氯化二亚苯基碘鎓在制备治疗细菌感染药物中的用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，特别涉及氯化二亚苯基碘鎓用于制备细菌感染治疗药物的用途。

背景技术：

感染性疾病是指病原微生物入侵机体并在局部或全身大量繁殖所引发的器质性或功能性损害，是导致临床患者死亡的主要因素之一。细菌是最为常见的病原微生物，细菌进入机体中，一方面通过侵袭定植或释放毒素等形式直接造成组织脏器损伤，另一方面细菌的菌体成分还可刺激机体炎症细胞活化，诱导tnf-α、il-1、il-6和hmgb-1等炎症介质的大量释放，进而引发失控性炎症反应并导致机体多器官、多系统的损伤和功能紊乱。最终导致患者死亡。

抵御细菌感染主要依赖于外源性的抗菌药物和机体自身的免疫防御功能。抗生素的应用和更新发展曾一度使得细菌性疾病得到有效的控制，但由于细菌耐药性的增加以及多重耐药细菌的不断出现，以抗生素为代表的抗菌药物的研发和应用已陷入困境。在此情况下，从提高机体自身免疫防御的角度出发，积极寻找新型抗菌药物，对于拓宽细菌感染、特别是耐药菌感染的解决措施就具有重要的意义。

机体的天然免疫系统是应对病原体入侵的第一道免疫防线。天然免疫细胞的吞噬效应对其发挥抗菌防御功能至关重要。巨噬细胞因广泛分布于皮肤以及各组织脏器中，因而在天然免疫细胞中最先感知和抵御病原体入侵。研究表明，巨噬细胞通过直接吞噬作用，经内体-溶酶体途径介导对病原体的降解清除。吞噬作用也可与细胞自噬作用结合，加快巨噬细胞内体的酸化成熟及其与溶酶体的结合，提高对酵母真菌等的处理能力。另一方面，巨噬细胞吞噬病原体后，也可经抗原提呈作用活化特异性免疫反应，进一步加强对病原体的清除作用。基于上述认识，巨噬细胞的吞噬能力对于机体抗菌免疫防御非常重要，基于调节细胞吞噬能力的策略有望为寻找感染性疾病的新型药物靶点提供新思路。

氯化二亚苯基碘鎓（diphenyleneiodoniumchloride,dpi）属于联苯碘类化合物，最早发现其具有抑制糖异生的效应，可导致血糖降低。后续研究发现，该化合物的药理作用主要与其抑制nadph氧化酶的活性，进而抑制呼吸链有关。研究表明，氯化二亚苯基碘鎓可能通过与nadph氧化酶的黄素基团发生相互作用而抑制相应电子转运体，从而抑制电子传递和ros产生，上述作用机制也是目前该化合物的公认药理机制。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种氯化二亚苯基碘鎓在制备治疗细菌感染药物中的用途，该药物可上调天然免疫细胞对细菌的吞噬活性，抑制细菌感染所致的炎症反应，增强机体对细菌的抵抗能力。其特点是通过增加机体天然免疫细胞的吞噬能力实现对细菌的吞噬和杀伤，是一种在预防及治疗细菌感染性疾病的新型的抗菌药物。

本发明的技术方案是：

氯化二亚苯基碘鎓在制备治疗细菌感染药物中的用途。

所述的细菌为革兰阳性细菌或革兰阴性细菌。

所述药物用于增加机体天然免疫细胞的吞噬能力。

所述天然免疫细胞为单核巨噬细胞或中性粒细胞。

所述氯化二亚苯基碘鎓为碘鎓盐类化合物，其分子量为314.55，化学结构式为c12h8cli。分子结构如下：

所述药物按照每公斤体重0.1-1mg给药，每天1次，给药方式为静脉注射。

申请人对氯化二亚苯基碘鎓的促吞噬和抗菌、抗炎活性进行了研究，发现氯化二亚苯基碘鎓可增强巨噬细胞对革兰氏阴性和阳性细菌的吞噬作用，抑制细菌感染所致的炎症反应损伤，提高细菌感染小鼠模型的存活率。因此，该化合物可通过增强机体自身细胞的吞噬能力从而实现抗感染作用，并为其可能作为抗感染药物应用到临床奠定基础。

