一种治疗食管癌的中药组合物及其应用的制作方法

本发明属于中药组合物，特别是涉及一种治疗食管癌的中药组合物及应用。

背景技术：

食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，被认为是世界第八大常见肿瘤，死亡率在我国恶性肿瘤中居第四位。通过进行根治性手术，早期食管癌患者5年生存率可达30％～35％，而进展期的患者生存时间较少超过5年，80％患者死于局部浸润和转移。中医药是我国独特的医疗资源，在改善恶性肿瘤患者体质、减轻副作用、提高生活质量等方面具有重要的临床应用价值。中医认为食管癌的病机总属脾虚不运，痰瘀内生，而以痰气瘀阻多见。基于这一认识，拟定了具有化痰行瘀，生津益气作用中药复方的通膈汤，在临床上联合化疗治疗中晚期食管癌，收到了一定的疗效。例如通膈汤，由北沙参、丹参、急性子、威灵仙、茯苓、川贝母、郁金等组成，源于《医学心悟》中的启膈散，由原方加减而成，是霍介格教授临证时的经验方，其联合化疗对中晚期食管癌具有一定疗效。但是如何得到一种效率高、疗效好、毒副作用小的中药组合物还有待进一步研究，其中明确相应药物对食管癌作用的机制也是研究重点。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是提供一种效率高、毒副作用小的治疗食管癌的中药组合物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述中药组合物的在制备治疗食管癌药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种治疗食管癌的中药组合物，包括以下重量份的各个组分：北沙参5-15份，姜半夏8-12份，丹参10-20份，急性子5-15份，菝葜10-20份，茯苓5-15份，川贝母1-5份，升麻3-10份。

作为本发明的一种最优选技术方案，所述的治疗食管癌的中药组合物，包括以下重量份的各个组分：北沙参10份，姜半夏10份，丹参15份，急性子10份，菝葜15份，茯苓10份，川贝母3份，升麻6份。

上述北沙参、姜半夏、丹参、急性子、菝葜、茯苓、川贝母和升麻为草药本身或草药的提取物。其中，提取物可以采用提取液的形式，或者将提取液加工制成浸膏、软材或颗粒等，上述加工方法为本领域技术人员公知的方法。

本发明配方中的北沙参、川贝母滋阴润燥化痰，丹参化瘀散结，茯苓健脾化痰，急性子破血软坚、消积，姜半夏降逆止呕，菝葜解毒祛风、消肿止痛，升麻升阳发表、透疹解毒。全方扶正与散结，滋阴与化瘀相结合，使祛邪不伤正。

上述中药组合物在制备治疗食管癌药物中的应用也在本发明的保护范围内。

上述中药组合物的含药血清在制备治疗食管癌药物中的应用也在本发明的保护范围内。

上述中药组合物的含药血清用于制备治疗食管癌的药物，主要体现在所述药物可以抑制食管癌细胞增殖、诱导食管癌细胞凋亡。

优选的，所述应用中本发明的中药组合物含药血清浓度为5％以上。

进一步优选的，所述应用中本发明的中药组合物含药血清浓度为10％以上，最优选的为20％。

上述食管癌细胞为eca-109。

有益效果：本发明的中药组合物发挥了中医药辩证与辨病相结合的优势，通过含药血清抑制食管癌eca-109细胞增殖、凋亡、粘附以及侵袭等的体外实验的实验观察和检测，发现本发明的中药组合物，特别是一定浓度范围的本发明中药组合物的含药血清可以显著抑制食管癌eca-109细胞增殖、并诱导食管癌eca-109细胞凋亡、降低细胞粘附及侵袭能力，为进一步研发治疗食管癌的药物提供了基础，并为食管癌患者开辟了希望之路。

附图说明

图1是本发明中药组合物含药血清对细胞eca-109体外增殖活性的影响；

(其中，a、b、c、d分别代表培养时间为12h，24h，48h，72h)

