在使用包含蒽环类化疗剂的ERBB2靶向免疫脂质体的治疗中防止心肌毒性的剂量和给药的制作方法

本申请是2013年7月25日提交到中华人民共和国国家知识产权局的发明名称为“在使用包含蒽环类化疗剂的erbb2靶向免疫脂质体的治疗中防止心肌毒性的剂量和给药”、申请号为“201180066002.5”的发明专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2010年12月6日提交的美国临时专利申请第61/420,225号；于2010年12月7日提交的美国临时专利申请第61/420,688号；以及于2011年3月4日提交的美国临时专利申请第61/449,602号的权益和优先权。各个前述申请的内容通过引用的方式全部并入本文。对联邦资助的研究和开发中做出的发明的权利的声明不适用参考以光盘提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录不适用
背景技术：
：数十年来，蒽环类是癌症治疗的有效主力。尽管在乳腺癌的蒽环类方案中观察到一贯的临床益处，与这种治疗相关的显著毒性例如急性和/或慢性心功能障碍限制了更广泛的治疗用途。而脂质体阿霉素制剂已成功地在一定程度上减小了心肌毒性，但它们未能表现出明确的效力优势，并且可能涉及其它毒性，例如掌足红肿疼痛(手足综合征)。在致力于改善当前可得的蒽环类的效力时，已制备出一种新的免疫脂质体制剂mm-302，其将阿霉素靶向her2(erbb2)过表达的肿瘤细胞。与her2结合而不阻断her2介导的信号转导的抗体片段，与聚乙二醇化的脂质体阿霉素的外表面结合。阿霉素(dox)是用于治疗多种癌症的蒽环类化疗剂。阿霉素使用的剂量受到药物的心肌毒性的限制。为解决该问题，将阿霉素制备为聚乙二醇化的脂质体制剂。药物的脂质体包囊可以递送强效的细胞毒性药物并使其具有改善的治疗指数或治疗窗。盐酸阿霉素脂质体注射剂是阿霉素的聚乙二醇化脂质体包囊(脂质体)形式。doxil是聚乙二醇化的脂质体阿霉素(pld)的商用形式。doxil改变阿霉素的组织分布和药代动力学特性。在未使用过蒽环类并在之前有过治疗的患者中，当doxil单独使用或与曲妥珠单抗组合使用时，与使用游离阿霉素的疗法相比，会引起显著更低比率的左心室心功能障碍和症状性充血性心力衰竭。被批准用于治疗卡波氏肉瘤、卵巢癌和多发性骨髓瘤。盐酸阿霉素脂质体注射剂也以出售。免疫脂质体是抗体(通常为抗体片段)靶向的脂质体，其提供优于非免疫脂质体制剂的优点，因为荷载有被抗体靶向的细胞表面抗原的细胞会选择性地使它们内化。这种抗体和免疫脂质体在例如以下的美国专利和专利申请中有过记载：us2010-0068255、6,214,388、7,135,177和7,507,407(“immunoliposomesthatoptimizeinternalizationintotargetcells”)；6,210,707(“methodsofformingprotein-linkedlipidicmicroparticlesandcompositionsthereof”)；7,022,336(“methodsforattachingproteintolipidicmicroparticleswithhighefficiency”)以及us2008-0108135和7,244,826(“internalizingerbb2antibodies.”)。以下美国和国际专利以及专利申请描述了与本公开相关的检定、细胞系和相关技术：us7,846,440(“antibodiesagainsterbb3andusesthereof”)和us12/757,801、pct/us2009/040259、以及pct/us2009/60721(“humanserumalbuminlinkersandconjugatesthereof”)。可以根据前述专利公开来制备靶向erbb2(her2)的免疫脂质体。这种her2靶向免疫脂质体包括mm-302，其包含f5抗her2抗体片段且含有阿霉素。相对于每一脂质体，mm-302含有45个拷贝的哺乳动物来源的f5-scfv(抗her2)。选择f5-scfv，是因为其具有内化相关的能力而不影响her2信号转导。f5-scfv的特性表明，其不与小鼠、大鼠和兔的her2交叉反应，并且处于游离scfv形式时不干扰her2信号转导。因为已知心肌细胞表达her2，对于mm-302和相关的her2靶向免疫脂质体的潜在心肌毒性表达出担忧。市售的脂质体阿霉素的剂量和给药：(盐酸阿霉素脂质体注射剂)是示例性的脂质体蒽环类化疗药物。doxil通常以mg/m2表示的且表征为盐酸阿霉素当量(阿霉素当量(doxequiv.)，意指各剂量中的阿霉素的总质量)的剂量静脉给药。各次给药通常以周为单位的间隔进行施用，以达到每y周xmg/m2(阿霉素当量)的剂量。通常以1mg/min的初始速度进行第一次脂质体阿霉素给药，以使输注相关的反应的风险降至最低。如果没有观察到输注相关的不利反应，通常提高输注速度，以在一个小时内完成给药。患有卵巢癌的患者：通常以50mg/m2阿霉素当量的剂量向卵巢癌患者静脉施用doxil。通常每4周向患者给药一次，只要患者病情不再进展、不显示心肌毒性的证据并继续耐受治疗。建议最少4个疗程，因为临床实验中反应的中值时间为4个月。为管理不利反应，例如手足综合征(hfs)、口腔炎、或血液毒性，可以延迟或减少给药。应该考虑止吐药的预处理或伴随使用。患有aids相关卡波氏肉瘤(ks)的患者：通常以20mg/m2(阿霉素当量)的剂量向ks患者静脉施用doxil。在ks患者中，通常每三周重复一次给药，只要患者的反应令人满意并耐受治疗。患有多发性骨髓瘤的患者：为治疗患有多发性骨髓瘤的患者，doxil与(硼替佐米)一起施用。每三周，在第1、4、8和11天，以1.3mg/m2的剂量经静脉团注来施用硼替佐米。在各个第4天的硼替佐米给药之后，通常以30mg/m2的剂量，经1h静脉输注，向这些患者施用doxil。通常对患者治疗高达8个周期，直到疾病出现进展或出现不能接受的毒性。(曲妥珠单抗)是非常广泛地用于治疗her2过表达肿瘤的治疗性抗her2抗体。曲妥珠单抗的关键的剂量限制作用是心肌毒性。已知心肌细胞表达her2，且通常认为曲妥珠单抗介导的心肌毒性是由对表达her2的心肌细胞的损伤引起的，该损伤源自曲妥珠单抗与心肌细胞所表达her2的结合，参见例如hysingjandwiste,“cardiotoxiceffectsoftrastuzumab,”,tidsskrnorlaegeforen,2011nov15；131(22):2239-2241。