用于利什曼病的重组病毒载体和疫苗组合物的制作方法

本申请是申请日为2009年1月16日、发明名称为“用于利什曼病的重组病毒载体和疫苗组合物”的发明专利申请no.200980105562.x的分案申请。

本发明涉及表达利什曼原虫(leishmania)a2抗原的重组病毒载体的构建。此外，本发明涉及用作抵抗利什曼病的疫苗的疫苗组合物。本发明还描述了一种初免-加强(prime-boost)疫苗接种的方法，其使用重组腺病毒和痘病毒来免疫哺乳动物以抵抗利什曼病。该方法还允许通过elisa或间接免疫荧光诊断方法通过使用获自利什曼原虫的前鞭毛体形式的抗原对经疫苗接种的个体和被感染的个体进行血清学区分。

术语利什曼病是指一组寄生虫疾病，其临床表现为例如皮肤或皮肤粘膜的损伤或内脏病症，其为多种属于利什曼原虫属的原生动物寄生虫种的感染所致(worldhealthorganization.programforthesurveillanceandcontrolofleishmaniasis.http://who.int/emc/diseases/leish/index.html.2005)。作为一组疾病，利什曼病是88个国家的地区性疾病。在这些国家中，有72个是欠发达国家，在这一组中还包括13个具有最低的世界发展速度的国家(sundar,s.&rai,m.clin.diagn.lab.immunol.,9:2002)。

皮肤性利什曼病中涉及的主要致病物种是硕大利什曼原虫(l(leishmania.)major)、热带利什曼原虫(l.(l.)tropica)、埃塞俄比亚利什曼原虫(l.(l.)aethiopica)、墨西哥利什曼原虫(l.(l.)mexicana)、亚马逊利什曼原虫(l.(l.)amazonensis)、viannia亚属巴西利什曼原虫(l.(viannia)braziliensis)、巴拿马利什曼原虫(l.(v.)panamensis)、秘鲁利什曼原虫(l.(v.)peruviana)和圭亚那利什曼原虫(l.(v.)guyanensis)。与这些物种感染相关的症状是类似的，最初是在昆虫载体(沙蝇)叮咬处出现丘疹。在大约三个月内，损伤发展为溃疡，如新世界地区经常发生的。还可能发生散布的损伤和局部的淋巴结病，例如在巴西利什曼原虫引起的皮肤性利什曼病中。内脏利什曼病(vl)是由杜氏利什曼原虫(l.(l.)donovani)、婴儿利什曼原虫(l.(l.)infantum)和恰氏利什曼原虫(l.(l.)chagasi)(与婴儿利什曼原虫是同义词)引起的，如果不及时诊断并治疗的话，会成为致命的感染(murray,h.w.等人.lancet,366:1561-1577,2005)。亚马逊利什曼原虫最终可引起内脏利什曼病(wilson,m.e.等人.microb.pathog.,38:147-160,2005)。

被感染的狗，即使是无症状的，也会在皮肤下显示出大量的寄生虫，这会促进沙蝇载体的感染并作为可能保持向人类传播的贮存库(tesh,r.am.j.trop.med.hyg.52:287-292,1995)。

有两种药物优先被用于治疗利什曼病：五价锑(首选药物)和两性霉素b，其用于妊娠和50岁以上的老年患者。有两种含锑药物可用于治疗：n-甲基葡糖胺锑和葡萄糖酸锑钠。治疗由20-30天缓慢给予(优选静脉内给予)20mg锑/kg患者/天的剂量组成。给药后需要休息。副作用有关节痛、肌肉疼痛、厌食、恶心、呕吐，在更严重的情况下有肾脏和心脏的并发症，这需要治疗中断(ministériodasaúde.guiadeepidemiológica.2005,brasil)。

两性霉素b治疗需要患者住院，因为可能发生严重的变化。推荐的剂量是0.5mg两性霉素b/kg患者/天，持续14天，通过缓慢静脉内注射，与葡萄糖血清一起输注4-6小时。虽然两性霉素b具有极好的杀利什曼原虫活性，但是其对于血管内皮细胞具有高度毒性，经常导致各种副作用，例如发烧、厌食、恶心、呕吐、静脉炎、低钾血、肾功能不全、贫血、白血球减少症、和心脏变化。新的两性霉素b制剂减少了副作用，但是其高成本仍然阻碍了在发展中国家的常规医疗救助中的使用(ministériodasaúdefunasa.manualdecontroledaleishmaniosetegumentaramericana.2000)。

犬内脏利什曼病(cvl)的治疗，无论使用何种药物，均不是足够的或有效的疾病控制措施，因为其非常昂贵，而且即使是临床治愈的狗，除了抗性寄生虫株的选择的可能性增加之外，还仍然是载体感染和寄生虫传播的贮存库(gramiccia,m.&gradoni,l.int.j.parasitol.35:1169-1180,2005)。

这个事实，以及在无治疗的情况下人类vl的致命性，使得国际卫生组织(who)推荐消灭对于利什曼原虫抗原呈现血清反应阳性的狗，以此作为控制措施，这是由巴西卫生部采纳的做法。因此，最常用的控制vl的一种做法是杀死那些通过血清学检验或根据cvl的临床症状的存在而被检测为血清反应阳性的狗。但是，除了其它困难，例如诊断和处死之间的延迟之外，该程序引起宠物主人的严重悲伤和愤怒，有时候他们宁愿不对他们的动物进行诊断，直至动物死去，从而这些动物同时成为寄生虫的重要的贮存库(tesh,r.am.j.trop.med.hyg.52:287-292,1995)。在这种情况下，疫苗将是改善疾病控制效率的替代性工具。