图2是本发明中药组合物含药血清对eca-109细胞周期的影响；

(其中，a：流式细胞术检测20％含药血清对eca-109细胞周期的影响；b：作用48h后结果图)

图3是本发明中药组合物含药血清对eca-109细胞凋亡的影响；

(其中，a：流式细胞术检测20％含药血清对eca-109细胞凋亡的影响；b：作用48h后结果图)

图4是本发明中药组合物临床等效量含药血清对细胞粘附能力的影响；

图5是不同浓度中剂量本发明中药组合物含药血清对细胞侵袭能力的影响；

(其中，a：显微镜下观察各组细胞(×100)；b：计数各组入侵细胞数目，与空白血清组相比较)。

具体实施方式

材料

组分原料：北沙参颗粒(批号：1512123)，姜半夏颗粒(批号：1603094)，丹参颗粒(批号：1605181)，急性子颗粒(批号：1505073)，菝葜颗粒(批号：1511089)，茯苓颗粒(批号：1605044)，川贝母粉(批号：1512074)，升麻颗粒(批号：1511156)。厂家：江阴天江药业有限公司。

细胞：人食管癌细胞eca-109，购于中国科学研究院上海细胞库，在含有10％胎牛血清的α-mem培养基中将细胞至于37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞融合度达80％～90％时，用0.25％胰酶消化传代培养。

动物：sd大鼠，180-200g北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：scxk(苏)2016-0003。

实验材料：96孔细胞培养板，24孔细胞培养板购自costar公司；rpmi1640培养基购自gibco公司；胎牛血清购自gibco公司；dmso购自sigma公司；cck8细胞活力检测试剂盒由南京恩晶生物科技有限公司提供；transwell小室，poresize8.0μm，ref3422，lot:14416045；bdmatrigelmatrix(basementmembrane)，bdbiosciences，356234；组织裂解液，bsa，显影液、定影液，均购自南京恩晶生物科技有限公司。

仪器：二氧化碳培养箱，日本三洋sanyo，型号：mco-15ac；荧光倒置生物显微镜，南京江南永新光学有限公司，型号：xd-202；台式高速离心机，scilogex，型号：d2012；流式细胞仪，美国bd公司，型号：accuritmc6；酶标仪，thermoscientific，型号，mutiskanmk3；低温离心机，scilogex，型号：d3024r。

统计学方法：数据以mean±sd表示，应用graphpadprism5.0统计软件，两组组间比较采用t-test检验，多组间比较采用one-wayanova(dunnett)，p<0.05为有统计学意义。

实施例1含药血清的制备

人用量为76g生药/天，剂量为1.267g/kg，换算为大鼠剂量为7.98g/kg(临床等效量)，将此剂量设置为中剂量，高剂量为15.96g/kg，低剂量为3.99g/kg。

按照配方比例(北沙参颗粒10g、姜半夏颗粒10g、丹参颗粒15g、急性子颗粒10g、菝葜颗粒15g、茯苓颗粒10g、川贝母粉3g、升麻颗粒6g)将各组分原料混合，并用蒸馏水充分溶解。各组大鼠灌胃给予不同剂量药物，空白组灌胃给予等体积蒸馏水，给药体积为0.8ml/100g。连续给药10天，末次给药前12h，各组大鼠禁食不禁水，末次给药1h后，大鼠经戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，室温静置2h后离心(3000rpm，15min)，收集血清。血清经过滤除菌后分装并与-20℃保存，备用。

实施例2细胞增殖抑制实验

取对数生长期eca-109细胞进行实验。细胞经消化、计数、制成1×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中(100μl/孔)，置于37℃，5％co2培养箱中培养24小时；每孔加入含相应浓度含药血清(实施例1制备所得)的培养基(含药血清含量分别为20％、10％、5％、2.5％、1.25％)，同时设立空白对照组及正常组，每组3复孔；将板置于培养箱中分别培养12h、24h、48h、72h后，显微镜下观察各组细胞形态，每孔加入10μlcck8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2小时，450nm下测定吸光值，并计算增殖抑制率。实验数据见表1。