申请人对氯化二亚苯基碘鎓的体外促吞噬作用进行了药理学研究，实验表明，其可促进小鼠巨噬细胞吞噬革兰阳性菌和革兰阴性菌，且该作用与其促进钙离子内流、上调肌动蛋白的活性有关；同时，氯化二亚苯基碘鎓可在体内外抑制细菌感染导致的炎症反应，降低小鼠组织细菌计数，提高存活率。申请人经研究发现，氯化二亚苯基碘鎓介导巨噬细胞的吞噬和杀菌活性与其对nadph氧化酶和ros的抑制效应无关，因此是一种新颖的药理作用。

本发明所述药物并非直接针对细菌，而是通过诱导或增强机体的自噬效应而实现，故对细菌的杀伤效应具有广谱性的特点，特别是对耐药细菌也具有良好的杀菌活性，可用于预防、治疗细菌感染性疾病相关药物的开发。

附图说明

图1为氯化二亚苯基碘鎓对小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌效应的影响，图中，ec：大肠埃希菌；sa：金黄色葡萄球菌；dpi：氯化二亚苯基碘鎓，**：p<0.01；

图2为氯化二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌作用的时效和量效关系测定,图中，ec：大肠埃希菌；dpi：氯化二亚苯基碘鎓；其中图2a表示不同浓度的氯化二亚苯基碘鎓对小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响。图2b表示氯化二亚苯基碘鎓作用不同时间后对小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响；

图3为氯化二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌作用的特异性检测，图中，ec：大肠埃希菌；dpi：氯化二亚苯基碘鎓，**：p<0.01。其中图3a表示细胞色素d对氯化二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响，3b表示温度对氯化二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响；

图4为三种nadph氧化酶抑制剂对大肠埃希菌诱导巨噬细胞胞内活性氧产生以及对小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响，图中，nc：阴性对照；ec：大肠埃希菌；dpi：氯化二亚苯基碘鎓；va：vas2870；eb：ebselen，**：p<0.01。其中图4a表示三种nadph氧化酶抑制剂氯化二亚苯基碘鎓，vas2870和ebselen对大肠埃希菌诱导巨噬细胞胞内活性氧产生的影响，4b表示氯化二亚苯基碘鎓，vas2870和ebselen对巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响。

图5为氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌刺激小鼠巨噬细胞释放炎症介质的抑制活性检测，图中，nc：阴性对照，ec：大肠埃希菌；dpi：氯化二亚苯基碘鎓，**：p<0.01。其中图5a表示氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌诱导的小鼠巨噬细胞tnf-a，il-6mrna表达的影响，5b表示氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌诱导的小鼠巨噬细胞随时间变化释放tnf-a，il-6的影响；

图6为氯化二亚苯基碘鎓介导钙离子内流和肌动蛋白聚集，进而上调巨噬细胞吞噬活性的作用检测。图中，m：未处理对照组，ec：大肠埃希菌，dpi：氯化二亚苯基碘鎓，egta和bapta：钙离子螯合剂，**：p<0.01。其中图6a表示氯化二亚苯基碘鎓对巨噬细胞胞浆钙离子水平的影响，图6b表示钙离子螯合剂对氯化二亚苯基碘鎓介导的巨噬细胞吞噬能力的影响，图6c表示氯化二亚苯基碘鎓对肌动蛋白聚合能力的影响。

图7为氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌感染小鼠组织菌计数、炎症介质水平和生存率的影响，图中，ns：生理盐水；ec：大肠埃希菌；dpi：氯化二亚苯基碘鎓，*：p<0.05，**：p<0.01。其中图7a表示氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌感染小鼠存活率的影响，7b表示氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌感染小鼠后肺组织（左）以及腹腔液和腹腔巨噬细胞胞内细菌加载量（右）的影响，图7c和7d表示氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌感染小鼠后肺、脾、肝组织以及血清中tnf-α和il-6产生的影响。