集中于疫苗开发的多数研究都是基于鉴定寄生虫分子或能够诱导th1细胞免疫反应的免疫方案，th1细胞免疫反应对于诱导抵抗利什曼病的保护是必不可少的。

在小鼠中，抵抗内脏利什曼病种类例如杜氏利什曼原虫抗性的获得依赖于th1反应的诱导。该抗性由激活巨噬细胞和t细胞的细胞因子，例如白细胞介素12(il-12)和干扰素-γ(ifn-γ)介导。这些细胞因子启动并诱导th1细胞免疫反应，引起组织肉芽肿的产生，其中包容有细胞内寄生虫并被ifn-γ激活的单核的吞噬细胞消灭(murrayh.w.等人.infectionandimmunity.70:6284-6293,2002)。

在抗性小鼠中，寄生虫仍然被禁锢在感染位点及周围淋巴结中。响应于无鞭毛体和内源激动剂例如cd40l和ifn-γ的积累，树突状细胞被激活，增加了cd40和其它共刺激分子的表达并产生il-12。在该环境下t细胞的激活引起th1细胞表型，其特征在于效应cd4+t细胞的产生，效应cd4+t细胞产生高水平的ifn-γ和肿瘤坏死因子(tnf)。这些细胞因子促成一氧化氮(no)合成酶基因(inos)的激活，其引起巨噬细胞杀微生物活性的增加。cd8+t细胞也通过产生ifn-γ并通过表现细胞毒活性(可能是通过fas-fas配体(fasl)机制)而参与感染的控制。在损害消除之后，少量的无鞭毛体仍然留在感染位点，这可能是由于分泌il-10的调节性t细胞的存在所致(sacksd.&noben-trauthn.nat.revimmunol.2:845-858,2002)。调节反应似乎是极其重要的，因为它们能够加剧炎性反应并加重损害(murrayh.w.等人.lancet.366:1561-1577,2005)。寄生虫的持续存在还与能够削弱疾病重新激活的cd4+t细胞群体的维持有关(gollobk.j.等人.trendsparasitol.21:347-350,2005)。

在狗中，对疾病的抗性或易感性还很可能与th1细胞反应相关。抗性与增加的特异性淋巴增殖和阳性延迟型超敏反应(dth)相关，同时具有低抗体效价。在狗中，对感染和保护的抗性还与ifn-γ和no的产生增加和巨噬细胞的杀利什曼原虫活性相关，所有这些机制都包括经典的th1免疫反应。此外，igg1抗体的水平增加与易感性相关，而igg2a水平的增加与抗性相关(moreno,j.&alvar,j.trendsparasitol.18:399-405,2002；molano,i.等人.,vet.immunol.immunopathol.92:1-13,2003)。

在人类中，对于针对利什曼原虫的免疫反应的描绘不如在实验模型中那么透彻。但是，已经知道在th1免疫反应的发展和对感染的抗性之间有直接的关联。一般地，产生ifn-γ的细胞在进展为治愈的情况下占主导，而具有丰富的il-4和il-10的细胞因子的th1和th2混合模式存在于活性皮肤疾病中(colerr.n.&reeds.g.trendsparasitol.21:244-249,2005)。一些由巴西利什曼原虫引起的皮肤粘膜疾病与强烈的细胞反应和ifn-γ、tnf和il-10的相伴表达相关(rogersk.a.等人.femsmicrobiollett.209:1-7,2002)。在人类vl中，il-10和il-4在患有活性疾病的患者中占主导，而ifn-γ的产生对于针对化疗的反应是必不可少。

在所有可获得的实验模型中，非人灵长类(猴子、babuins,mandrils等)被认为是与人类最接近的物种。亚洲恒河猴(macacamulatta)对于各种利什曼原虫种的感染是高度敏感的，它们产生与人类中观察到的类似的疾病模式，产生抗利什曼原虫抗体和t细胞介导的寄生虫特异性细胞免疫反应，当被疫苗接种刺激时，所述细胞免疫反应似乎能有效保护它们抵抗感染。因此，在猴子中进行的研究结果可用于指导用于人类的疫苗的设计。例如，作为猿免疫缺陷病毒(siv)感染模型的猴子已经被广泛用于在进行人类临床试验之前测试疫苗和新的治疗策略(porrozzir.等人,rsoctropmedhyg100:926-937,2006.porrozzir.等人.amjtropmedhyg71:297-305,2004.grimaldi,g.meminstoswaldocruz.103:629-644,2008)。

由于th1型免疫反应对于抵抗利什曼原虫感染是必不可少的，所以诱导这种类型的反应的佐剂和抗原表达系统对于开发有效疫苗是必需的。另一方面，由于巨噬细胞激活而产生氧和氮的毒性代谢物以消除细胞内无鞭毛体，所以化疗功效和利什曼原虫感染的治愈也需要这种类型的反应(fernandes,ap等人.,2002；schriefera,et.alcurropininfectdis.5:483-488,2008)。因此，免疫调节剂，例如白细胞介素(il-12和gm-csf)(fernandesap,等人.jinfectdis.183:1646-1652,2001；schriefer等人.,2008)和imiquimod(aldara,3m),用于局部治疗生殖器疱疹损伤的咪唑喹啉，能够刺激激活巨噬细胞的免疫反应，从而促成杀利什曼原虫活性和化疗效应的改善。因此，免疫治疗已经成为利什曼病治疗的治疗选择。除了免疫调节剂之外，使用包含诱导th1免疫反应的利什曼原虫抗原的疫苗进行的测试已经证明：这些疫苗不仅具有预防效应，而且具有治疗效应(miret等人.vaccine.17:1585-1594,2008；santosfn,等人.vaccine.14:6176-6190,2007；bhowmicks.等人.vaccine.29:6544-6556,2007)。不仅在实验模型中，而且已经在狗和人类临床试验中结合锑或其它药物证明了该活性(fernandes等人.,2001；miranda-verasteguic.clininfectdis.40:1395-1403,2005；miretj.等人.vaccine.17:1585-1594,2008)。