已知蒽环类药物例如阿霉素发挥剂量限制性的心肌毒性作用，这被视为对其使用的主要限制，参见例如sawyer等人,“mechanismsofanthracyclinecardiacinjury:canweidentifystrategiesforcardio-protection？”progcardiovascdis.,2010sep-oct；53(2):105-13。阿霉素引发的心脏损伤是不可逆的，导致急性损伤以及在治疗数年后仍显露出的损伤。暴露至高于550mg/m2的阿霉素累积浓度会增加心肌病和心力衰竭的可能性。用于治疗her2阳性乳腺癌的针对her2的治疗的发展已引发对阿霉素与曲妥珠单抗组合的临床益处的调查。阿霉素加曲妥珠单抗的临床效力优于紫杉醇加曲妥珠单抗的效力；然而，在所研究的阿霉素加上曲妥珠单抗的臂中观察到心肌毒性的增加的影响范围，该组合没有被批准上市。基于蒽环类的疗法的临床益处，特别在her2阳性乳腺癌中，还存在争议。药物的脂质体包囊可以对强效的细胞毒性药物进行递送，并使其具有改善的治疗指数。聚乙二醇化的脂质体阿霉素(pld)改变阿霉素的组织分布和药物动力学特性。在未使用过蒽环类并在之前有过治疗的患者中，与使用常规阿霉素的治疗相比，pld单独给药或与曲妥珠单抗组合给药已显示出显著更低比率的左心室心功能障碍和症状性充血性心力衰竭。提出的关于pld的降低的心肌毒性的机制是，其相比于常规阿霉素的更大尺寸防止其穿越心脏中的内皮屏障，从而使阿霉素对心脏组织的暴露降至最低。mm-302是靶向her2的聚乙二醇化脂质体，其设计成将阿霉素直接递送到her2过表达癌症。her2靶向的pld经由与pld相似的增强透过和滞留的效应而沉积在肿瘤中。在肿瘤微环境中，使用her2靶向pld来靶向her2过表达细胞在临床前模型中引起相对于pld更优的效力。在mm-302的开发过程中，管理机构表达出忧虑，即因其对her2的靶向，mm-302可能将有心肌毒性的阿霉素直接递送到心肌细胞，与盐酸阿霉素脂质体注射剂相比，引起增加的心肌毒性，并且建议减小mm-302的剂量以避免这样的威胁生命的毒性。技术实现要素：本发明提供用于确定安全剂量和安全地使用抗her2免疫脂质体蒽环类来治疗her2表达癌症的方法，例如，与盐酸阿霉素脂质体注射剂(doxil)相比，没有增加的心肌毒性风险，并且本发明还提供其它优点。现在已发现，包含erbb2靶向抗体和蒽环类的免疫脂质体，例如mm-302，不再比盐酸阿霉素脂质体注射剂具有更大的心肌毒性，并且可以使用与盐酸阿霉素脂质体注射剂完全相同的剂量(即剂量和给药量和日程安排)进行给药，而不会增加心肌毒性风险或降低其效力。而且，现在已证实，mm-302可以在体外和体内有效地靶向每一细胞表达200,000或更多个erbb2(her2)受体的细胞，表明其可以用于治疗患有her2过表达肿瘤的患者，不管是her2“3+”(例如通过)、her2fish+(用于her2基因放大的荧光原位杂交)或her2“2+”(例如通过herceptest)。因此，本文公开的是用于确定安全且有效的剂量的方法，以通过施用包含蒽环类的抗her2免疫脂质体用于治疗人癌症患者，其中患者诊断为由her2受体的表达所表征的癌症，方法包括：针对诊断为由her2受体的表达所表征的癌症的患者确定第一剂量，这样的剂量表示剂量大小和给药频率，第一剂量用于不包含免疫脂质体的脂质体蒽环类化疗剂，确定该剂量以向患者提供安全且有效的脂质体蒽环类化疗剂的量；以及确定用于施用包含蒽环类的抗her2免疫脂质体的剂量，多个该免疫脂质体各自在其表面上荷载多个抗her2的抗体分子并且各个含有蒽环类化疗剂，其中用于施用包含蒽环类的抗her2免疫脂质体的安全且有效的剂量是第一剂量。还公开了通过施用包含蒽环类的抗her2免疫脂质体来治疗人癌症患者的方法，该方法包括：针对诊断为由her2受体的表达所表征的癌症的患者确定第一剂量，这样的剂量表明剂量大小和给药频率，第一剂量用于不包含免疫脂质体的脂质体蒽环类化疗剂，确定该剂量以向患者提供安全且有效的脂质体制剂的量；以及施用包含蒽环类的抗her2免疫脂质体，多个该免疫脂质体各自在其表面上荷载多个抗her2的抗体分子并且各个含有蒽环类化疗剂，其中以第一剂量向患者施用包含蒽环类的抗her2免疫脂质体。在某些方面，蒽环类是阿霉素。在其它方面，不包含免疫脂质体的脂质体蒽环类化疗剂是盐酸阿霉素脂质体注射剂并且her2靶向免疫脂质体是mm-302。在其它方面，癌症是乳腺癌、卡波氏肉瘤、卵巢癌或多发性骨髓瘤。在其它方面，第一剂量是每两周或每三周或每四周50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2、20mg/m2或10mg/m2。在其它方面，由her2受体的表达所表征的癌症的特征还在于其为her22+、her23+或her2fish阳性。在其它方面，由erbb2受体的表达所表征的癌症的特征还在于每一细胞表达平均至少200,000个细胞表面erbb2受体。在其它方面，以第一剂量施用免疫脂质体可有效治疗癌症，并且在其它方面，与以第一剂量施用不包含免疫脂质体的脂质体蒽环类化疗剂相比，以第一剂量施用免疫脂质体不引起心肌毒性的增加。在其它方面，以第一剂量向患者施用免疫脂质体在患者血流中引起免疫脂质体的峰浓度，并且，与在没有免疫脂质体的培养基中培养的对照组人心肌细胞相比，通过在以约峰浓度包含免疫脂质体的培养基中培养以在体外处理人心肌细胞并不降低所培养心肌细胞中调蛋白(heregulin)激发的perk或pakt的增加，或降低不多于5％。在其它方面，患者血流中免疫脂质体的浓度被测量为血清免疫脂质体浓度。在其它方面，各个her2免疫脂质体在其表面荷载平均45个抗her2抗体分子。附图说明图1.her2水平对摄入的影响：使用15μg/ml的mm-302(a)和非靶性的聚乙二醇化脂质体阿霉素(ut-pld)(b)对表达各种水平的her2的多个细胞系处理2h，并且通过hplc对总的细胞内阿霉素进行定量。y轴表示相对于每一细胞的毫微微克阿霉素(左)和相对于每一细胞的脂质体(右)，x轴表示每一细胞的her2受体数量(对数级)。使小鼠肿瘤4t1细胞(c)和内源性低her2表达的hela细胞(d)转染有人her2，以产生具有不同表达水平的稳定克隆。使用含有荧光标记物的f5靶向脂质体(dii5-f5-pl)处理各个克隆(由三角形、圆形或正方形表示)，并且通过facs确定总结合/摄入。图2.(a)使用15μg/ml的mm-302(圆形)、pld(正方形)和游离阿霉素(三角形)对her2过表达的bt474-m3细胞处理指定时间(x轴，min)。通过hplc对总的细胞内阿霉素进行定量(y轴，毫微微克/细胞)。(b)在指定的孵育时间(x轴，min)之后24h，通过高含量显微术(highcontentmicroscopy)对细胞核阿霉素递送进行定量(y轴，高于背景的每一细胞的信号)。(c)在bt474-m3原位乳腺癌模型中比较mm-302和pld的抗肿瘤活性。