表1：实施例1的含药血清对eca-109细胞体外增殖活性的影响

*p＜0.05vs空白对照组

实验结果见图1，结合表1以及图1显示，各剂量组浓度为5％以上的含药血清对eca-109细胞的增殖有抑制作用，特别是浓度为10％以上的含药血清对eca-109细胞的增殖有明显抑制作用，并且该作用随时间延长而增强。

实施例3pi染色法流式检测细胞周期实验

细胞以1×10⁵个/ml密度接种于96孔板中，每孔100μl，置于37℃，5％co2培养箱中培养24小时。每孔加入20％各剂量组含药血清(实施例1制备所得)，同时设立空白对照组及正常组；将板置于培养箱中培养48h后收集细胞。用pbs洗涤一次，吸尽上清后。加入0.2mlpbs重新悬浮细胞，把制备好的单细胞悬液全部缓慢转移至0.8ml-20℃无水乙醇中，充分吹匀后放置-20℃冰箱中过夜。离心(2000rpm，5min)，吸尽上清后，加入1.0mlpbs重新悬浮细胞，室温放置15min。离心(2000rpm，5min)，吸尽上清后，加100μlrnasea37℃水浴30min；再加入400μlpi(50μmg/ml)染色混匀，4℃避光30min；流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处红色荧光，分析细胞周期变化。

实验结果见图2，实验表明，作用48h后，低、中剂量组细胞g1期比例均明显高于对照组(p<0.05)，高剂量组与对照组细胞g1期比例无明显差异；低、中剂量组细胞g2+s期比例均低于对照组(p<0.05)，表明含药血清可能通过调控周期而影响细胞的增殖和凋亡。高剂量组细胞g2+s期比例略高于对照组，但结果没有统计学差异(p>0.05)，没有像对细胞凋亡影响那样表现出随剂量增加而增加的效应，考虑原因可能为中药复方含药血清不同浓度对食管癌细胞的复杂影响和复方中不同组分在体内代谢时间差异有关，具体原因有待进一步研究。

实施例4annexinv-egfp荧光染色法流式检测细胞凋亡实验

细胞以1×10⁵个/ml密度接种于96孔板中，每孔加入20％各剂量组含药血清(实施例1制备所得)，同时设立空白对照组及正常组；将板置于培养箱中培养48h后收集细胞(包括培养基中悬浮的凋亡细胞)，离心(2000rpm，5min)，收集细胞沉淀，并用pbs洗涤一次。加入500μl结合液重悬细胞，加入5μlannexinv-egfp，5μlpi，同时设立全阴管及单阳管，充分混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-30分钟后，流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

实验结果见图3，实验表明，在对细胞凋亡的影响方面，食管癌eca-109细胞的总凋亡率与剂量正相关，随剂量的增加而增加。

实施例5细胞粘附能力检测

实验前取出matrigelmatrix胶与4℃下融化，并将枪头及离心管放置于冰箱中预冷。用预冷枪头吸取matrigelmatrix胶于预冷离心管中，并用预冷1640稀释50倍，充分吹匀，将96孔板置于冰盒上，各孔加30μlmatrigel胶稀释液，注意使胶平铺于整个孔底，避免气泡产生。铺胶完成后将96孔板放置37℃30min后转4℃保存。种板及加药：取出包被好的96孔板，吸出孔中多余液体，超净台中晾干。取对数生长期eca-109细胞进行实验。细胞经消化、计数、制成2×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中(80μl/孔)，加入20μl不同浓度的含药血清(实施例1制备所得)及空白血清，使血清终浓度分别为20％、10％及5％，同时设立正常对照组，各组5复孔，将板置于培养箱中培养，分别于30min、60min、90min及120min与显微镜下观察细胞形态及贴壁状态，拍摄照片并加入cck8试剂(10μl/孔)，于37℃孵育4h，450nm下检测各孔吸光度并统计分析。细胞粘附抑制率＝(1-加药值/空白值)×100％。