具体实施方式

本发明所述试剂和仪器如下：

试剂：氯化二亚苯基碘鎓、vas2870、ebselen、皂苷、egta、bapta、dcfh-da购于sigm-aldrich公司；

细胞色素d购于selleck公司；

f-actin染色试剂盒购于abcam公司；

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌购于美国标准生物制品收藏中心（atcc）；

细胞培养基dmem购于lifetechnologies公司；

用于配制lb液体培养基的酵母提取物和胰蛋白胨购于oxoid公司；

氯化钠购于成都科隆化学品有限公司；

dmso购于biosharp公司；

抗生素头孢美唑钠购于重庆药友制药有限公司；

tnf-α和il-6检测试剂盒购于ebioscience公司；

rna提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；

反转录试剂盒和rt-pcr试剂盒购于toyobo公司；

tnf-α和il-6引物由上海生工生物工程有限公司合成。

仪器：多功能读数仪器（thermovarioskanflash），酶标仪（伯乐smartspecplus），细菌菌落计数仪（迅数菌落计数仪），实时荧光定量pcr仪（伯乐cfx96real-timesystem），二氧化碳培养箱（thermo3111型），恒温孵箱（上海精宏实验设备有限公司dnp-9162型），超净工作台（苏净vs-1300l-u型）。

实施例1：氯化二亚苯基碘鎓对小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌效应的影响

1.1实验方法：将体外培养的小鼠巨噬细胞接种至24孔无菌细胞培养板中，细胞密度为5×10⁵/ml，1ml/孔。挑取种植于营养琼脂平板上的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌株的单个菌落，转入lb培养基中增菌至对数生长期（od600约为0.5-0.8），调整菌液浓度为5×10⁷cfu/ml，取10μl加入预先接种小鼠巨噬细胞的24孔板中，同时加入氯化二亚苯基碘鎓10μm，以加入同等体积dmso作为对照组，37℃，5%co2培养1h，加入抗生素杀灭胞外细菌后移除培养上清，细胞用200μl0.3%皂苷裂解，裂解液稀释10倍后取100μl涂布营养琼脂板上，37℃孵育12h，菌落计数仪计数细菌菌落数。吞噬指数=胞内细菌数/加样总细菌数。

1.2实验结果：由图1结果可知，氯化二亚苯基碘鎓处理细胞后其吞噬指数显著增加，表明氯化二亚苯基碘鎓可有效促进小鼠巨噬细胞对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的吞噬作用。

实施例2：氯化二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌作用的时效和量效关系测定

2.1实验方法：采用不同浓度（0.625，1.25，2.5，5，10μm）的氯化二亚苯基碘鎓处理小鼠巨噬细胞，或采用同一浓度（10μm）氯化二亚苯基碘鎓分别作用不同时间（0.5，1，1.5，2，2.5h）后，检测氯化二亚苯基碘鎓对细胞吞噬大肠埃希菌的吞噬指数，具体操作方法同1.1。

2.2实验结果：由图2a结果可知，随着氯化二亚苯基碘鎓浓度的增加，其吞噬指数不断升高。同时由图2b结果可知，随着氯化二亚苯基碘鎓作用时间的延长，其吞噬指数也不断升高。以上结果表明氯化二亚苯基碘鎓成剂量依赖性和时间依赖性方式促进细胞对细菌的吞噬。

实施例3：氯化二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌作用的特异性检测

3.1实验方法：巨噬细胞的接种和细菌培养方法同1.1，加入氯化二亚苯基碘鎓（10μm）或同时加入细胞色素d（2.5μm）处理，按照1.1方法检测细胞对细菌的吞噬指数。同时将细胞分别置于4℃或37℃环境下，加入氯化二亚苯基碘鎓处理后，检测细胞对细菌的吞噬指数。