与对照组(圆形)相比，mm-302(正方形)和pld(三角形)均显著抑制肿瘤生长(第55天t检验；p<0.0001)。相对于pld，mm-302引起更强的肿瘤生长抑制(第55天t检验；p＝0.0310)。y轴表示以mm3计的肿瘤体积，且x轴表示接种后的天数。图2d示出以q7d以及3mg/kg或6mg/kg(阿霉素当量)施用的bt474-m3异种移植物中的mm-302和ut-pld的药代动力学。y轴是血浆中的μg/ml阿霉素，且x轴是以小时计的时间。图3.体内her2水平的作用：使用dil5标记的mm-302(dil5-f5-pld)或ut-pld(dil5-ut-pl)注射在乳房脂肪垫中荷载bt474-m3异种移植肿瘤的小鼠。制备肿瘤单细胞悬液并用fitc-her2抗体进行染色。通过facs确定dil5-阳性-her2-阳性细胞。(a)示出her2水平(每一细胞的受体，x轴)作为与肿瘤细胞结合的脂质体(细胞阳性百分比，y轴)的函数的图。(b)表明在肿瘤组织切片中测量的基于单细胞的her2表达异质性的图。图4.在人心肌细胞中测量mm-302(圆形)、pld(正方形)和阿霉素(三角形)的摄入。使用15μg/ml的mm-302、pld和游离阿霉素对胚胎干细胞来源(escd)(a)和诱导的多能干细胞(ipsd)来源(b)的心肌细胞处理指定时间。通过hplc对总的细胞内阿霉素进行定量。y轴表示以毫微微克/细胞计的摄入，且x轴表示以min计的孵育时间。(c)细胞成活力：使用指定浓度的药物对escd心肌细胞处理3h并使用新鲜培养基再孵育24h，评估细胞成活力。y轴表示相比于对照组的以％计的细胞成活力，且x轴表示以μg/ml计的浓度。(d)细胞成活力：使用指定浓度的游离阿霉素(圆形)、pld(正方形)或mm-302(三角形)对ipsd心肌细胞处理24小时。收集上清液，并且在剩余细胞上进行细胞成活力检定。所有数值相对于未经处理的群体进行标准化。(e)在(d)收集的上清液中进行人肌钙蛋白i的elisa。未处理线(虚线)表示未处理的孔中可检测到的可溶肌钙蛋白i的值。所有值针对所提供标准品的稀释进行标准化。图5.使用mm-302(圆形)、pld(正方形)和游离阿霉素(三角形)以指定浓度对escd心肌细胞处理3h，然后使用新鲜培养基再孵育24h。对细胞染色并用高含量显微术成像。对各个染色的单细胞强度进行定量并将其表示为每一细胞的平均相对强度。对细胞的dna损伤标记物γ-h2ax进行染色(a)。此外，对细胞的细胞应激蛋白磷酸化p53(b)和磷酸化hsp27(c)以及凋亡蛋白parp的切割形式(cparp)进行染色(d)。y轴表示相对强度且x轴表示以μg/ml计的浓度。图6.(a)单独的f5scfv、或与空(即没有包囊的阿霉素)脂质体结合的f5scfv(“f5lipo”-脂质体，相当于mm-302但不含阿霉素)在ips来源的人心肌细胞中以最小程度降低基础perk水平，并且并不降低调蛋白刺激的perk水平，而(曲妥珠单抗)将基础水平降低到更大程度，且曲妥珠单抗和拉帕替尼均以比f5scfv或f5lipo更大的程度降低调蛋白激发水平。(b)没有测试剂在这些细胞中改变基础pakt水平，并且曲妥珠单抗和拉帕替尼均以比f5scfv或f5lipo显著更大的程度降低调蛋白激发水平。图7.(a)研究mm-302(正方形)、pld(三角形)和游离阿霉素(圆形)的生物学分布。对荷载nci-n87肿瘤的小鼠(n＝4/时间点/组)给予阿霉素、mm-302或pld的单次给药(3mg/kg)。在注射后0.5、4和24h处死小鼠，并通过hplc对心脏组织(a)、肿瘤组织(b)和爪(c)中的阿霉素积聚进行定量。(d)相比于游离阿霉素，mm-302在心脏组织中引起更低的细胞核阿霉素积聚，并且与pld相当。使用3mg/kg(阿霉素当量)的mm-302-dii5、pld-dii5和游离阿霉素静脉注射nu/nu裸小鼠。在设计的时间点，收集心脏以制备冰冻切片，从而分析脂质体和阿霉素的微观分布。注射fitc-凝集素以使功能化的/灌注的血管可视化。使用烟酸己可碱(hoechst)复染心脏切片并通过共聚焦荧光显微术对其成像(40x放大倍率)。示出阿霉素阳性细胞核。阿霉素阳性细胞核在0.5h和4h的游离阿霉素处理的样品中可见，但在mm-302处理的样品中不可见(参见“合并图”)。(e)示出阿霉素和mm-302的在0.5h时间点的上述视野的细胞核与阿霉素信号重叠的更高放大倍率(2x)。(f)使用developerxdtm对阿霉素阳性细胞核的百分比进行定量(f)。图8：建模：建立计算模型并根据关于游离和脂质体阿霉素的文献和内部数据进行校准。将其用于理解竞争动力学过程，该过程确定各种组织中脂质体vs.游离阿霉素的药物浓度和暴露。(a)pk和生物学分布：与游离阿霉素相比，脂质体递送引起长得多的循环时间。(b)组织沉积：该模型能够捕获小鼠中典型的脂质体沉积数据。(c)微观分布：动力学建模能够为理解her2表达在mm-302摄入和阿霉素细胞内运输中的作用提供框架。具体实施方式mm-302脂质体是直径为约75～110nm的单层的脂质双层囊泡，其包囊含有胶凝或沉淀状态的阿霉素的水性空间。脂膜由卵磷脂、胆固醇、和聚乙二醇衍生化的磷脂酰乙醇胺组成，含量为对于200个磷脂分子为约1个peg分子，其中对于每1780个磷脂分子，约一个peg链在其端部承载与her2结合的f5单链fv抗体片段。由hspc(氢化的大豆卵磷脂):胆固醇(植物来源):peg-dspe(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)以3:2:0.3的摩尔比制备mm-302脂质体。mm-302的总hspc脂浓度为约40mmol/l。mm-302含有约10mmol/l的脂质和约2mg/ml的阿霉素。mm-302在含有0.16～0.30mg/mldspe-peg-f5的脂质体中包含1.8～2.2mg/ml的阿霉素(如us6,210,707中记载般进行制备)。f5是抗erbb2(her2)scfv抗体片段(由atcc质粒存放指定号pta-7843所编码)。mm-302脂质体包含130～170g阿霉素/mol磷脂和12～22gf5-peg-dspe/mol磷脂。在作为缓冲液(ph6.5)的无菌10mm/l组氨酸-hcl和保持等渗性的10％蔗糖和中制备mm-302。使用预载入的硫酸铵对mm-302脂质体进行载药。mm-302剂量剂量1剂量2剂量3剂量4剂量5每周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每两周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每三周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每四周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每五周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2“mg/m2”是指，患者每平方米体表面积的阿霉素(配制为mm-302)mg。