针对cvl的疫苗候选物是难以开发的，因此仍然十分稀少。目前有一种针对cvl的疫苗可供利用：该疫苗使用由前鞭毛体纯化而来的抗原性复合物作为活性成分，其中包含蛋白和碳水化合物，所述复合物对应于所谓的岩藻糖-甘露糖配体(fml)复合物，其存在于寄生虫表面，如巴西专利申请号pi9302386-3中所记载(含有利什曼原虫细胞组分的组合物，其被命名为fml抗原“岩藻糖-甘露糖配体”，fml抗原及其亚组分和成分在应用于人类或犬内脏利什曼病的特异性免疫诊断中的用途，在应用于人类或犬内脏利什曼病的疫苗接种、治疗或免疫治疗中的用途)。

具有以下主要特征：诱导体液反应。因此，经疫苗接种的狗通过产生寄生虫特异性抗体的方式对疫苗剂量产生迅速反应。参与开发所述疫苗的作者展示的结果证明：在流行区域保护大约86％的经疫苗接种的狗。这些研究的数据受到科学界以及工业界和卫生部门的质疑，这是由于以下事实：除了其它失败之外，他们使用了灌注了杀虫剂的项圈和样本容量较小。由于寄生虫通过昆虫载体的叮咬传播，所以其传播可能由于狗的原因(较少暴露)而受到这样的抗性项圈的使用的影响。基于这些原因，对报道的保护功效受到质疑，公共卫生机构要求进行另外的研究。

关于公共健康，已知的是根据who的推荐，血清学阳性的狗应该被处死。巴西卫生部采纳了这个控制措施。但是，一旦狗经过疫苗接种，它将产生针对寄生虫的高特异性抗体效价，成为血清学阳性的。巴西公共卫生机构使用的筛选被感染狗的诊断检测使用前鞭毛体抗原，因为前鞭毛体抗原便宜且容易操作，在所有乡村区域应用起来很容易。因此，根据巴西公共卫生机构采用的诊断测试和法律控制措施，血清学阳性的疫苗接种的狗将被处死，即使它们未被感染。

所用的血清学测试无法区分经疫苗接种的动物和被感染的动物，这给公共卫生机构带来了一个巨大的问题。即使主人能够通过他们的疫苗接种证明来确证他们的动物经过了疫苗接种，动物仍然会被处死。这么做是由于统计表明100只狗中有14只仍然可能被感染，增加了利什曼病的可能的“隐藏”家庭来源的比例。

另一个重要项目涉及巴西卫生部进行的犬流行病学调查，其对于监控该疾病在该国不同区域的流行病学是一种重要工具。

这些调查至少部分基于犬血清学测试的结果。由于疫苗接种的出现，这些调查中获得的结果可能不对应于狗中感染的真实流行程度，或者不对应于在以前未发生过利什曼病的区域中该病的引入，因为血清学阳性的动物可能是针对利什曼原虫进行疫苗接种的结果，而非感染利什曼原虫的结果。虽然可以通过能够检测寄生虫痕迹的检验法(例如pcr和免疫细胞化学)将血清学阳性的经疫苗接种的狗与被感染的狗区分开，但是这些检验法需要专业知识、昂贵的设备和材料以确保高度真实的结果。特别地，pcr仅在私人诊所进行，由于高昂的经济成本，其难以在公共卫生中得到应用。

除了已经提及的不利因素外，还具有高的生产成本，导致其市场价格对于绝大多数民众是难以接受的。众所周知，很大一部分巴西民众收入水平较低，不能获得所述产品。此外，该疫苗在公共健康活动中的可能应用对于国家将是很高的成本。另外，还出现了与假阳性诊断相关的问题，这使得疫苗接种与目前应用的控制措施冲突。这将导致处死假血清学阳性的狗，从而改变流行病学调查。

因此，鉴于利什曼病在该国家的很多地方是并代表扩展的疾病，采纳有效且可行的措施以阻断寄生虫传播，尤其是生活在室内及其周围的家养狗只的感染变得日益重要。

初免和加强方案能够引发能够产生抗体的记忆b细胞，以及记忆cd4+t和cd8+t细胞。因此，其应用有利于开发旨在控制细胞内病原体的疫苗(ferraz,jc.；等人.,infectionandimmunity,72:6945-6950,2004)。抗体负责中和病原体、阻止细胞感染，而t细胞负责破坏感染了能够规避体液反应的病原体的细胞。

初免和加强方案可以是同源的(当在两个免疫中使用相同载体时)或异源的。使用同源初免和加强方案是有争议的，主要是因为以下事实：在初次免疫后针对载体引发的免疫反应能够在连续免疫中消除该相同的载体。但是，以单一剂量的表达刚地弓形虫(toxoplasmagondii)抗原的重组腺病毒进行的免疫在小鼠中不引发igg产生。为了产生有效的针对该寄生虫的体液免疫反应，同源加强是必要的。加强免疫也引发刚地弓形虫抗原特异性的产生ifnγ的t细胞的激活(caetanobc,等人.humgenether.17(4):415-426,2006)。

在异源初免-加强方案中，在每剂中使用不同的载体，这导致更有效地诱导针对重组载体所编码的抗原的特异性cd8+t细胞(ramshawia,ramsayaj.immunoltoday.21(4):163-5,2000)。

很多应用初免-加强方案的实验显示出在以病毒载体免疫之后产生记忆细胞的高效率(-romeroo,等人.procnatlacadsciusa.98(20):11491-11496,2001.miyahiray,等人.infectimmun.73(11):7356-7365,2005)。

