含金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白和虾青素的软膏及制备与应用的制作方法

本发明属于日化领域，具体涉及一种含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏及制备与应用。

背景技术：

葡萄球菌属(staphylococcus)中的金黄色葡萄球菌(s.aureus)致病力最强，常引起食物中毒。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，直径为0.8～1.0μm，呈葡萄状。无芽抱、无鞭毛。需氧和兼性厌氧菌，生长温度在6.5～46℃之间，最适温度为30～37℃。可在ph4.0～9.8范围内生长，最适生长ph7.4。能在15％nacl和40％胆汁中生长。在普通肉汤固体培养基上能形成光滑、低凸、闪光、边缘整齐的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。

该菌在20～37℃条件下，能产生引起食物中毒的肠毒素。其中，金黄色葡萄球菌肠毒素b是由金黄色葡萄球菌分泌的一种细菌性超抗原，具有多种生物学活性。超抗原活化t细胞的方式与通常抗原不同，它可不经过抗原提呈细胞(apc)的内化、降解过程，直接与mhcⅱ类分子及tcr-β链的v区结合，选择性地大量扩增和激活t细胞，故表达mhcⅱ类分子的细胞都能与之结合，激活的t细胞能对表达mhcⅱ类分子的靶细胞产生细胞毒作用，这种作用被称为超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen-dependentcellmediatedcytotoxicity，sdcc)。与此同时还能诱导肿瘤敏感性细胞因子如ifn-γ、tnf-α、il-2的产生，从而达到间接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。与普通抗原相比，超抗原seb不需apc的处理，亦不受mhcⅱ类分子的限制，又由于vβ基因的多态性，针对某一特定的超抗原，在t细胞库中约有5％～20％细胞可发生反应。基于此，超抗原seb目前被越来越多地应用于肿瘤治疗方面，成为免疫学研究的一个重要方向。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏。

本发明的另一目的在于提供上述含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏，包含如下按质量百分比计的组分：

所述的金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏，优选包含如下按质量百分比计的组分：

所述的摩擦剂优选为云石粉、二氧化硅、碳酸钙、焦磷酸钙、磷酸氢钙和氢氧化铝中的至少一种；

所述的保湿剂优选为聚乙二醇、丙二醇、山梨醇和甘油中的至少一种；

所述的增稠剂优选为黄原胶、羟丙基瓜尔胶和羧甲基纤维素钠中的至少一种；

所述的发泡剂优选为月桂醇硫酸钠和十二烷基硫酸钠中的至少一种；

所述的甜味剂优选为糖精钠；

所述的缓冲剂优选为磷酸氢二钠和焦磷酸钠中的至少一种；

所述的seb蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；

所述的编码seb蛋白的基因的核苷酸序列如下所示：

gagaacctgtacttccagggcgaaagccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaaagcagcaaattcaccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgacaaccacgtctccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgtacttcgacctgatctactccatcaaagacaccaaactgggtaactacgacaacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctggcggacaagtacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactactactaccagtgctacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcccaccagaccgataaacgcaagacctgcatgtacggcggcgtgaccgaacacaacggcaaccagctggacaaataccgcagcatcaccgtgcgcgtgttcgaggacggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaagaaaaaagtgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacctggtgaaaaacaaaaaactgtacgagttcaacaactccccgtacgaaaccggctacatcaagttcatcgaaaacgaaaacagcttctggtacgacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtccaagtacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagcaaagacgtgaaaatcgaagtgtacctgaccaccaaaaagaaataatga

所述的seb蛋白的制备方法，优选包含如下步骤：

(1)通过全基因合成，得到如seqidno.1所示的编码重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的基因；

(2)使用引物x5523-1和引物x5523-34对步骤(1)得到的基因进行pcr扩增，得到目的片段并回收纯化；

(3)将步骤(2)回收纯化后的目的产物与载体进行连接，得到重组质粒；

(4)将步骤(3)制得的重组质粒转入宿主细胞中，得到表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株；

(5)将步骤(4)制得的表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株作为表达菌株，基于大肠杆菌表达系统进行诱导表达；离心收集菌体，洗涤悬浮，然后超声破碎，离心，收集上清，纯化，得到seb蛋白；