对于乳腺癌，优选剂量3、4、或5。对于卡波氏肉瘤的给药，优选剂量1、2、或3，对于卵巢癌，优选剂量3、4、或5，且对于多发性骨髓瘤，优选剂量2、3、4、或5。相比于“晚期”(转移瘤)，给药方案在“早期”(转移前，例如辅助(adjuvant)乳腺癌)的实体瘤患者中可以变动。优选的肿瘤是肿瘤细胞过表达her2的肿瘤。过表达her2的肿瘤是经herceptesttm识别为her2“3+”或her2“2+”或经荧光原位杂交识别为her2fish+的肿瘤。或者，过表达her2的优选肿瘤是由实施例中记载的方法所定量的每一细胞表达平均200,000或更多个受体的肿瘤。晚期乳腺癌的mm-302疗法每4周通过静脉(iv)输注在60分钟以8、16、30、40或50mg/m2向患者施用一次mm-302，该患者患有由fish或由ihc或通过每一细胞的her2受体的平均数量的确定而确定的过表达her2的局部晚期/不可切除或转移晚期乳腺癌。患者应该具有由以下所证实的足够的骨髓储量：1)绝对嗜中性粒细胞计数(anc)≥1,500/μl；2)血小板计数≥100,000/μl；以及3)血红蛋白≥9g/dl(允许输血)。患者应该具有由以下所证实的充足的肝功能：l)血清总胆红素≤1.5xuln；以及2)天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)和碱性磷酸酶(alp)正常或高达2.5×的正常上限(uln；如果存在肝转移和/或骨转移，对于alp，5×uln是可接受的)。患者应该具有充足的肾功能，由血清肌酸肝≤1.5×uln所证实。患者应该从任何之前的手术、放射疗法或意在治疗乳腺癌的其它疗法的任何临床相关毒性作用中恢复。须警告具有妊娠可能性的妇女以及有生育能力的男人及其伴侣在治疗过程中以及在mm-302的最后给药之后的90天避免性交或者使用有效的避孕形式。患者应该具有足够的心脏功能，如在治疗的约30天内由echo或muga测量的左心室射血分数≥50％所证实的。对怀孕或哺乳的以及具有nyhaiii或iv级充血性心力衰竭或左心室射血分数(lvef)<50％或具有延长的qtc间隔(≥460ms)的患者，优选不使用mm-302进行治疗。以下实施例仅是示例说明性的，不应该理解为以任何方式限制本公开的范围，因为在阅读本公开时，很多变化和等效物对于本领域技术人员而言是明显的。实施例用在这些实施例中的材料和方法：材料：阿霉素来自sigma-aldrich,inc.(st.louis,mo)。fitc结合的凝集素(番茄(lycopersiconesculentum)凝集素，cat#fl-1171)购自vectorlaboratories,inc.(burlingame,ca)。乙酸、甲酸和乙腈来自emdchemicalsinc.(gibbstown,nj)。水和三氟乙酸(tfa)来自j.t.baker(phillipsburg,nj)。烟酸己可碱33342三盐酸三水合(hoechst33342trihydrochloridetrihydrate)、prolong和diic18(5)-ds(dii5)来自invitrogen(carlsbad,ca)。胆固醇和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰基乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(peg-dspe)来自avantipolarlipidsinc。氢化大豆卵磷脂(hspc)来自lipoid(newark,nj)。rpmi来自lonza(walkersville,md)，胎牛血清(fbs)来自tissueculturebiologicals且青霉素g/硫酸链霉素混合物来自gibco(invitrogen)。免疫脂质体的制备：如之前记载的，制备脂质体，并使用硫酸铵梯度来装载阿霉素(kirpotin等人,cancerres.2006；66:6732-40；park等人,clincancerres.2002；8:1172-81)。脂质组分是hspc、胆固醇和peg-dspe(3:2:0.3，mol:mol:mol)。制备抗erbb2(f5)-peg-dspe结合物并将其插入到脂质体中，以形成由nellis等人报道的免疫脂质体(biotechnolprog.2005；21:205-20；biotechnolprog.2005；21:221-32)。如上所述制备dii5标记的脂质体mm-302-dii5和pld-dii5，与上述不同之处在于，在浓度为总磷脂的0.3mol％时，diic18(5)-ds(dii5)染料与脂质组分互溶。在所有情况下，使用以hepes缓冲盐水(ph6.5)洗脱的g-75尺寸排阻柱，去除未装载的游离阿霉素。以同上述相似的方式制备f5-lipo-dii5，不加阿霉素，并引入hepes缓冲盐水的水溶液(ph6.5)。肿瘤细胞培养：bt474-m3细胞(参见noble,cancerchemother.pharmacol.200964:741-51)是her2过表达的人乳腺癌细胞。bt474-m3细胞在含有10％fbs和1％青霉素g/硫酸链霉素的rpmi培养基中生长。胚胎干细胞来源(escd)的心肌细胞得自p.w.zandstra,instituteofbiomaterialsandbiomedicalengineering,universityoftoronto,toronto,ontario,canada(bauwens等人,tissueengparta.2011apr25,pmid21417693；)。这些细胞已显示出能够表达心肌细胞的适当细胞标记物，例如lim结构域同源框基因isl-1、肌钙蛋白t和肌球蛋白轻链2c。在分化之后确定肌钙蛋白t阳细胞的百分比。舍弃肌钙蛋白t阳性小于70％的批次。诱导的多能干细胞来源(ipsd)的细胞得自美国国际细胞动力学公司(celldynamicsinternational)并按照制造商的操作指南进行处理。异种移植研究：从charlesriverlaboratories或taconicfarms,inc购买5～7周龄的雌裸小鼠(ncr裸小鼠)。除非另外指出，在小鼠的右背侧使用bt474-m3乳腺癌细胞或nci-n87胃癌细胞(nci-dtp，100μlrpmi中l0×l06个细胞)对小鼠进行接种(皮下注射，s.c.)。