重组腺病毒的使用可能适合于开发针对利什曼原虫的疫苗，这是由于其在被感染细胞中诱导1型细胞因子的能力较强。用作载体的重组腺病毒是这样获得的：缺失其基因组的特定区域以允许插入转基因，但不额外增加病毒基因组，将其保持在病毒粒包装的限度内(russel,j.gen.virol.81:2573-2604,2000)。

在所谓的初次产生腺病毒载体过程中，缺失了区域e1和/或e3，以允许插入多达7kb的转基因。由于区域e1含有编码区域e2的转录激活必需的蛋白以及其它负责基因组复制的蛋白的基因，所以其缺失导致腺病毒成为复制缺陷型的。e1δ载体的增殖在体外进行，其中使用含有区域e1的转基因细胞，其反式提供该产物以互补病毒。复制缺陷型的腺病毒能够正确表达转基因，因此能够在宿主中引发免疫反应。但是，它们不能从一个个体传播到另一个个体。这使得其使用是安全的，消除了在环境中散播遗传修饰的生物体的风险(babiuk&tikoo,j.biotechnol.83:105-113,2000)。

腺病毒基因组最初作为游离体dna表达，因为其整合到染色体中的能力是很低的。因此，随着时间的进行，病毒基因组被从宿主细胞中消除掉。如果考虑到整合进入细胞宿主dna可能引起例如原癌基因的破坏的话，该特性是有利的(ushevaa,shenkt.procnatlacadsciusa.93(24):13571-13576,1996)。另外，瞬时表达似乎对于针对转基因蛋白的免疫反应的动力学或强度没有影响，也不干扰疫苗接种方案。

腺病毒引发细胞免疫反应，其特征在于针对靶细胞的cd8+t淋巴细胞的细胞毒作用。重组腺病毒编码的蛋白是通过使用宿主细胞机制表达的。然后，它们被蛋白酶体加工成小肽。然后，这些肽进入内质网腔，在那里它们将被装载进入i类mhc分子以在细胞表面呈递至cd8+t淋巴细胞(york&rock,ann.rev.immunol.14:397-440,1996)。

腺病毒产品还通过ii类mhc由专职抗原呈递细胞(apc)进行呈递，例如直接被腺病毒感染的树突状细胞或摄取由邻近的感染细胞产生的抗原的树突状细胞(sarukhan等人.,j.virol.75:269-277,2001)。经细胞吞噬的抗原通过内体/溶酶体处理进入，加工后产生的肽结合至ii类mhc分子，从糙面内质网被转移到胞吐泡中的内涵体腔室。肽还可以结合至已经呈递在细胞表面上的再循环的ii类mhc分子(creswell,annu.rev.immunol.12:259-293,1994)。ii类mhc腺病毒抗原呈递引起t辅助1cd4+淋巴细胞的激活，其加强针对转基因产物的免疫反应，因为它们产生il-2和ifn-γ，这两种细胞因子均激活细胞毒性t淋巴细胞和巨噬细胞，使靶细胞敏感化从而引起i类mhc分子的表达增加，并激活b淋巴细胞以产生抗体(yang等人.,j.virol.69:2004-2015,1995)。针对腺病毒的保护性免疫反应的发展非常类似于那些针对细胞内原生动物(例如利什曼原虫)的保护性免疫反应的发展，其有利于使用重组腺病毒以引发针对该寄生虫的保护性免疫反应。

表达转基因的重组痘病毒也是疫苗开发中的重要工具。由于其基因组较大，所以痘病毒能够携带大的外源dna片断。此外，痘病毒对其基因表达具有精确的控制并且不能在宿主细胞基因组中整合。但是，它们能够在宿主中引发体液和细胞免疫反应(jc,等人.jvirol.74(16):7651-7655,2000)。另一个重要的问题是在体外产生这些疫苗载体相对简单。

当使用重组病毒载体时，一旦病毒能够感染人类细胞，可能引起不想要的副作用的话，则总是有安全方面的担忧。当使用复制缺陷型的痘病毒例如改良的安卡拉病毒(mva)时，消除了这些担忧(drexler,i,staib,c,sutter,g.curropinbiotechnol.15(6):506-512,2004)。

mva是一种非复制型的高度减毒的痘苗病毒，其是通过在鸡胚成纤维细胞(cef)中进行连续传代获得的。在减毒过程中，缺失了包含15％的亲代病毒基因组的病毒基因。这种丧失包括编码参与病毒生命循环的蛋白以及宿主免疫系统的免疫调节的蛋白的基因，从而限制了其毒性(hodge,jw,等人.cancerres.63(22):7942-7949,2003)。至于病毒生命循环，该缺失破坏了病毒形态发生的最后步骤，但是，既不引起早期也不引起晚期基因表达步骤的改变(jc,等人.jvirol.74(16):7651-7655,2000)。

在德国和土耳其进行的天花根除活动的较晚阶段，向接近120,000个个体施用了mva，没有观察到副作用。即使在使用免疫受损动物和处于风险群体中的人类进行的实验中，也显示mva是无毒性的且不能产生感染性病毒颗粒(jc,等人.jvirol.74(16):7651-7655,2000)。由于其被证明的安全性，mva成为临床前和临床免疫检验中的病毒选择。

有报道显示：mva可用于没有预先存在的针对该病毒的免疫力的动物中，以及以前接触过mva的动物中。在第一种情况下，单剂的疫苗即足够，因为针对载体引发的免疫反应可以激发产生针对目标病原体的强烈的免疫反应。在第二种情况下，可以施用两个疫苗剂量(同源初免-加强)以克服载体中和的问题，因为只有在第三剂之后观察到针对转基因产品的免疫反应的显著下降(hodge,jw,等人.cancerres.63(22):7942-7949,2003)。但是，在第二种情况下，异源初免-加强可能是优选的(vuolaet.al.jimmunol.174:449-455,2005)。