3.2实验结果：由图3a结果可知，细胞色素d是公认的细胞吞噬抑制剂，氯化二亚苯基碘鎓处理细胞后可显著增加细胞对细菌的摄取能力，同时加入细胞色素d处理后相对于单独氯化二亚苯基碘鎓组其细胞对细菌的摄取能力显著降低，表明氯化二亚苯基碘鎓促进细胞对细菌的摄取能力是通过促进其吞噬能力实现的。由图3b结果可知，低温可降低细胞的吞噬能力，正常未处理细胞置于4℃时比37℃时的吞噬能力显著降低，加入氯化二亚苯基碘鎓处理后置于4℃时同样比37℃时的细胞摄取细菌的能力显著降低。以上结果表明氯化二亚苯基碘鎓可通过促进巨噬细胞吞噬能力增强对细菌的摄取和清除。

实施例4：三种nadph氧化酶抑制剂对大肠埃希菌诱导巨噬细胞胞内活性氧产生以及对小鼠巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的影响

4.1实验方法：将体外培养的小鼠巨噬细胞接种至24孔无菌细胞培养板中，细胞密度为5×10⁵/ml，1ml/孔。按照1.1方法加入大肠埃希菌，同时分别加入二亚苯基碘鎓、vas2870和ebselen三种nadph氧化酶抑制剂各10μm作用小鼠巨噬细胞，以加入同等体积dmso作为对照组，37℃，5%co2培养1h，加入活性氧荧光探针dcfh-da，37℃，5%co2继续孵育20min，更换培养基，激光共聚焦显微镜检测胞内活性氧探针荧光强度。同时检测二亚苯基碘鎓，vas2870和ebselen对细胞吞噬大肠埃希菌的吞噬指数，具体操作方法同1.1。

4.2实验结果：由图4a结果可知，大肠埃希菌可诱导小鼠巨噬细胞胞内活性氧水平升高，加入三种nadph氧化酶抑制剂后其活性氧水平均显著降低，表明二亚苯基碘鎓，vas2870和ebselen可有效抑制大肠埃希菌诱导小鼠巨噬细胞活性氧的产生。由图4b结果可知，二亚苯基碘鎓可显著增强小鼠巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬作用，另两种nadph氧化酶抑制剂vas2870和ebselen对小鼠巨噬细胞吞噬细菌无促进作用。以上结果表明，二亚苯基碘鎓促进小鼠巨噬细胞的吞噬作用与其对nadph氧化酶的抑制无关。

实施例5：氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌刺激小鼠巨噬细胞释放炎症介质的抑制活性检测

5.1实验方法：将体外培养的小鼠巨噬细胞接种至96孔无菌细胞培养板中，细胞密度为5×10⁵/ml，200μl/孔。大肠埃希菌按照1.1方法培养后，调整菌液浓度为5×10⁷cfu/ml加样。取氯化二亚苯基碘鎓（10μm）和细菌（5×10⁵cfu/ml）加入预先接种的细胞，37℃，5%co2孵育2-10h，分别取上清稀释后检测tnf-α和il-6。取培养4h细胞提取rna，反转录后进行rt-pcr，检测tnf-α和il-6mrna水平的表达情况。

5.2实验结果：由图5a结果可知，大肠埃希菌感染后，小鼠巨噬细胞tnf-α和il-6mrna表达显著上调，而加入氯化二亚苯基碘鎓处理可显著降低tnf-α和il-6mrna水平。同时由图5b结果可知，对上清tnf-α和il-6的检测发现，大肠埃希菌加入后2-10h可观察到tnf-α和il-6持续释放，而氯化二亚苯基碘鎓处理组以时间依赖的方式明显抑制tnf-α和il-6的释放。