步骤(2)中所述的引物x5523-1和引物x5523-34的核苷酸序列如下所示：

引物x5523-1：gacacggtaccgagaacctgtacttccag；

引物x5523-34：gtgtcctcgagtcattatttctttttggtggtcagg；

步骤(3)中所述的载体优选为pet-32a；

步骤(4)中所述的宿主细胞优选为大肠杆菌bl21(de3)；

步骤(5)中所述的诱导表达的具体操作优选为：将表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株进行液体扩大培养至od值达到0.5～0.6时，添加终浓度为0.5mm的iptg，220rpm、37℃诱导4h；

所述的液体扩大培养，包含如下步骤：

挑取表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株的单菌落于含有终浓度为50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，220rpm过夜培养，得到种子液；将培养的种子液按1：100体积比接种于含有终浓度为50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，220rpm培养；

步骤(5)中所述的洗涤悬浮的试剂优选为破碎buffer，所述的破碎buffer为含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs缓冲液，ph值为7.4；

步骤(5)中所述的超声破碎的条件优选为：冰浴下，超声功率为400～450w，超声时间为5～25min，其中，超声2s，暂停6s为一个循环；

步骤(5)中所述的纯化，包含如下步骤：

(ⅰ)第一次镍琼脂糖亲和层析

①将ni-ida(镍-亚氨基二乙酸，亲和层析介质)装柱，用3倍柱床体积的bindingbuffer1清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②将超声破碎、离心、收集得到的上清上柱，流速为2ml/min；

③5倍柱床体积的bindingbuffer1清洗柱子，流速3ml/min；

④washbuffer洗杂，流速3ml/min，收集穿透液；

(ⅱ)酶切去除蛋白标签

将步骤(ⅰ)收集的穿透液进行透析，然后加入tev酶，酶切去除标签，得到酶切后的穿透液；

(ⅲ)第二次镍琼脂糖亲和层析

①将ni-ida装柱，用3倍柱床体积的bindingbuffer2清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②将步骤(ⅱ)酶切后的穿透液上柱，流速为2ml/min，收集穿透液；

(ⅳ)过滤

将步骤(ⅲ)收集的穿透液经过0.22μmca(醋酸纤维素)滤膜过滤，得到seb蛋白；

步骤(ⅰ)中所述的bindingbuffer1优选为含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs缓冲液，ph值为7.4；

步骤(ⅰ)中所述的washbuffer优选为含20mmimidazole的1×pbs缓冲液，ph值为7.4；

步骤(ⅱ)中所述的透析优选为采用到ph值为7.4的1×pbs缓冲液透析2h；

步骤(ⅱ)中所述的酶切的条件优选为25℃酶切过夜；

步骤(ⅲ)中所述的bindingbuffer2优选为ph值为7.4的1×pbs缓冲液；

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的制备方法，包含如下步骤：

(1)将摩擦剂、保湿剂、增稠剂、甜味剂、缓冲剂、植酸钠、单氟磷酸钙和水混合均匀，得到得到膏体1；

(2)在步骤(1)制得的膏体1中加入seb蛋白和虾青素，混合均匀，得到膏体2；

(3)在步骤(2)制得的膏体2中加入剩余组分(香料和发泡剂)，混合均匀，得到膏体3；

(4)膏体3抽真空，得到含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏；

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏可进一步包装，如：灌装；

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏可添加于牙膏中，或作为牙膏伴侣使用；

所述的牙膏伴侣的使用方法，包含如下步骤：

将牙膏挤于牙刷上，将含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏挤于牙膏上，然后按照常规方法刷牙；

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的用量为牙膏用量的10～50％；

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏在日化领域中的应用；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明将超抗原金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白(seb蛋白)添加到软膏中，可有效预防和治疗牙周炎。

(2)本发明通过合理配比，使得超抗原金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白能够稳定有效存在于软膏中。

(3)本发明将虾青素添加到软膏中，可与seb蛋白产生协同增效作用，具有消除或减轻牙周炎红肿、牙龈出血等作用，且还具有抗敏感功效。

(3)本发明提供的超抗原金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白纯度高，活性强，其制备方法简单，耗时短，成本低。