当肿瘤达到约200mm3的平均体积时，如下所述进行研究。肿瘤her2水平的测试：在右上侧开始数的第二乳房脂肪垫中使用15×106的bt474-m3细胞对纯合ncr裸小鼠进行接种。使用单剂量的不含阿霉素的4mg/ml荧光标记(使用如下所述的dii5)的her2靶向或非靶性的脂质体，注射bt474-m3肿瘤。二十四小时之后，切除肿瘤并通过机械和酶解方式使其分离。在使用her2抗体进行表面染色之后，在facscaliburtm仪器(bdbiosciences)上通过流氏细胞术分析细胞。通过绘制由增加的her2信号所限定的窄门筛选的细胞子集中具有升高的脂质体含量的细胞的总百分比，由流氏细胞术的数据组分析her2表面表达水平与给定阈值之上的脂质体的摄入之间的关系。细胞表面her2的单细胞分布：使用抗her2抗体对bt474-m3肿瘤异种移植组织进行染色，并使用dapi进行复染。使用以20x放大倍率使片子成像，并分析图像。基于单细胞，将her2膜染色的强度定量为(her2层的内图廓的平均值)+(her2层的外图廓的平均值)。效力研究：基于小鼠的平均肿瘤体积，将小鼠随机分成三个处理组(n＝7/组)，接受pbs(对照)、mm-302或pld，以3mg/kg给药(q7d,n＝3次总给药)。使用卡尺测量肿瘤，每周两次。使用下式计算肿瘤体积：宽度2×长度×0.52。对小鼠称重，每周两次，以监测重量的减轻。her2表达细胞系中脂质体的摄入：使用15μg/ml的mm-302或pld对表达各种水平her2的多个细胞系处理2h，并且通过hplc对总的细胞内阿霉素进行定量。鼠4t1乳腺癌细胞和人hela子宫颈癌细胞得自atcc并根据atcc建议进行增殖。通过流氏细胞术，使用市售的抗her2抗体(bdbiosciences#340552)来表征细胞中人her2的表达。该抗体不与鼠her2交叉反应但检测人her2。对人her2进行编码的新霉素可选择的表达载体得自genecopeia(z2866)。使用非脂质聚合物转染试剂1.0(origene)根据制造商的说明书，用该构造来转染4t1和hela细胞。使用400～500μg/ml的遗传霉素/新霉素(invitrogen)来筛选转染细胞。使存活的细胞在降低的遗传霉素/新霉素浓度(100μg/ml)下扩张，并在bdbiosciencesfacsariatm仪上分选，以获得超过在亲代hela细胞中观察到的人her2表达的强化细胞群。然后使分选-强化的细胞通过有限的稀释进行亚克隆，并且通过her2表面水平对克隆进行分级，以获得表达不同范围her2的4t1和hela细胞的代表群体。根据制造商的说明书，将通过流氏细胞术测量的her2表面染色的荧光强度与使用结合至quantumtmsimply抗小鼠igg微球(bangslaboratories#815)的相同抗体的染色进行比较，以计算细胞的her2表面受体的数量。心肌细胞中脂质体的摄入：按照制造商的说明书(celldynamicsinternationalcat#cmc-100-110-001)，将ipsd心肌细胞以250,000个细胞/孔放置于24孔组织培养板中。两天后，去除孔中0.5ml的培养基，并替换为0.5ml的15.0μg/ml(阿霉素当量)的mm-302、pld或游离阿霉素。以“8字形”将板旋转20次，以使细胞最大化地暴露于脂质体。使用mm-302、pld或游离阿霉素以所指定时间孵育细胞，之后去除培养基，用0.5ml的pbs将细胞洗涤一次。去除pbs，并向各个孔添加0.5ml的0.05％胰蛋白酶。监测细胞，一旦开始分离，向各个孔添加0.5ml的含有fbs的培养基，以使胰蛋白酶失活。收集细胞并将其放置于微量离心管中。将细胞在4℃以1,500rpm旋转5分钟。通过涡旋和抽吸将细胞球重悬在0.5ml的1.0％乙酸于甲醇中的溶液中，并将其在-80℃放置1小时，以提取阿霉素。将含有重悬细胞球的微量离心管在冷室中以10,000rpm旋转10分钟，并将450μ1的上清液转移到hplc管。在hplc机器上运行样品，并且通过将数值关联到阿霉素标准曲线来确定每个样品的浓度。脂质体的生物学分布：将小鼠随机分成4组，分别接受pbs、阿霉素、mm-302-dii5或pld-dii5的单次静脉(i.v.)给药(均为3mg/kg)。在单次给药之后的0.5、4、24和96h(阿霉素)或168h(mm-302-dii5和pld-dii5)处死小鼠(n＝4/时间点/组)。在处死前五分钟，使用100μl的fitc-凝集素静脉(i.v.)注射小鼠，以标记脉管细胞。阿霉素的hplc定量：对心脏组织进行称重，并使用tissuelysertm(qiagen)以1mlh2o解聚3min。然后将100μl的组织匀浆转移到新管中并添加900μl的1％乙酸/甲醇。对于培养细胞，如上所述，用药物处理细胞、使其受胰蛋白酶作用并使用1.0％乙酸于甲醇的溶液使其裂解。将裂解产物涡旋10秒并在-80℃放置1h。将样品在室温(rt)下以10,000rpm旋转10min。通过hplc(dionex)，使用c18反相柱(synergitm250×4.60mm4μm柱)来分析上清液和阿霉素标准品。洗脱阿霉素，在7min时间中，以1.0ml/min的流量运行以下梯度：30％乙腈；70％0.1％三氟乙酸(tfa)/h2o至55％乙腈；45％0.1％tfa/h2o。使用在485nm处激发并在590nm处发射的内嵌的荧光检测器，在6.5min时检测阿霉素峰。通过使用已知量阿霉素的对照组心脏的峰确定的，心脏组织中阿霉素的提取率是83％。心脏速冻切片的共聚焦显微和图像分析：10μm厚的心脏切片在室温下风干30min，使用在贴片介质(gold,invitrogen)中1:10,000稀释的进行复染，并进行贴片。在装备有enterprise(351、364nm)、氩(argon)(458、477、488、514nm)、hene1(543nm)和hene2(594nm)激光以及plan-40×/1.3dic油镜的lsm510共聚焦显微镜上使片子成像。使用developerxdtm(definiens,parsippany,nj)进行细胞核阿霉素的图像分析和定量。在hoechst通道中分离出细胞核。在阿霉素通道中分离出阿霉素阳性细胞核。以阿霉素通道中目标对象的数量除以hoechst通道中总细胞核对象，来定量阿霉素阳性细胞核的百分比。受体定量：使干细胞来源的心肌细胞受胰蛋白酶作用，洗涤，并如以上“her2表达细胞系中脂质体的摄入”所述地确定her2水平。成活力：以指定浓度的mm-302、pld和阿霉素处理escd心肌细胞3h。用pbs洗涤细胞两次，添加新鲜培养基，将细胞再孵育24h。使用promega(madison,wi)的celltiter-评价细胞成活力，并且相对于未处理的群来确定成活细胞的百分比。