经过工程化改造的重组mva正被实验性地用于抵抗各种病因，例如肺结核(mcshane,et.al.infectimmun69(2):681-686,2001)、hiv(hanke,t.,et.al.immnol.lett.66:177-181,1999)、埃博拉病毒(sullivan,n.j.,et.al.nature.408:605-609,2000)，其在小鼠和人类中具有高度免疫原性，能够产生强烈的cd4⁺和cd8⁺t细胞免疫反应(vuolaet.al.jimmunol.174:449-455,2005)。

charest&matlashewski(mol.cell.biol.:14,1994)首次描述了来自杜氏利什曼原虫的无鞭毛体cdna文库的杜氏利什曼原虫种a2抗原。多个拷贝的a2基因被归在杜氏利什曼原虫的染色体22(850kb)组中，这些基因在以下种中是保守的：杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、恰氏利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫(ghedin等人.,clin.diagn.lab.immunol.:4,1997)。

以前在专利数据库中进行的检索发现了涉及a2蛋白作为利什曼病疫苗接种的药剂的用途的申请。因此，美国专利号5,733,778描述了a2基因的核苷酸序列并要求保护其在微生物宿主中的表达。

美国专利申请号5,780,591描述了天然a2蛋白，或者它是如何在寄生虫中被发现的，以及其作为抗原用于疫苗接种或诊断的用途。美国专利5,733,778描述了a2基因的dna序列及其在细菌中的表达。美国专利申请6,133,017描述了如何通过缺失a2基因获得减毒的寄生虫(杜氏利什曼原虫)及其作为减毒疫苗的用途。同样，专利wo9506729、ep0716697和mxpa03008832涉及a2蛋白作为重组蛋白、dna的用途，或就其作为疫苗的用途产生减毒的寄生虫。

在巴西，inpi专利申请pi0208532-1(pct号ca0200437)以通用名“利什曼原虫疫苗”描述了dna疫苗(其中抗原性成分是a2抗原)以及使用该疫苗的方案的发明。该申请被永久存档。

发明名称为“使用a2抗原针对犬内脏利什曼病的重组疫苗的方法”的专利申请pi06030490允许对被感染的和经疫苗接种的动物进行血清学区分，其涉及使用a2重组蛋白和作为佐剂的皂素的疫苗，并且允许通过elisa或免疫荧光测试进行血清学区分。

支持以前的疫苗的专利申请的实验证据主要由两个疫苗接种研究组成(ghosh等人.vaccine:19,2001；ghosh等人.,vaccine:20,2002)，其中使用a2抗原作为重组蛋白与作为佐剂的小型棒状杆菌(corynebacteriumparvum)联合，或作为pcdna3/e6质粒中的dna形式来评价实验模型(小鼠)。根据这些研究，经过a2抗原免疫和杜氏利什曼原虫刺激的动物显示出肝脏中寄生虫率的显著下降(以ldu评估)和a2蛋白特异性的ifn-γ和igg2a抗体的生成增加。虽然以a2进行疫苗接种引发了保护，但是，当与pcdna3/e6质粒联合时更加显著。虽然在动物实验模型中测试是进行疫苗验证的必需步骤，但是其本身不能认为是结论性的，即使其显示阳性结果。

用于保护狗的有效疫苗的开发以及由此产生的向人类散播速率的下降对于利什曼病的控制具有高度相关性。在巴西，健康和农业部门根据其规则(mapa-insnormativainterministerialno.31fromjuly9^th,2007-www.mapa.gov.br)提倡该疫苗一旦在狗中应用，肯定能够诱导免疫反应，有效减少组织寄生虫病和寄生虫向昆虫载体的传播，这可以通过异体接种诊断法、pcr分析或免疫组化进行确认。此外，该疫苗允许使用低成本方法对被感染的和经疫苗接种的狗进行血清学区分，所述方法在国家公共卫生系统中已经具备，不需要迫使改变已经存在的控制措施。

为了解决这个问题，本发明提供了一种使用腺病毒和痘病毒载体进行初免-加强疫苗接种以在哺乳动物中诱导抵抗利什曼病的免疫力的方法。该方法允许使用利什曼原虫前鞭毛体抗原通过进行低成本的elisa或常规免疫荧光检测而对被感染的和经疫苗接种的狗进行血清学区分。此外，本发明涉及可用于抵抗利什曼病的疫苗组合物。

本发明中出现的所有科学论文或专利文献均作为参考文献引入。一般应理解，专家可使用很多技术以使本发明的程序具体化。

将在以下实施例中详细描述本发明。重要的是注意：实施例不限制本发明的本质，相反，在另一方面，实施例解释并帮助理解技术。

实施例1-在穿梭载体padcmvlink1中克隆a2基因

为了选择经过a2基因转化的细菌克隆，按照图1a所示，以核酸内切酶xhoi(其切割padcmvlink1)进行pad-a2构建体的最初消化。结果显示大约1.8kb的带(图1b)。这是预期的长度，其中消化后在a2基因中加入了载体的～200pb。

为了确认a2基因是否正常表达，我们以hek293a细胞和pad-a2进行了转染实验，以转染的细胞和针对a2蛋白的单克隆抗体进行了western印迹。图1c显示在pad-a2转染的细胞提取物中的大约53kda的带，其与pcdna3-a2转染的细胞提取物中的a2带匹配，在以空质粒转染的细胞提取物中不存在此带。观察到只有pad-a2构建体的克隆3正确表达了a2。

