联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球及其制备方法和应用。

背景技术：

骨肉瘤是常见的骨骼系统原发恶性肿瘤之一，起源于骨间叶细胞，其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。典型的骨肉瘤比较罕见，其发病率约为百万分之0.3，其中包括0.2％的恶性肿瘤和15％的原发性骨肿瘤。典型的骨肉瘤好发于8-25岁的男性，好发部位为长骨，最常见于股骨远端或胫骨近端，其次为肱骨近端，其他部位少见，其血行转移发生早且发生率高。1970年之前，骨肉瘤的标准治疗方法为截肢，然而80％的患者在确诊时已经发生了转移。从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月，5年生存率较低，大部分患者于确诊后1年内死亡。近年来，随着化疗的开展、手术技术的改进，骨骼重建以及其他的治疗方法的引进，骨肉瘤保肢治疗已逐渐取代截肢治疗，80％的患者更愿意接受保肢治疗，患者的5年生存率也从20％左右提高到了55％～75％。

20世纪70年代至今，化疗始终在骨肉瘤治疗过程中占据重要地位，现今，常常将化疗与手术切除联合应用以治疗骨肉瘤。在骨肉瘤的化疗中，阿霉素的治疗具有显著的作用，其治疗的机理在于其能够插入细胞DNA，引发拓扑异构酶II介导的DNA单链以及双链结构的断裂。

虽然阿霉素是治疗骨肉瘤非常有效的化疗药物，但其副作用也是显而易见的，阿霉素最显著的副作用在于它的心脏毒性和骨髓抑制作用，当使用剂量过大时，将会导致不可逆的心力衰竭，阿霉素的以上副作用大大限制了其在骨肉瘤治疗中的应用。

此外，骨肉瘤的治疗可能会导致大范围的骨缺损，即使骨肉瘤疾病被治愈也会严重影响到患者的生活质量，较常用的填充骨间隙的方法为骨移植或者使用替代性骨材料。目前，人们已经认识到骨膜是植骨愈合与重建起始的关键，因此，也逐渐加大了对骨膜相似材料的研究。

因此，如何将骨膜与药物化疗相结合，以治疗骨肉瘤疾病，并保证治疗的效果，具有重要的研究意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，以缓解骨肉瘤治疗中出现的严重骨缺损的问题。

本发明提供了一种联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球。

进一步的，所述联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球的载药量为6.0-6.4μg/mg。

本发明的第二个目的在于提供联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球的制备方法。

本发明提供了一种联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球的制备方法，该方法包括：将所述阿霉素明胶微球与所述骨膜去细胞支架用交联剂进行交联。

进一步的，所述骨膜去细胞支架由骨膜经过物理冻融操作和去污剂洗脱操作获得。

进一步的，所述物理冻融操作的温度为-80℃，所述物理冻融操作的时间为1-2h。

进一步的，所述去污剂包括tritonX-100和SDS。

进一步的，所述骨膜去细胞支架的具体制备步骤如下：

步骤(a)，取骨膜于-80℃放置2h，取出后于20℃下用PBS溶液震荡去血，得到去血的骨膜；

步骤(b)，将所述去血的骨膜在摇床上依次用1％tritonX-100震荡6h，2.4％SDS震荡12h，重复操作1-2次，然后用去离子水震荡24h，得到所述骨膜去细胞支架，所述震荡的频率为100r/min。

进一步的，所述阿霉素明胶微球的具体制备步骤如下：

步骤(a)，用蒸馏水配制含有1mg/mL阿霉素以及0.05g/mL明胶的溶液，作为水相；

步骤(b)，取Tween-80、Span-80和液体石蜡混匀，作为油相，所述油相中Tween-80、Span-80和液体石蜡的体积比为0.24:0.96:25；

步骤(c)，在搅拌下，将所述水相缓慢加入到所述油相中，乳化形成W/O型乳剂，所述水相与所述油相的体积比为5:13；

步骤(d)，将所述W/O型乳剂迅速冷却至5℃以下；

步骤(e)，向所述W/O型乳剂中滴加交联剂，进行固化，得到所述阿霉素明胶微球。

进一步的，所述交联剂包括戊二醛。

另外，本发明还提供了联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。

本发明提供的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，其制备方法为将阿霉素与骨膜去细胞支架交联，所制得的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球的载药量为6.0-6.4μg/m。本发明提供的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，体现了阿霉素明胶微球和骨膜的优点，在保障了药物缓释特性、抑制成骨细胞增殖效果的同时，也有利于骨组织的再生，为骨肉瘤的治疗提供了新的方法和思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为D-periosteum的照片图；