肌钙蛋白i的elisa：按照制造商的操作指南对15,000个ipsd心肌细胞(cellulardynamicsinternational,madisonwi)进行铺板。使用指定浓度的游离阿霉素、pld或mm-302处理细胞24h。收集上清液并使用人肌钙蛋白ielisa(catalog#:gwb-83a61f,genwaybiotech,sandiegoca)按照制造商的操作指南进行分析。按照制造商的操作指南，在100μl的剩余细胞上进行细胞成活力检定(catalog#:a-13261,invitrogen,grandisland,ny)。高含量(high-content)分析：如上所述处理心肌细胞。使用3.7％甲醛固定细胞，使用含有0.1％吐温20的pbs(pbs-t)洗涤两次，并用甲醇使其通透。使用封闭缓冲液(lincoln,ne)与pbs-t的1:1混合物在室温(rt)下封闭细胞1h。使用1:400稀释的cellsignalingtechnology(beverly,ma)的指定一抗对细胞进行染色，并在4℃摇动孵育过夜。洗涤细胞，并用1:2,000稀释的荧光标记二抗在室温下孵育1h。使用pierceproteinresearchproducts(rockford,il)的1:10,000稀释的hoechst33342和1:1,000稀释的全细胞染料(wholecellstain)，在室温下对细胞染色30min，以分别使dna和全细胞可视化。使用具有10×物镜的appliedprecisioninstrumentsarray高含量扫描仪(issaquah,wa)来扫描板的hoechst33342/全细胞染料(460nm)、阿霉素(595nm)和apc/dii5(657nm)。使用软件imagerail(如millard等人,natmethods.2011；8:487-92中记载的)来分析图像。对细胞核和全细胞信号建立强度阈值。然后将该阈值应用于所有图像并且用于分离出单个细胞。数据呈现为对于指定通道的给定孔中所有细胞的平均像素强度。心肌细胞中的信号转导：使用icelltm铺板培养基(cdi#cmm-100-110-005,lot1013740)和icelltm维持培养基(cdi#cmm-100-120-005,lot1000305)来培养ips来源的心肌细胞(icelltmips来源的人心肌细胞-cellulardynamicsinternational(cdi),madison,wisconsin-cdi#cmc-100-010-001,lot1258680)，并将其暴露于mm-302的组分。然后使用免疫染色和高含量显微术(highcontentmicroscopy)测量心肌细胞中磷酸化akt(pakt)和磷酸化erk(perk)的水平。使用曲妥珠单抗、拉帕替尼、或mm-302抗体(f5-scfv)以及当量浓度为5.0μg/mlmm-302的不含阿霉素(f5-lipo)的mm-302分子(脂质体)对细胞预处理24小时。在分别用10nμ和5nm的调蛋白刺激l0分钟后，如上所述，针对(a)pakt和(b)perk对细胞进行染色，并使用高含量显微术进行成像。之后在封闭缓冲液中以1:400稀释使用以下一抗：perk抗体-细胞信号转导技术公司(cst-danversmassachusetts)-目录9106l(磷酸化p44/42mapk(erk1/2)(thr202/tyr204)(e10)小鼠mab#9106)；pakt抗体-cst-目录4060l(磷酸化akt(ser473)(d9e)xptm兔mab#4060)。二抗是抗小鼠igg(h+l)f(ab')2片段(alexa647结合物)-cst目录4410；抗兔igg(h+l)f(ab')2片段(alexa647结合物)-cst-目录4414。如上所述使用全细胞染料和dna染料(hoechst33342)。分析图像，并基于hoechst33342细胞核染色来分离单个细胞。对各个染料的单细胞信号强度进行定量并将其表示为单个细胞的平均相对强度。使用上述方法或其较小变型来获得以下实施例中的结果。在表达各种水平her2的肿瘤细胞系中的细胞摄入研究表明，相比于pld，mm-302向her2过表达肿瘤细胞递送显著更高的阿霉素水平，并且与高渗透的游离阿霉素相似或比其更高。然而，在人心肌细胞中，尽管游离阿霉素再次以高水平吸收，但mm-302和pld的阿霉素摄入显著更低。小鼠中的药代动力学研究表明，与pld相比，mm-302具有相似的半衰期、清除率和器官分布。在her2过表达的bt474乳腺肿瘤异种移植物和nci-n87胃肿瘤异种移植物中，mm-302显示出比游离蒽环类和pld更优异的抗肿瘤活性。肿瘤微观分布研究还表明，阿霉素在肿瘤中的定位差异可能是mm-302相比于游离阿霉素和pld具有增强活性的原因。实施例1：在体外实验中的her2表达与mm-302摄入之间的相关性：如上所述确定多个细胞系的细胞表面her2表达水平。然后，使用15μg/mlmm-302(图1a，表1)或pld(图1b，表2)对相同的细胞系处理180分钟，之后收集细胞并通过hplc对与细胞相关的阿霉素的量进行定量。通过绘制各个细胞系的每一细胞的her2受体数量vs.处理之后相同细胞系中每一细胞中存在的阿霉素的量，不断增加的her2水平与不断增加的阿霉素之间的关系变得明显。通过该表示，在每一细胞约200,000个her2受体处呈现出拐点，而表达大于该数目的细胞似乎具有持续更高水平的细胞相关阿霉素。总的来说，这些结果支持mm-302的特异性，表达在拐点之上的her2水平的细胞(例如her2过表达癌症)有高摄入，表达低于拐点的(例如正常组织中的细胞，例如心肌细胞)her2水平的细胞具有“从无到极少”的摄入。表1：her2水平vsmm-302摄入(mkn-45细胞的结果在检测水平之下)表2her2水平vspld摄入(adrr-her2、hcc1954和mda-mb-361细胞的结果在检测水平之下)为对不同细胞群体中的摄入进行定量，mm-302制备成含有红色荧光羰花青示踪剂diic18(5)-ds(invitrogend12730-简称为dii5)。dii5是亲脂性荧光染料，其在挤压过程中被插入到脂质体的脂双层中。表达不同范围的人her2的4t1-her2细胞群体与10μg/ml荧光标记的mm-302一起孵育3小时，洗涤，并再孵育21小时。收集细胞，对细胞表面的人her2进行染色并经流氏细胞术分析her2水平和脂质体结合程度。尽管4t1细胞系表达鼠her2，mm-302不与鼠受体结合。图显示出，4t1细胞对这些脂质体的摄入强烈地依赖于人her2的表达(图1c)。在表达不同范围的her2的hela细胞系群体中获得相似的结果(图ld)。这些结果还表明，mm-302在与具有高her2水平的细胞的结合中高度有效，但几乎不结合或不结合具有相对较低her2蛋白表达的细胞。