附图说明

图1是实施例1第二轮扩增得到的编码重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的基因的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，m：dnamarker；1：编码重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的基因。

图2是实施例1酶切后的载体pet-32a的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，m：dnamarker；1和2：kpni和xhoi酶切后的载体pet-32a。

图3是实施例1构建好的重组载体pet32a-seb酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，m：marker；1：酶切后的重组质粒pet32a-seb。

图4是实施例3小试培养选择最佳的诱导条件的sds-page电泳分析图；其中m：proteinmarker；1：阴性对照；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。

图5是实施例3中第一次镍琼脂糖亲和层析纯化sds-page电泳分析图；其中，m：marker；1：细菌破碎上清；2：流出(穿透液a)；3：20mmimidazole洗脱组分(穿透液b)；4：50mmimidazole洗脱组分(穿透液c)；5：500mmimidazole洗脱组分(洗脱液d)，loading中含有还原剂。

图6是是实施例3中第二次镍琼脂糖亲和层析纯化sds-page电泳分析图；其中，m：proteinmarker；1：酶切前的穿透液b；2：酶切后的穿透液b；3:流出(穿透液e)；4～5：20mmimidazole洗脱组分(穿透液f)；6：500mmimidazole洗脱组分(洗脱液g)，loading中含有还原剂。

图7是实施例3纯化过滤后的目的蛋白的sds-page电泳分析图。

图8是纯化后的融合蛋白和去标签后的目的蛋白的westernblot分析图；其中，m：prestainedmarker；1：融合蛋白；2：去标签后目的蛋白。

图9是实施例3构建的标准蛋白bsa含量的标准曲线图。

图10是使用实施例4制得的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏一周后的治疗效果图；其中，a：使用前；b：使用三天后；c：使用一周后。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1重组质粒pet32a-seb的构建

(1)扩增编码重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的基因

根据已公开的金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白序列(ncbireferencesequence:wp_072497559.1)，重新优化设计金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白序列，根据优化后的基因序列设计合成引物34条，通过第一轮pcr扩增出足够量的目的产物dna，其中，反应体系(50μl)如下所示：