图2A1为N-periosteum经HE染色后的显微图；

图2A2为N-periosteum经HE染色后的显微图；

图2B1为D-periosteum经HE染色后的显微图；

图2B2为D-periosteum经HE染色后的显微图；

图3A1为N-periosteum的Fibrous层的电镜图；

图3A2为N-periosteum的Fibrous层的电镜图；

图3B1为N-periosteum的Cambium层的电镜图；

图3B2为N-periosteum的Cambium层的电镜图；

图3C1为D-periosteum的Fibrous层的电镜图；

图3C2为D-periosteum的Fibrous层的电镜图；

图3D1为D-periosteum的Cambium层的电镜图；

图3D2为D-periosteum的Cambium层的电镜图；

图3E为ADM-GMS的电镜图；

图3F1为ADM-GMS D-periosteum的电镜图；

图3F2为ADM-GMS D-periosteum的电镜图；

图4为D-periosteum和N-periosteum的DNA含量分析数据图；

图5为N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum的吸水性测定数据图；

图6为ADM浓度-吸光度标准曲线图；

图7为ADM、ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum的药物体外释放曲线图；

图8为D-periosteum细胞毒性检测数据；

图9为ADM-GMS D-periosteum细胞毒性检测数据；

图10为ADM、ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum抑制细胞增殖率曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，是将骨膜进行脱细胞处理后形成骨膜去细胞支架，并制备阿霉素明胶微球，然后将阿霉素明胶微球交联于骨膜去细胞支架上。其中，阿霉素明胶微球的平均直径为20.13μm。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例对本发明的内容进行详细的介绍。需要注意的是，如未明确指出，说明书中涉及的操作方法为常规的方法，涉及的试剂、仪器等为常规市售。

为了叙述方便，实施例部分涉及了英文单词或者简称，其中，N-periosteum指未经过去细胞处理的骨膜支架，D-periosteum指去细胞骨膜支架，ADM指阿霉素，GMS指明胶微球，ADM-GMS指阿霉素明胶微球，ADM-GMS D-periosteum指联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球。

实施例1骨膜去细胞支架的制备

取SD大鼠称重，用5％水合氯醛按照0.6mL/100g的量腹腔注射麻醉后俯卧位固定，头部备皮，于双耳间做4cm长纵向切口，暴露颅骨骨膜，剥离后的骨膜用PBS(含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)清洗两次，然后固定于专用支具。

骨膜随后先置于-80℃，2小时后取出，然后在20℃恒温水浴摇床先用PBS震荡去血，后依次用1％tritonX-100震荡6h，2.4％SDS震荡12h，再依次用1％triton X-100震荡6h，2.4％SDS震荡12h(即tritonX-100和SDS清洗操作重复了1次)，最后用去离子水震荡24h，震荡频率为100r/min。

实施例2阿霉素明胶微球的制备

用蒸馏水配制含有1mg/mL阿霉素以及0.05g/mL明胶的溶液10mL，作为水相；取Tween-80 0.24mL，Span-80 0.96mL，液体石蜡25mL混匀，作为油相；在搅拌下，将水相缓慢加入到油相中，乳化形成W/O型乳剂，该乳化过程控制温度55℃；将W/O型乳剂迅速冷却至5℃以下；向W/O型乳剂中滴加200μL戊二醛，进行固化；最后用丙酮脱水三次。

实施例3骨膜去细胞支架与阿霉素明胶微球交联

将制备好的骨膜去细胞支架，加入到用戊二醛固化后的明胶微球中(尚未用丙酮脱水)，置于摇床上震荡30min，并滴加100μL戊二醛。获得的支架自然干燥保存，即得到了联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球。

为了评价本发明提供的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球的效果，现通过以下实验进行测定或者观察，以下效果例中涉及的骨膜去细胞支架、阿霉素明胶微球以及联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球均按照上述实施例进行制备。

以下效果例中涉及的D-periosteum、AMD-GMS和ADM-GMS D-periosteum，均按照本发明实施例的方法制得。另外，效果例中还涉及了GMS D-periosteum，其制备方法与ADM-GMS D-periosteum的制备方法相同，仅不添加ADM。