实施例2：mm-302能有效地内化到her2过表达肿瘤细胞中，并显著抑制异种移植模型中肿瘤的生长：为确定mm-302对her2过表达肿瘤细胞的结合和内化水平，将bt474-m3细胞(1.7×l06个her2/细胞)与15μg/ml的mm-302、pld或游离阿霉素孵育高达3h(图2a)。由总细胞结合(图2a)和细胞核阿霉素积聚(图2b)所证实，mm-302有效地进入肿瘤细胞。相比之下，非靶性的类似物pld没有显示出任何可评估的积聚，表明，在体外实验中，需要靶向从而有效递送脂质体阿霉素。作为对照，游离阿霉素显示出可自由地进入细胞并积聚在细胞核中。结果显示出mm-302(而非pld)对her2过表达肿瘤细胞的有效结合和内化。在乳腺癌异种移植模型中评价mm-302的抗肿瘤活性。使用bt474-m3细胞接种小鼠，并且当肿瘤体积达到250mm3的平均值时，开始用pbs(对照)、mm-302或pld(均为6mg/kg阿霉素当量)进行处理(q7d，n＝3次给药)。相比于对照组，mm-302和pld均显著地抑制肿瘤生长(第55天的t检验；p<0.0001)。相对于pld，mm-302引起更强的肿瘤生长抑制(第55天的t检验；p＝0.0310)(图2c)。在研究结束时，在mm-302中观察到3个完全的消退，而在pld中仅观察到1个。mm-302和pld具有相似的药代动力学特性(图2d)，表明提高的效力是her2靶向的结果，而非延长的暴露的结果。实施例3：her2水平对体内mm-302摄入的影响：进行实验来证实异种移植模型中由her2介导的靶肿瘤细胞对mm-302的摄入，并与非靶性的脂质体阿霉素比较。使用dil5标记的mm-302(dil5-f5-pld)或ut-pld(dil5-ut-pl)来注射在乳房脂肪垫中荷载bt474-m3异种移植肿瘤的小鼠。制备肿瘤单细胞悬液，并用fitc-her2抗体对其染色。通过facs确定dil5-阳性-her2-阳性细胞。识别出具有提高的阿霉素水平的区别细胞群，表明脂质体不仅仅沉积在肿瘤间隙中，还吸收到细胞自身中(图3a)。这在从her2靶向脂质体处理的肿瘤得来的细胞样品中特别明显。具有提高的脂质体含量的细胞的百分比在每一细胞表达平均100,000和200,000个her2受体的细胞子集中开始上升。非靶性的脂质体不会被优先摄入到her2阳性细胞中。这些结果表明，体内肿瘤细胞中mm-302的摄入是her2依赖性的，并且结果还支持，相对于每一细胞至少为100,000～200,000个her2受体的水平是mm-302的显著结合和内化所必需的。基于单个细胞，在全组织切片中确定her2膜强度的分布，并显示在图3b中，呈现出组织中表达的变化性。实施例4：人心肌细胞不表达充足的her2水平以主动摄入mm-302：已报道，人心肌细胞表达低水平的her2，因此被认为具有mm-302摄入的潜能。获得escd和ipsd人心肌细胞，以研究mm-302对体外人心脏细胞的作用。通过qfacs将心肌细胞上的her2受体水平确定为，在人escd和ipsd心肌细胞中分别为每一细胞约70,000和200,000个受体。这些结果与所报道的人心脏组织中her2表达低是一致的(fuchs等人,breastcancerrestreat.2003；82:23-8)。经定量免疫组化测量正常和患病的人心脏组织上的her2表达水平。对人心脏组织微阵列(tma)进行her2和dapi染色，并且使用软件对(平均her2强度)/细胞核进行定量。如上所述，对处于不同her2表达水平的细胞系的细胞团阵列进行染色，并且对(平均her2强度)/细胞核进行定量，并针对相应log(her2受体#)绘图以产生标准。基于所产生的标准，插入不同人心脏tma细胞核的平均her2受体#/细胞核(表3)。表3：插入的her2受体数量为确定心肌细胞上her2表达水平是否足以引起mm-302的摄入，在对escd(图4a)和ipsd(图4b)心肌细胞处理之后通过hplc对总的细胞内阿霉素进行定量。用游离阿霉素处理的心肌细胞(和癌细胞)引起阿霉素在所有细胞中积聚。pld的处理不在任何心肌细胞类型中引起增加的阿霉素递送。与her2过表达的癌细胞相比，心肌细胞上的her2表达水平不足以促进mm-302的主动摄入。总的来说，这些结果表明，与pld相比，经由mm-302的阿霉素递送并不增加对低水平her2表达的非靶性细胞例如心肌细胞的阿霉素暴露。实施例5：mm-302不减少人心肌细胞的成活力或激发凋亡反应：暴露于低水平阿霉素可能有细胞毒性。为确定mm-302或pld的处理是否影响心肌细胞的成活力，escd心肌细胞与指定浓度的游离阿霉素、pld或mm-302孵育3h，随后洗涤，并在新鲜培养基中孵育24h。游离阿霉素的处理在低至0.2μg/ml的浓度下就会导致成活力的损失(图4c)。相反地，mm-302和pld的处理在测试的任何浓度下均不引起成活力的降低，包括高达45μg/ml的超治疗浓度。为进一步测试mm-302或pld的处理是否影响心肌细胞的成活力，使用指定浓度的游离阿霉素、pld或mm-302对ipsd心肌细胞处理24小时。与pld和mm-302的处理相比，阿霉素的处理导致成活力明显降低(图4d)。升高水平的心肌肌钙蛋白的存在是心脏损伤的临床指征。对(d)中ipsd心肌细胞的上清液分析肌钙蛋白i的水平。如图4e所示，与pld或mm-302的处理相比，阿霉素处理导致肌钙蛋白i的显著增加。这些结果表明，escd和ipsd心肌细胞对阿霉素敏感，且mm-302和pld的处理不提供充足的阿霉素暴露来影响心肌细胞的成活力。细胞对低水平阿霉素的暴露可能引起在细胞成活力测量中无法反映出的微小细胞变化，包括dna损伤、细胞应激和初期凋亡。在用mm-302、pld和游离阿霉素处理之后，对心肌细胞中各个这些应答通路中的蛋白进行染色，并使用高含量显微术进行成像。通过使用imagerail分析所得的图像，产生单细胞数据。响应于双链dna损伤，组蛋白h2ax变为磷酸化，从而形成γ-h2ax。用游离阿霉素处理心肌细胞会导致剂量依赖性的细胞核γ-h2ax的增加(图5a)。然而，mm-302和pld的处理不会在任何测试浓度增加细胞核γ-h2ax信号，表明在体外实验中，脂质体包囊防止对心肌细胞的dna损伤。响应于细胞应激，hsp27和p53可以被磷酸化，导致细胞周期阻滞，随后根据损伤程度的不同进行dna修复或凋亡。暴露于游离阿霉素的心脏细胞证实磷酸化hsp27和磷酸化p53的剂量依赖性增加，表明处理之后引起细胞应激(图5b和5c)。然而，在mm-302或pld处理的细胞中，不管浓度如何，没有观察到磷酸化hsp27的增加。在大多数情况下，在mm-302或pld处理的细胞中，似乎对磷酸化p53没有作用，除在用5.0μg/ml的mm-302处理之后磷酸化p53稍有增加。