终止反应：100μL/well迅速加入终止液终止反应。小鼠血清中SAP、TNF-α、IL-6表达变化结果分别如图6、图7、图8。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。