实验结果见图4，实验结果显示，不同浓度含药血清在各时间点能不同程度降低细胞粘附能力，其中含药血清浓度为20％、10％、5％在培养90min时显著降低细胞粘附能力，与对照组有显著性差异(p＜0.01)。

实施例6细胞侵袭能力检测实验

铺胶：低温下操作，吸取matrigel胶，用无血清1640培养基将matrigel胶进行8倍稀释，充分吹匀后，每个小室铺胶50μl，共制作7个小室，置37℃培养箱内30分钟使胶凝固。种板及加药：用无血清1640培养基调整细胞密度为5×105/ml，吸取160μl细胞悬液加入到侵袭小室内，同时加入40μl不同浓度含药血清(实施例1制备所得)，使血清终浓度为5％、10％、20％，同时设置相应浓度空白血清组及正常对照组，下室加入含10％fbs的1640500μl，注意避免上室底部与下室培养基之间产生气泡，培养箱中培养24h，弃去小室内培养液，用pbs洗2遍。用湿棉签擦尽上室面的matrigel和细胞，甲醇固定20min，待完全挥干后，用0.1％结晶紫染色15-20min，用清水洗3遍。显微镜下观察并拍照，每个小室随机选取5-6个视野。计数：针对每个视野中细胞进行计数，并计算平均值。细胞侵袭抑制率＝(1-中药组侵袭细胞数/空白组侵袭细胞数)×100％。

transwell小室是当前测定肿瘤细胞体外侵袭能力较为理想的实验模型，实验中我们采用transwell小室侵袭模型体外观察含药血清对eca-109细胞侵袭、转移的影响。实验结果见图5，实验显示，不同浓度含药血清能不同程度降低细胞侵袭能力，尤其以20％含药血清效果最显著，能够明显抑制食管癌eca-109细胞侵袭转移。

实施例7

本实施例含药血清的制备同实施例1，不同之处在于，配方比例为：北沙参颗粒5g、姜半夏颗粒8g、丹参颗粒10g、急性子颗粒5g、菝葜颗粒10g、茯苓颗粒5g、川贝母粉2g、升麻颗粒3g。

将上述含药血清进行细胞增殖抑制实验(同实施例2)，结果表明各剂量组浓度为5％以上的含药血清开始对eca-109细胞的增殖有抑制作用；在含药血清浓度为10％以上时，抑制作用明显增强；在含药血清浓度为20％时，抑制作用最佳；并且该作用随时间延长而增强。

实施例8

本实施例含药血清的制备同实施例1，不同之处在于，配方比例为：北沙参颗粒15g、姜半夏颗粒12g、丹参颗粒20g、急性子颗粒15g、菝葜颗粒20g、茯苓颗粒15g、川贝母粉5g、升麻颗粒10g。

将上述含药血清进行细胞增殖抑制实验(同实施例2)，结果表明各剂量组浓度为5％以上的含药血清开始对eca-109细胞的增殖有抑制作用；在含药血清浓度为10％以上时，抑制作用明显增强；在含药血清浓度为20％时，抑制作用最佳；并且该作用随时间延长而增强。

实施例9

本实施例含药血清的制备同实施例1，不同之处在于，配方比例为：北沙参颗粒12g、姜半夏颗粒11g、丹参颗粒12g、急性子颗粒12g、菝葜颗粒12g、茯苓颗粒8g、川贝母粉4g、升麻颗粒8g。

将上述含药血清进行细胞增殖抑制实验(同实施例2)，结果表明各剂量组浓度为5％以上的含药血清开始对eca-109细胞的增殖有抑制作用；在含药血清浓度为10％以上时，抑制作用明显增强；在含药血清浓度为20％时，抑制作用最佳；并且该作用随时间延长而增强。