效果例1 D-periosteum以及ADM-GMS D-periosteum的形态观察

(一)D-periosteum的形态和结构

肉眼观察骨膜的形态，并拍照如图1所示(bar＝1cm)，D-periosteum的形态为半透明的白色片状。

(二)N-periosteum和D-periosteum光学显微镜观察

用N-periosteum和D-periosteum制作组织标本，组织标本经4％多聚甲醛固定、包埋、切片，HE染色后观察组织结构，如图2A1，图2A2，图2B1和图2B2所示。

由图可以看出，骨膜去细胞支架经HE染色后，未见明显细胞，而N-periosteum样本则可见明显的染色后细胞，表明实施例的制备方法成功去除了骨膜的大部分细胞。

图2A1表示N-periosteum经HE染色后的显微图(bar＝1cm)，图2A2表示N-periosteum经HE染色后的显微图(bar＝100μm)；图2B1表示D-periosteum经HE染色后的显微图(bar＝1cm)，图2B2表示D-periosteum经HE染色后的显微图(bar＝100μm)。

(三)N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum的电镜观察

将样品N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum均用含2.5％戊二醛的PBS溶液固化12h，然后用乙醇梯度干燥(依次用50％,70％,80％,95％和100％的乙醇分别干燥15min)，然后用真空干燥箱(HMDS,Sigma,USA)干燥，对干燥后的样品喷金。用S-3000N扫描电镜(HITACHI,Japan)进行观察。电镜图如图3A1，图3A2，图3B1，图3B2，图3C1，图3C2，图3D1，图3D2，图3E，图3F1和图3F2所示。

图3A1和图3A2表示N-periosteum Fibrous层的电镜图，图3B1和图3B2表示N-periosteum Cambium层的电镜图；图3C1和图3C2表示D-periosteum Fibrous层的电镜图，图3D1和图3D2表示D-periosteum Cambium层的电镜图；图3E表示ADM-GMS的电镜图；图3F1和图3F2表示ADM-GMS D-periosteum的电镜图。(bar＝20μm)。

由电镜图可以看出，与N-periosteum相比，D-periosteum的Fibrous层和Cambium层更为光滑；在ADM-GMS D-periosteum中，ADM-GMS成球形，平均直径为21.3μm，ADM-GMS粘附于D-periosteum上。

效果例2 D-periosteum的DNA含量分析

此外，还通过DNA含量分析对D-periosteum的去细胞程度进行了检测。将D-periosteum和N-periosteum样本冻干后，切割成小块，用蛋白酶K和Rnase水解4h后，对其进行DNA含量分析。

结果如图4所示，D-periosteum的DNA含量显著低于N-periosteum，同样表明实施例1的制备方法成功去除了骨膜的大部分细胞成分。

效果例3 N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum的吸水性

将N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum样本用足量PBS在4℃下浸泡12h，然后冻干至恒重，记录冻干前和冻干后的质量，计算膨胀率。

膨胀率(％)＝(Ws-Wd)/Wd

其中，Ws代表冻干前的质量，Wd代表冻干前的质量。

测定结果如图5所示，由图5可以看出，由于去除了细胞组织，D-periosteum较N-periosteum相比，在吸水性上有很大的提升；而用戊二醇交联ADM-GMS后制备的ADM-GMS D-periosteum则比D-periosteum更紧密，ADM-GMS D-periosteum的吸水性也比D-periosteum有所降低。

效果例4 ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum的载药量和体外释放曲线的测定

(1)标准曲线的绘制：称取阿霉素5mg，配制成25mL含有0.05％胰酶的溶液，在磁力搅拌机中37℃中，缓慢搅拌48h。分别取1mL、2mL、4mL、6mL、10mL，定容到10mL，测定每个浓度的溶液于482nm处测量吸光度，绘制标准曲线，计算标准回归方程，结果如图6所示。

(2)载药量的测定：称取ADM-GMS 100mg，配制成30mL含有0.05％胰酶的溶液，37℃条件下，磁力搅拌2h，搅拌速度600r/min，微球完全溶解，测定溶液在482nm处测量吸光度，结合上述标准曲线，计算ADM-GMS的载药量。

按照同样的方法测定ADM-GMS D-periosteum的载药量。最终测得ADM-GMS的载药量为19.9μg/mg，ADM-GMS D-periosteum的载药量为6.2μg/mg。

(3)体外释放曲线的测定：精密称取ADM-GMS 300mg分散于300mL PH7.4PBS中。水浴恒温于(37±0.5℃)，搅拌速度为100r/min，定时取样200μL，同时补充同体积PBS，以同样操作的明胶微球作为空白，482nm处测量吸光度，结合上述标准曲线，计算ADM-GMS累积释药百分数，绘制体外释放曲线。