然而，以此浓度以及更高的浓度处理并不引起增加的细胞死亡。在严重的dna损伤和细胞应激的情况下，细胞可以引发凋亡通路，包括胱天蛋白酶级联反应的活化，最终引起dna修复蛋白parp的切割。5.0μg/ml游离阿霉素的处理引起细胞核中已切割的parp(cparp)的增加(图5d)，与观察到的细胞死亡增加相关。然而，mm-302或pld的处理不会引起增加的细胞核cparp，表明在这些条件下的处理不足以引起凋亡。实施例6：her2靶向剂对心肌细胞中细胞内信号转导的影响：阿霉素和曲妥珠单抗的同时使用是禁忌，因为在组合治疗的患者中观察到心脏事件的不可接受的高发率。与该组合相关的心肌毒性的作用机理被认为是，同时诱发了由阿霉素造成的细胞应激以及由曲妥珠单抗介导的her2信号转导通道的抑制，其中该信号转导通路是响应于阿霉素引起的细胞应激所必需的。为确定mm-302的预处理是否改变her2介导的信号转导(心肌细胞中的重要通路)，使用曲妥珠单抗、拉帕替尼(小分子her2酪氨酸激酶抑制剂)或mm-302抗体(f5-scfv)以及与mm-302相同除其不含阿霉素外的空脂质体(f5-lipo)来对ipdd心肌细胞预处理24小时。在使用10nμ(图6a)和5nm(图6b)调蛋白(hrg)激发10min后，如上所述通过高含量显微术测量磷酸化akt(pakt，图6a)和磷酸化erk(perk，图6b)的水平。用曲妥珠单抗预处理24h引起两种蛋白的hrg介导磷酸化的降低。拉帕替尼的预处理引起akt和erk的基础磷酸化的降低，以及这些蛋白的hrg诱导的磷酸化的完全抑制。f5-lipo的预处理不抑制akt或erk的hrg诱导的磷酸化。这些结果表明，尽管靶向her2，mm-302不抑制心肌细胞中配体引发的磷酸化akt和磷酸化erk信号转导，使得这些重要的信号转导通路仍正常工作。这些结果还示出，曲妥珠单抗和拉帕替尼比f5scfv或f5lipo对心肌细胞中信号转导通路具有显著更大的负面影响。进而这是mm-302的抗her2抗体组分比抗her2抗体曲妥珠单抗具有更少心脏毒性的表征。结果示出，单独的f5或与mm-302脂质体的外部连接的f5不干预心肌细胞中调蛋白(配体)-激发的her2/her3异二聚体介导的信号转导，该信号转导是重要的细胞内信号转导形式，对该信号转导的抑制被认为是介导曲妥珠单抗引发心肌毒性的关键机制。实施例7：相比于游离阿霉素，mm-302在小鼠心脏组织中具有更低的积聚：具有高度特异性的抗体片段例如f5的脂质体靶向通常不会改变脂质体的总的组织沉积，而会在外渗之后改变其微观分布。在如上所述接种的荷载nci-n87肿瘤的小鼠的鼠心脏组织(图7a)、人异种移植肿瘤组织(图7b)和爪组织(图7c)中，比较mm-302(正方形)、pld(ut-pld，三角形)和阿霉素(游离阿霉素，圆形)的宏观水平的生物学分布。使用mm-302、pld或游离阿霉素(均为3mg/kg阿霉素当量)对小鼠进行静脉注射(n＝4/时间点/组)，并在注射后0.5、4、24和96h(对于阿霉素)或168h(对于mm-302和pld)收集心脏并通过hplc对阿霉素进行定量(图7a)。相比于两种脂质体制剂，游离阿霉素的注射在0.5h时引起心脏中的高峰值暴露(10％的注射剂量(i.d.)/g组织)。在游离阿霉素注射之后，心脏组织中阿霉素的清除比mm-302和pld更快，并且在24h时，所检测到的阿霉素的量(0.77％的i.d./g组织)接近背景。mm-302和pld均具有持续的积聚特性，在24h达到峰值(对于mm-302和pld分别为2.8％和2.6％)，而数值在168h时返回到背景。这些结果的范围与之前报道的其它pld制剂在心脏的生物学分布数据相似。在mm-302和pld的心脏生物学分布之间没有观察到显著的差异。实施例8：相比于游离阿霉素，mm-302在小鼠组织中引起更低的细胞核阿霉素积聚。在从注射有游离阿霉素、mm-302-dii5或pld-dii5(均为3mg/kg阿霉素当量)的小鼠心脏组织产生的冰冻切片中，在注射后0.5、4和24h，分析阿霉素(天然荧光)和脂质体(dii5标记的)的微观分布。为使心脏脉管系统可视化，在处死前5min使用fitc-凝集素静脉注射小鼠。通过荧光共聚焦显微术使心脏切片成像。在分析的三个时间点(0.5、4和24h)的不同处理组的代表性视野显示在图7d中。也对未处理的心脏成像并且在图7d(左板块)中显示代表性图像。阿霉素与细胞核信号的共定位显示在图7d的底板块中。对于在0.5h时间点的阿霉素和mm-302，细胞核阿霉素信号的更高倍图像显示在图7e中。尽管对于mm-302，阿霉素信号在细胞核中不可见，对于游离阿霉素，大多数细胞核是阿霉素阳性的。如上所述分析图像，并且确定阿霉素阳性细胞核的百分比。注射游离阿霉素在0.5h时引起显著的阿霉素的细胞核积聚，其中约50％的细胞核为阿霉素阳性。然而，经过4h，仅23％的细胞核为阿霉素阳性且信号在24h时返回到基础水平。对于脂质体制剂，在大多数视野检测到几乎没有信号至没有信号。偶尔在dii5通道(脂质体)中检测到信号。在这些情况下，脂质体信号主要与fitc-凝集素信号共定位，表明脂质体没有外渗到心脏组织而仍保留在血管腔隙。在mm-302-dii5或pld-dii5处理时，在大部分分析的心脏视野中，没有在细胞中检测到阿霉素，与时间点无关。在0.5h收集的四个mm-302-dii5心脏的一个中，以及在4h收集的四个mm-302-dii5心脏的一个中，在血管外检测到脂质体信号，并且在较小百分比的细胞核中发现阿霉素。相似地，在0.5h收集的四个pld心脏的一个中，以及在24h收集的四个pld心脏的两个中，图像反映血管外脂质体信号以及细胞核阿霉素的存在。这些视野没有呈现为代表性图像，然而其数值被用于图7f所示的定量。mm-302和pld曲线下的面积均在统计学上显著低于游离阿霉素auc(p<0.001)。在mm-302与pld的auc之间没有观察到显著差异。为在心脏组织中得到阿霉素分布和脂质体分布的更广的可视化，采用全心脏切片扫描。全切片心脏扫描在视觉上证实共聚焦显微术的结果，显示出游离阿霉素注射时较广的具有细胞核定位的阿霉素分布，而在注射有dii5mm-302或dii5pld的小鼠心脏中仅有稀少的脂质体和阿霉素信号。总而言之，比起游离阿霉素处理之后所观察到的，mm-302或pld的处理显示出显著更低的细胞核阿霉素积聚，但这在mm-302和pld之间没有显著不同。等效形式本领域技术人员将意识到，或者仅使用常规实验就能够确定并执行本文记载的具体实施方式的许多等效形式。这些等效形式意在包含在权利要求中。在从属权利要求中公开的实施方式的任何组合预计将在本公开的范围内。参考引入对本文提到的各个和每个美国及外国专利和待决专利申请和公开物的公开内容均特定地通过引用的方式全部合并入本文。当前第1页12