实施例2-编码a2蛋白的非复制型腺病毒的产生

通过共转染进入e1-转基因/hek293a允许细胞的pad-a2、克隆3和携带非复制型δe1腺病毒5型基因组的质粒pjm17之间的细胞内同源重组来产生编码a2蛋白的重组腺病毒(ada2)。使用抗-a2单克隆抗体通过western印迹检测ada2感染的细胞中a2的表达。在感染的细胞提取物中检测到多种形式的ra2，其分子量在53kda以下(图2)。该实验还表明在以ada2感染的细胞中蛋白的表达水平高于以pad-a2或pcdna3-a2感染的细胞。产生的载体含有seqidno:01。

实施例3-在穿梭载体plw44中克隆a2基因以产生重组mva

使用核酸内切酶xbai和hindiii将a2基因从其原始质粒中切割下来并克隆进入载体plw44的smai位点，将其破坏。为了选择在plw44中具有a2基因的克隆，以核酸内切酶xbai消化所产生的构建体，并观察条带的模式。在存在a2的情况下，预期有1200kb的带；以及在两种情况下，预期有3800kb的带(图3)。

为了确认a2基因能否正常表达，以西方痘苗病毒感染vero细胞并以plw44-a2进行共转染。以细胞提取物进行western印迹。结果显示在感染和转染的细胞提取物中有大约53kda的带，该带与使用pcdna3-a2转染的细胞中的a2匹配，在非转染的细胞提取物中不存在此带(图4)。还观察到克隆11和18诱导更多的a2产生，而克隆1、10、12、20、21、22和23不能诱导a2的产生。

实施例4-编码a2蛋白的mva的产生

通过plw44-a2质粒、克隆18(其含有侧翼为病毒dna的同源区域的表达盒)和西方mva的同源重组进行具有a2基因的重组mva(mva-a2)的构建。表达盒具有痘苗病毒的两个启动子：决定a2基因转录的p11和决定gfp蛋白基因转录的mh5。

使用抗-a2单克隆抗体通过对感染的细胞提取物中进行western印迹确认了mva-a2表达a2(图5)。该实验还证明：未感染的细胞不能产生a2，腺病毒a2能够以较高水平表达该蛋白。产生的病毒载体含有seqidno:01。

实施例5-通过使用表达a2的重组腺病毒进行免疫接种诱导的细胞免疫反应

为了评价重组腺病毒引发的免疫反应，我们在elispot中评价了balb/c小鼠的脾细胞中ifn-γ的产生。以a2抗原(重组蛋白的形式或表达a2的质粒的形式)或表达a2的腺病毒免疫小鼠。另外以亚马逊利什曼原虫感染一组小鼠。源自a2的肽能够特异性地刺激ada2感染的动物的t细胞产生ifn-γ(p<0.05)，但是以a2免疫的动物的t细胞不能(图6)。

在a2-蛋白或质粒免疫的动物中检测不到ifn-γ反应，这提示了通过使用的免疫方案产生的免疫反应虽然足以诱导部分保护，但是不足以允许通过elispot检验检测和定量大量的ifn-γ产生细胞。该发现在以前的文献中曾经记载过，可以通过以下事实解释：可以使用重组蛋白或dna(与表达抗原的病毒载体联合，如下所述)通过初免-加强方案来加强保护水平以及细胞免疫反应水平。

为了验证细胞免疫反应的诱导，我们在elispot中使用了以ada2免疫1或3周之后的balb/c小鼠的脾细胞。作为对照，以对照腺病毒(adctrl)接种一组小鼠。以a20抗原呈递细胞(apc)加a2肽共培养脾细胞。刺激20个小时之后，定量测定产生ifn-γ的细胞。结果显示，免疫3周之后，在以源自a2的肽刺激之后，t细胞产生抗原特异性的ifn-γ反应(p<0.01)(图7a)。在另外的实验中获得了相似的结果，其中动物组以ada2免疫两次，或以dnaa2/ada2进行初免-加强方案(p/bhet)，证明了当以那些免疫原免疫动物时发生的细胞免疫反应的加强效应(图7b)。

实施例6-使用重组腺病毒的不同方案

使用表1中描述的不同的初免-加强方案免疫每组10只的雌性5-6周龄的balb/c小鼠。每只小鼠进行10⁹p.f.u.的腺病毒a2(ada2)皮下接种。在以pa2(dna)进行的免疫中，剂量是每只动物100μg，在pbs和50％蔗糖溶液中稀释，通过肌肉内注射施用。作为对照，以接受ada2的组的相同剂量用对照腺病毒(adctrl)或100μl盐水溶液(pbs)免疫动物组，二者均为皮下途径。在所有组中，给药间的间隔为6周。

表1：免疫方案中使用的动物组。i.d:皮内，i.m:肌肉内,s.c:皮下

实施例7-使用重组mva的不同免疫方案

使用表1中描述的不同的初免-加强方案免疫每组10只雌性5-6周龄的balb/c小鼠。mva的剂量为每只动物10⁷p.f.u.，通过皮内接种。在以pa2(dna)进行的免疫中，剂量是每只动物100μg，在pbs和50％蔗糖溶液中稀释，通过肌肉内注射施用。作为对照，以接受ada2或mva-a2的组的相同剂量用对照腺病毒(adctrl)或对照mva(mvactrl)或100μl盐水溶液(pbs)免疫动物组。给药间的间隔为4-6周，取决于用于初免免疫的载体。