其中，引物mix为引物x5523-1～x5523-34，共34条，0.4μl×34＝13.6μl；引物序列如下所示：

x5523-1：gacacggtaccgagaacctgtacttccag；

x5523-2：cgggtccggctggctttcgccctggaagtacaggttctcg；

x5523-3：gccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaaagcag；

x5523-4：tccatcaggccggtgaatttgctgcttttgtgcagttcat；

x5523-5：caccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgac；

x5523-6：acgttgatggcggagacgtggttgtcgtcgtacagcactt；

x5523-7：tctccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgta；

x5523-8：atggagtagatcaggtcgaagtacaggaactgatcgatgc；

x5523-9：tcgacctgatctactccatcaaagacaccaaactgggtaa

x5523-10：tcgacgcggacgttgtcgtagttacccagtttggtgtctt；

x5523-11：caacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctggcggac；

x5523-12：gtccacgtatttgtctttgtacttgtccgccaggtctttg；

x5523-13：tacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactact；

x5523-14：ttttggagaagtagcactggtagtagtagttcgcgccgaa；

x5523-15：ccagtgctacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcc；

x5523-16：tcttgcgtttatcggtctggtgggagttgatgtcgttggt；

x5523-17：agaccgataaacgcaagacctgcatgtacggcggcgtgac；

x5523-18：ttgtccagctggttgccgttgtgttcggtcacgccgccgt；

x5523-19：gcaaccagctggacaaataccgcagcatcaccgtgcgcgt；

x5523-20：tcagcaggtttttgccgtcctcgaacacgcgcacggtgat；

x5523-21：cggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaag；

x5523-22：gttcctgcgcggtcacttttttcttgttggtctgcacatc；

x5523-23：tgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacct；

x5523-24：cgtacagttttttgtttttcaccaggtagtgacgggtcag；

x5523-25：gtgaaaaacaaaaaactgtacgagttcaacaactccccgt；

x5523-26：gaacttgatgtagccggtttcgtacggggagttgttgaac；

x5523-27：accggctacatcaagttcatcgaaaacgaaaacagcttct；

x5523-28：cgccggcatcatgtcgtaccagaagctgttttcgttttcg；

x5523-29：gacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtcca；

x5523-30：tcgttgtacatcatcaggtacttggactggtcgaacttgt；

x5523-31：tacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagca；

x5523-32：acacttcgattttcacgtctttgctgtcaaccattttgtt；

x5523-33：gacgtgaaaatcgaagtgtacctgaccaccaaaaagaaat；

x5523-34：gtgtcctcgagtcattatttctttttggtggtcagg；

第一轮pcr程序为：95℃3min；95℃22sec，55℃20sec，72℃30sec，20cyc；72℃5min；

(2)以第一轮pcr的pcr产物为模板，进行第二轮pcr，得到编码重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的基因序列(或直接由合成公司合成得到优化后序列)，其中，反应体系(50μl)为：

第二轮pcr程序：95℃3min；95℃22sec，58℃20sec，72℃30sec，24cyc；72℃5min；

(3)将载体pet-32a进行双酶切，酶切体系(50μl)为：pet-32a1μg；10×fdbuffer5μl；kpni1μl(10u/μl)；xhoi1μl(10u/μl)；ddh2o补足50μl；37℃恒温水浴锅中反应2h；

(4)将步骤(2)扩增得到的pcr产物(图1)回收纯化，然后与步骤(3)酶切后的载体(图2)连接；其中，连接体系(20μl)为：无缝克隆酶mix8.5μl；目的片段：5μl；酶切载体2μl；ddh2o补充至20μl。50℃pcr仪反应1h。

(5)将步骤(4)制得的连接产物转化top10感受态，酶切检测筛选出阳性克隆(图3)，提取质粒pet32a-seb并进行测序，测序结果如下所示(横线+斜体为kpni和xhoi酶切位点)：

带his蛋白标签的重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的氨基酸序列如下所示：

msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtenlyfqgesqpdpkpdelhksskftglmenmkvlyddnhvsainvksidqflyfdliysikdtklgnydnvrvefknkdladkykdkyvdvfganyyyqcyfskktndinshqtdkrktcmyggvtehngnqldkyrsitvrvfedgknllsfdvqtnkkkvtaqeldyltrhylvknkklyefnnspyetgyikfienensfwydmmpapgdkfdqskylmmyndnkmvdskdvkievylttkkk

去his蛋白标签的重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白，其氨基酸序列如下所示：

enlyfqgesqpdpkpdelhksskftglmenmkvlyddnhvsainvksidqflyfdliysikdtklgnydnvrvefknkdladkykdkyvdvfganyyyqcyfskktndinshqtdkrktcmyggvtehngnqldkyrsitvrvfedgknllsfdvqtnkkkvtaqeldyltrhylvknkklyefnnspyetgyikfienensfwydmmpapgdkfdqskylmmyndnkmvdskdvkievylttkkk

实施例2表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株的构建

取1μl实施例1步骤(5)制得的重组质粒pet32a-seb转化bl21(de3)，42℃热击90s，冰上静置2min；然后涂布含有终浓度50μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板上，37℃培养过夜后，挑取单克隆提取质粒并进行测序验证，得到表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株。

实施例3重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的制备与纯化

一、小试培养选择最佳的诱导条件

(1)挑取实施例2中的表达重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白的菌株的单菌落于试管中加入3ml含有终浓度50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基37℃，220rpm过夜培养；

(2)将过夜培养的菌液按1:100体积比接种于4ml含有终浓度50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养；

(3)当od值达到0.6时，添加终浓度为0.5mm的iptg，220rpm，进行如下处理：20℃诱导过夜或37℃诱导4h，未加iptg诱导剂的作为阴性对照。

(4)4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μlpbs(ph7.4)缓冲液洗涤悬浮，冰浴中超声破碎菌体6min，功率400w，超0.5s停1.5s；分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μl包涵体溶解液(8murea，50mmtris-hcl，300mmnacl，ph8.0)溶解，分别取40μl样品和10μl5×proteinloadingbuffer混匀，沸水浴10min，sds-page检测。