用同样的方法测定ADM-GMS D-periosteum的体外释放速率，数据如表1所示。

表1 ADM、ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum的累积释药百分数

将表1的数据绘制曲线，如图7所示，由图7可以看出，ADM-GMS D-periosteum的药物释放过程具有缓释的特性，于两小时左右药物基本全部释放。此外，ADM-GMS D-periosteum的药物释放速率与ADM-GMS的药物释放速率基本一致，表明D-periosteum的联合不会对ADM-GMS中药物的释放产生显著的影响。

效果例5细胞毒性检测

(一)D-periosteum毒性检测

(1)成纤维细胞的分离和培养

取大鼠关节处结缔组织，剪切成2×2cm左右的块状，用PBS(含100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)清洗三次，加入3mL 0.25％胰酶37℃消化20min，然后加入6mL高糖培养基HAMF12(DMEM/F12,Gibco,USA)(含10％FBS)，10000r/min离心5min，弃上清后，细胞沉淀用高糖培养基HAMF12(含20％FBS，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素)培养，培养条件37℃，5％CO₂，此后按常规细胞培养方法进行培养，传代三次后用于后续实验。

(2)CCK8检测

D-periosteum样本用PBS(含100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)浸泡24h后剪切成块状，加入50mL高糖培养基HAMF12(含20％FBS)备用。

成骨细胞按照5×10³cells/well的密度接种于96孔板中，用HAMF12(含10％FBS)培养，实验组中加入上述D-periosteum样本，对照组中加入相同体积的培养基。分别于第1，3，5和7天时，用CCK8试剂盒(CCK-8,DOJINDO,Japan)测定细胞活性。结果如图8所示。

图8的实验数据表明，D-periosteum没有对成骨细胞的生长产生抑制作用，而且在第1天和第3天，D-periosteum反而促进了细胞的增长。这表明，本发明制备出了合格的、符合要求的骨膜去细胞支架。

(二)ADM-GMS D-periosteum毒性检测

按照上述D-periosteum毒性检测的方法，将成骨细胞按照5×10⁵cells/well的密度接种于96孔板中，并分成五个实验组进行培养。本实验中，共包含5个实验组，各实验组在进行细胞培养时所用的培养基如下，

对照组(Control组)：HAMF12(含10％FBS)；

ADM组：用HAMF12(含10％FBS)+20mg/L ADM；

ADM-GMS组：用HAMF12(含10％FBS)+1g/L ADM-GMS；

ADM-GMS D-periosteum组：用HAMF12(含10％FBS)+4g/L ADM-GMS D-periosteum；

GMS D-periosteum组：用HAMF12(含10％FBS)+4g/L GMS D-periosteum。

对上述五组实验组，分别于2h，12h和24h用CCK8试剂盒测定细胞活性。结果如图9所示。图9的柱形图中，每个时刻的五个柱形图从左到右，依次为Control组、ADM组、ADM-GMS组、ADM-GMS D-periosteum组和GMS D-periosteum组。

其中，将ADM组、ADM-GMS组和ADM-GMS D-periosteum组的实验数据列于表2，并绘制曲线如图10所示。

表2 CCK-8实验数据

由图10可知，ADM-GMS D-periosteum能够抑制成骨细胞的增殖，而且D-periosteum与ADM-GMS联合之后，并没有降低ADM-GMS对成骨细胞的抑制作用。

以上实验数据表明，按照本发明提供的方法制备的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，阿霉素作为治疗药物，以明胶微球作为载体，并联合于骨膜去细胞支架上，具有抑制成骨细胞增殖的作用。其阿霉素的体外释放速率具有缓释的特性，于2h左右药物基本释放完全，且在体外能够抑制成骨细胞的增殖，预示着其在治疗骨肉瘤疾病中的作用。此外，由于骨膜的存在，将会有利于促进骨组织的再生，对骨肉瘤治疗过程造成的骨缺损有一定的缓解作用。

本发明提供的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，在保证了阿霉素治疗骨肉瘤疾病效果的同时，联合了骨膜，有助于骨组织再生，增加了治疗效果。

此外，本发明提供的联合于骨膜去细胞支架的阿霉素明胶微球，还可进一步与其他药物进行联合，增大治疗的效果，为骨肉瘤的治疗提供了一种新的方法以及思路。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。