实施例8-免疫方案的结果

为了验证所描述的初免-加强方案诱导的特异性细胞免疫反应，在加强之后2周收集免疫小鼠的脾细胞并用于elispot检验和体内细胞毒性检验中。

实施例9-在恒河猴中进行的免疫方案的结果

我们进行了实验以确认在猕猴中以重组病毒进行的免疫不引起有害效应(安全标准)，评价抗原特异性免疫反应(免疫原性)并确定其是否保护恒河猴抵抗婴儿利什曼原虫(恰氏利什曼原虫的同义词，其为拉丁美洲和欧洲的人类内脏利什曼病的病原体)的感染(有效性)。

为了达到这些目标，根据表2中描述的初免-加强方案免疫每组5只猴子。作为对照组的猴子，只接受盐水溶液(pbs)。对于以重组a2蛋白进行的免疫(ra1；第2组)，通过皮下注射施用100μgra2与2μg重组il-12(ril-12)和250μg明矾。每只动物在21天的间隔内接受3次给药。第4组的动物在21天的间隔内通过皮下注射接受2次给药，每次均为10¹⁰p.f.u.的表达a2的腺病毒5(rad5a2)，然后为21天的间隔内2次加强给药：每次通过皮下注射施用100μgra2加2μgril-12和250μg明矾。第6组的动物通过肌肉内注射接受2次2μg表达a2的质粒dna，然后是两次rad5a2，每次为10¹⁰p.f.u.，在21天的间隔内通过皮下注射施用。作为佐剂和特异性对照组，动物组接受2μgril-12加250μg明矾(第3组)或10¹⁰p.f.u./剂的表达克氏锥虫(trypanosomacruzi)的asp蛋白的腺病毒5(rad5asp)(第5组)或不含a2的质粒dna空载体(第3组)，其剂量对应于如上所述的实验组中所施用的。免疫之后，根据porrozzi等人.(2006)描述的程序，以1x10⁷婴儿利什曼原虫前鞭毛体刺激所有的猕猴。收集血清样品以进行抗体测定。我们还收集了肝脏活检样品以进行组织病理学分析并通过评价肉芽肿的形成和寄生虫定量来确定针对感染的反应。

表2-以a2抗原在恒河猴中进行初免-加强免疫的方案

^a以21天的间隔给予3次疫苗

^b以21天的间隔给予4次疫苗

^c通过肌肉内注射给予质粒dna

所有其它的疫苗均为通过皮下注射给予

rasp＝来自克氏锥虫的重组asp蛋白，用作特异性对照

通过表2中所列的任何免疫方案以a2抗原免疫的猴子均显示出对于寄生虫负荷和疾病进展的高度控制，这是通过肝脏肉芽肿的大小和肉芽肿中寄生虫数目来确定的(图9、10和11)。这种免疫力是特异性的，因为在接受pbs、对照重组蛋白、对照dna或对照病毒(阴性对照和特异性对照)的对照组中没有观察到相同的免疫力。在接受表达a2抗原的重组腺病毒载体(ada2)、然后接受ra2加ril-12免疫的猴子中，肝脏中肉芽肿的形成和寄生虫的消除(vaccine,20:592001；infectimmun71:3988,2003)比其它组发生得早(图11)。在这些动物中，在感染后的第8周可以观察到成熟肉芽肿以及缺乏寄生虫，而在第28周，可以检测到肝脏肉芽肿的消退和寄生虫的总的消除(图11)。同样，这些免疫方案能够在所有接受疫苗接种的猴子中诱导强烈的igg特异性抗a2抗体的产生。

总之，这些实验似乎是帮助描绘在人类中进行a2抗原临床测试的良好工具。

附图说明

图1-a2基因克隆进入padcmvlink1载体。“a”：简化的载体图，其显示了xhoi酶的切割位点和表达盒。“b”：pad-a2构建体消化。“c”：hek293细胞中进行载体转染之后的a2蛋白表达。克隆2表达该蛋白的截短形式。

图2-从利什曼原虫产生含有a2基因的重组腺病毒。使用a2单克隆抗体，通过western印迹测试以不同的重组病毒克隆感染的或者以编码a2蛋白的质粒转染的细胞的提取物。adctrl：以表达与利什曼原虫抗原不相关的蛋白的重组腺病毒感染的对照；ra2：a2重组蛋白。

图3-将a2蛋白克隆进入plw44穿梭载体。“a”：简化的空载体图，其显示了xhoi和smal酶的切割位点。“b”：插入a2编码序列之后的载体图。显示了xbai切割位点，mh5和p11痘苗病毒启动子和编码gfp和a2的表达盒(由以上启动子驱动)。“c”：获得的重组质粒克隆(plw44-a2)的消化。plw44用作阴性对照。所有的克隆均成对显示：其由一个消化的样品和一个未经消化的样品组成。

图4-从利什曼原虫属产生含有a2基因的重组mva。使用a2单克隆抗体，通过western印迹测试未经感染的或者以mva-a2感染的细胞的提取物。以表达a2蛋白的ada2病毒感染的细胞的提取物用作阳性对照。

图5-以表达利什曼原虫a2蛋白的重组腺病毒进行疫苗接种的动物中的细胞免疫反应。使用经单剂ada2进行疫苗接种的balb/c小鼠的脾细胞进行elispot检验的结果。“a”：使用小鼠免疫后1周收获的脾细胞进行的检验。“b”：使用小鼠免疫后3周收获的脾细胞进行的检验。a20：抗原呈递细胞。adctrl：以表达与利什曼原虫抗原不相关的蛋白的腺病毒免疫的动物。

图6-以表达a2基因的重组载体进行疫苗接种的动物中的细胞免疫反应。ada2：以表达利什曼原虫a2蛋白的重组腺病毒进行2次疫苗接种的动物。p/bhet：以含有a2基因的重组质粒进行1次免疫并以ada2进行1次加强的动物。pa2：以含有a2基因的重组质粒进行2次免疫的动物。adctrl：以表达与利什曼原虫抗原不相关的蛋白的腺病毒免疫的动物。p-空：以不含任何转基因的质粒进行2次疫苗接种的动物。