实施例6：氯化二亚苯基碘鎓对小鼠巨噬细胞胞浆钙离子水平和肌动蛋白聚合的影响

6.1实验方法：将体外培养的小鼠巨噬细胞接种至共聚焦培养皿或24孔孔无菌细胞培养板中，细胞密度为5×10⁵/ml。大肠埃希菌按照1.1方法培养后，调整菌液浓度为5×cfu/ml，取氯化二亚苯基碘鎓（10μm）和大肠埃希菌（5×10⁵cfu/ml）加入预先接种在共聚焦培养皿中的细胞，37℃，5%co2孵育30min，共聚焦培养皿中加入钙离子探针fluo4-am，37℃，5%co2孵育20min，pbs洗涤后激光共聚焦显微镜检测胞内钙离子情况。同时将共聚焦培养皿的细胞用多聚甲醛固定后，使用鬼笔环肽对肌动蛋白f-actin染色，用dapi对细胞核染色后进行激光共聚焦检测，观察f-actin聚合情况。24孔板加入大肠埃希菌（5×10⁵cfu/ml）和氯化二亚苯基碘鎓（10μm）或同时加入钙离子螯合剂egta(5mm)或bapta(10μm)，按照1.1方法进行吞噬指数检测。

6.2实验结果：由图6a结果可知，大肠埃希菌可诱导胞内钙离子较少的增加，加入二亚苯基碘鎓处理后，其胞内钙离子进一步增加。由图6b对吞噬指数检测结果显示，氯化二亚苯基碘鎓可显著增强细胞的吞噬作用，然而同时加入钙离子螯合剂egta或bapta其吞噬作用受到显著抑制。由图6c中f-actin的荧光染色结果显示，不加试剂对照组没有观察到f-actin的明显聚集，然而二亚苯基碘鎓处理组可显著促进f-actin在膜上的聚集。以上结果显示，二亚苯基碘鎓可通过促进胞内钙离子增加诱导f-actin聚合，从而促进巨噬细胞对细菌的吞噬作用。

实施例7：氯化二亚苯基碘鎓对大肠埃希菌感染小鼠组织菌计数、炎症介质水平和生存率的影响

7.1实验方法：6-8周的野生型balb/c小鼠腹腔注射生理盐水或大肠埃希菌（1×10⁸cfu/kg)，同时注射氯化二亚苯基碘鎓(1mm/kg)或等体积生理盐水，观察72h的存活率（n=10）。注射6h后将小鼠麻醉，用生理盐水对腹腔进行灌洗，收集灌洗液，1000rpm离心，取上清涂布营养琼脂板上进行细菌培养，上清加入抗生素杀灭胞外细菌后，去除上清，细胞沉淀用0.3%saponin裂解，取裂解液涂布琼脂板上进行细菌培养。同时解剖获取肝，脾，肺和血液，脏器加入500μl生理盐水匀浆后离心，检测上清细胞因子和将上清涂板进行细菌培养检测。血液离心后取血清检测细胞因子。

7.2实验结果：由图7a结果可知，腹腔注射大肠埃希菌后，模型组小鼠72h存活率为40%，氯化二亚苯基碘鎓处理组72h存活率为80%，表明氯化二亚苯基碘鎓可提高大肠埃希菌感染小鼠的存活率。由图7b结果可知，对组织细菌加载量的检测发现，大肠埃希菌感染6h后肺组织细菌显著增加，而氯化二亚苯基碘鎓处理组肺组织匀浆中细菌加载量显著减少。同时对腹腔灌洗液上清及腹腔巨噬细胞胞内的细菌量检测发现，氯化二亚苯基碘鎓处理的小鼠其上清中的细菌量显著减少，而胞内的细菌量显著增加，表明氯化二亚苯基碘鎓可通过促进腹腔巨噬细胞对细菌的吞噬作用而增强对细菌的清除能力。由图7c和7d所示，注射大肠埃希菌显著增加了肺，脾，肝匀浆和血液上清中的tnf-α和il-6水平，然而氯化二亚苯基碘鎓可显著抑制各脏器tnf-α和il-6水平。以上实验结果表明，氯化二亚苯基碘鎓可在体内诱导细胞对细菌的吞噬，从而增强了对细菌的清除，改善炎症反应进而提高大肠埃希菌感染小鼠的存活率。