检测结果如图4所示，37℃诱导4h条件最佳。

二、大量培养与蛋白纯化

(1)如小试培养步骤(2)和(3)所示，培养菌液，然后将培养的菌液按1:100体积比接种于4l含有终浓度50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养；当od值达到0.6时，添加终浓度为0.5mmiptg，37℃，220rpm，4h诱导，离心收集细胞菌体；

(2)超声破碎菌体(控制内毒素)

①将收集的细菌菌体用破碎buffer(含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs缓冲液，ph7.4)洗涤悬浮，冰浴中超声破碎菌体，功率400w，20min(超声2s，暂停6s为一个循环)；

②超声完毕，15000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化；

(3)第一次镍琼脂糖亲和层析(控制内毒素)

①10mlni-ida装柱，用3倍柱床体积的bindingbuffer1(含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs缓冲液，ph7.4)清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②细菌破碎上清上柱，流速为2ml/min，收集穿透液a；

③5倍柱床体积的bindingbuffer1清洗柱子，流速3ml/min；

④washbuffer1(含20mmimidazole的1×pbs缓冲液，ph7.4)洗杂，流速3ml/min，收集穿透液b即为纯化后的融合蛋白(蛋白大小为45.7kd)；

⑤washbuffer2(含50mmimidazole的1×pbs缓冲液，ph7.4)洗杂，流速3ml/min，收集穿透液c；

⑥elutionbuffer(含500mmimidazole的1×pbs缓冲液，ph7.4)洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液d；其中，图5为细菌破碎上清、穿透液a、穿透液b、穿透液c和洗脱液d的sds-page电泳检测结果。

(4)酶切去除蛋白标签

将(3)中收集的穿透液b在1×pbs缓冲液(ph7.4)中透析2h，然后向透析袋内加入tev酶，25℃酶切过夜去除标签；

(5)第二次镍琼脂糖亲和层析

①取5mlni-ida装柱，用3倍柱床体积的bindingbuffer2(1×pbs缓冲液，ph7.4)清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②将步骤(4)酶切后的穿透液b上柱，流速为2ml/min，收集穿透液e；

③2倍柱床体积的bindingbuffer2清洗柱子，流速3ml/min；

④washbuffer1(含20mmimidazole的1×pbs缓冲液，ph7.4)洗杂，流速3ml/min，收集穿透液f；

⑤elutionbuffer(含500mmimidazole的1×pbs缓冲液，ph7.4)洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液g；其中，图6为酶切前的穿透液b、酶切后的穿透液b、穿透液e、穿透液f和洗脱液g的sds-page电泳检测结果。

(6)将步骤(5)收集得到的穿透液e经过0.22μmca滤膜过滤，得到金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白(去标签的目的蛋白，蛋白大小为28.4kd)，其中，图7为该蛋白的sds-page电泳检测结果图。

将步骤(3)制得的纯化后的融合蛋白(穿透液b)和步骤(6)制得的去标签的目的蛋白进行westernblot分析，其中，一抗是兔抗his标签(sangonbiotech，编号：d110002)，二抗为羊抗兔(sangonbiotech，编号：d110058)；结果如图8所示，图8泳道2没有条带证明蛋白标签去除干净。

采用sk3071非干扰型蛋白定量试剂盒测定去标签后的目的蛋白的浓度(待测样品体积为10μl)，根据图9和表1所测蛋白吸收值可知，目的蛋白浓度为2.01mg/ml。

表1蛋白量和对应测量的480nm波长处的吸收值

本发明质粒构建耗时10个工作日；表达检测耗时5个工作日；表达纯化及检测耗时10个工作日。耗时短，操作简单，成本低，制得的金黄色葡萄球菌b型肠毒素(seb)蛋白纯度高，活性好。可进一步分装500μl/tube，-80℃保存，或冻干；冻干后的金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白用于实施例4～6制备软膏。

实施例4

一种含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏，包含如下按质量百分比计的组分：

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的制备方法，包含如下步骤：

(1)将摩擦剂、保湿剂、增稠剂、甜味剂、缓冲剂、植酸钠、单氟磷酸钙和水混合均匀，得到得到膏体1；

(2)在步骤(1)制得的膏体1中加入seb蛋白和虾青素，混合均匀，得到膏体2；

(3)在步骤(2)制得的膏体2中加入剩余组分(香料和发泡剂)，混合均匀，得到膏体3；

(4)膏体3抽真空，得到含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏。

实施例5

一种含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏，包含如下按质量百分比计的组分：

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的制备方法，包含如下步骤：

(1)将摩擦剂、保湿剂、增稠剂、甜味剂、缓冲剂、植酸钠、单氟磷酸钙和水混合均匀，得到得到膏体1；

(2)在步骤(1)制得的膏体1中加入seb蛋白和虾青素，混合均匀，得到膏体2；

(3)在步骤(2)制得的膏体2中加入剩余组分(香料和发泡剂)，混合均匀，得到膏体3；

(4)膏体3抽真空，得到含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏。

实施例6

一种含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏，包含如下按质量百分比计的组分：

所述的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的制备方法，包含如下步骤：

(1)将摩擦剂、保湿剂、增稠剂、甜味剂、缓冲剂、植酸钠、单氟磷酸钙和水混合均匀，得到得到膏体1；

(2)在步骤(1)制得的膏体1中加入seb蛋白和虾青素，混合均匀，得到膏体2；

(3)在步骤(2)制得的膏体2中加入剩余组分(香料和发泡剂)，混合均匀，得到膏体3；

(4)膏体3抽真空，得到含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏。

对比实施例1(不含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素)

一种不含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏，包含如下按质量百分比计的组分：

所述的不含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏的制备方法，包含如下步骤：

(1)将摩擦剂、保湿剂、增稠剂、甜味剂、缓冲剂、植酸钠、单氟磷酸钙和水混合均匀，得到得到膏体1；

(2)在步骤(1)制得的膏体1中加入剩余组分(香料和发泡剂)，混合均匀，得到膏体2；

(3)膏体2抽真空，得到不含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏。

效果实施例

(1)软膏稳定性测试：将实施例4～6制得的软膏置于50℃条件下放置一周，然后再转移至-3℃条件下放置一周，重复操作7次，软膏稳定。

(2)软膏治疗效果评价

牙周炎病例患者，随机分为治疗组(实施例4～6)和对照组(对比实施例)。两组患者在年龄、性别、疾病严重程度等方面经统计学分析无显著性差异(p＜0.05)，具有可比性。

治疗方法

两组用药前均给予口腔常规全口洁治，充填龋洞，必要时可做龈瓣成形术和牙周夹板结扎固定术，治疗组在此基础上使用实施例4～6制备的软膏作为牙膏伴侣刷牙，将普通牙膏挤于牙刷上，将含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏挤于牙膏上(软膏用量为牙膏用量的20％)，每日刷牙2次，每次3min；对照组使用对比实施例制备的软膏作为牙膏伴侣刷牙(方法同上)，每日刷牙2次，每次3min。两组均以半个月为1个疗程，连续观察3个疗程，对其临床疗效进行对比分析。

疗效判定标准：显效：症状明显改善，牙龈外观正常，牙周充血、水肿、出血消退或较前缓解，牙周袋消失或部分消失，牙齿有轻微松动；有效：症状缓解，外观基本正常，牙周充血、水肿、出血缓解，牙齿仍松动；无效：治疗前后无变化。总有效率＝(显效+有效)/n×100％。

结果如表2所示，与对比实施例相比，含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏作为牙膏伴侣对牙周炎具有显著的治疗效果。其中，图10是使用实施例4制得的含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏一周后的治疗效果图，可以看出症状明显改善，牙龈外观正常，牙周充血、水肿、出血消退或较前缓解。

表2实施例4～6制得的软膏治疗牙周炎效果评价

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>曾庆明

<120>含金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白和虾青素的软膏及制备与应用

<160>36

<170>siposequencelisting1.0

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