图7-经过免疫方案后获得的结果。

图8-在猴子中以表2中描述的方案进行疫苗接种然后进一步以婴儿利什曼原虫(箭头)刺激之后的igg抗-a2抗体水平。星号代表统计学上显著的差异。

图9-经过重组蛋白ra2(ra2蛋白加ril-12/明矾-第2组-表2)疫苗接种的猕猴显示出对于婴儿利什曼原虫内脏感染的显著控制，正如感染性刺激后肝组织活检的肉芽肿大小/数目的组织病理学分析所确定的。在第2组接受疫苗接种的猕猴中，石蜡包埋的切片用h&e染色后表明在婴儿利什曼原虫感染之后第8周显示出早期肝脏肉芽肿结构(a)，在婴儿利什曼原虫感染之后第28周显示出成熟的功能性(不含寄生虫的)肉芽肿(b)。

图10-以表达a2的质粒dna/腺病毒进行的异源初免-加强方案进行疫苗接种的猕猴(rdna-a2/rad5-a2-第6组-表2)显示出控制婴儿利什曼原虫内脏感染的改善，正如感染性刺激后肝组织活检的肉芽肿大小/数目的组织病理学分析所确定的。在接受疫苗接种的猕猴感染婴儿利什曼原虫之后28周，与对照pbs组(未显示)相比，石蜡包埋的切片用h&e染色显示出增大的(肥大)成熟肝脏肉芽肿(a-20x)，其显示出增强的寄生虫杀灭(b-40x)。

图11-以异源rad5-a2/ra2蛋白加ril-12/明矾初免-加强方案进行疫苗接种的猕猴(第4组-表2)显示出对于婴儿利什曼原虫内脏感染的显著控制，如感染性刺激后肝组织活检的肉芽肿大小/数目的组织病理学分析所确定的。在接受疫苗接种的猕猴感染婴儿利什曼原虫之后，石蜡包埋的h&e染色的切片显示出第8周有不含无鞭毛体的纷乱的肝脏肉芽肿(a-40x)，在第28周有最少的单核细胞募集(b-20x)。

本发明涉及以下实施方式：

1.包含seqidno:01的重组病毒载体。

2.实施方式1的重组病毒载体，其包含编码来自利什曼原虫的a2抗原的核苷酸序列，该序列是天然形式或修饰形式。

3.实施方式1的重组病毒载体，其中病毒是腺病毒和/或痘苗病毒。

4.用于治疗或预防利什曼病的疫苗组合物，其由含有有效诱导抵抗利什曼病之保护性免疫反应的量的实施方式1、2和3所述重组病毒载体的医学制备物组成。

5.实施方式4的用于治疗或预防利什曼病的疫苗组合物，其与其它治疗性组合物、抗原性或免疫原性疫苗共同施用或依次施用。

6.实施方式4的用于治疗或预防利什曼病的疫苗组合物，其与其它物质例如白细胞介素或cd配体共同施用或依次施用，所述其它物质的量为足以加强cd8+和/或cd4+免疫反应的量。

7.实施方式4的用于治疗或预防利什曼病的疫苗组合物，其通过口服或非肠道途径施用。

8.实施方式4的用于治疗或预防利什曼病的疫苗组合物，其含有生理学上可接受的载体。

9.用于治疗或预防利什曼病的疫苗接种方法，其包含初免-加强方案中的至少两次连续免疫，并且使用实施方式1-3所定义的腺病毒和痘苗重组病毒，由部分或全长a2蛋白组成的重组蛋白和/或编码部分或全长a2蛋白的重组质粒。

10.实施方式9的用于治疗或预防利什曼病的疫苗接种方法，其中所述免疫初免使用实施方式1-4所定义的重组病毒载体、腺病毒、痘苗病毒、重组蛋白和/或含有利什曼原虫a2蛋白的天然或经修饰的遗传序列的质粒。

11.实施方式9的用于治疗或预防利什曼病的疫苗接种方法，其中所述加强免疫使用实施方式1-4所定义的重组病毒载体、腺病毒、痘苗病毒、重组蛋白和/或含有利什曼原虫a2蛋白的天然或经修饰的遗传序列的质粒。

12.实施方式9的用于治疗或预防利什曼病的疫苗接种方法，其诱导抗体的产生，所述抗体在应用来自利什曼原虫前鞭毛体形式的抗原的诊断性血清学检验中没有反应活性。

13.实施方式9的用于治疗或预防利什曼病的疫苗接种方法，其通过产生针对利什曼原虫a2抗原的特异性抗体的方式诱导体液免疫反应。

14.实施方式9的用于治疗或预防利什曼病的疫苗接种方法，其通过诱导高水平的产生ifn-γ的细胞和/或细胞毒性细胞的方式诱导细胞免疫反应。

序列表

seq.idno.1

a)大小:708bp

b)类型:a2编码.

c)链型:双链

d)拓扑学:线性

a)类型:dna

b)名称:a2抗原

atgaagatccgcagcgtgcgtccgcttgtggtgttgctggtgtgc45

gtcgcggcggtgctcgcactcagcgcctccgctgagccgcacaag90

gcggccgttgacgtcggcccgctctccgttggcccgcagtccgtc135

ggcccgctctctgttggcccgcaggctgttggcccgctctccgtt180

ggcccgcagtccgtcggcccgctctctgttggcccgcaggctgtt225

ggcccgctctctgttggcccgcagtccgttggcccgctctccgtt270

ggcccgctctccgttggcccgcagtctgttggcccgctctccgtt315

ggctcgcagtccgtcggcccgctctctgttggtccgcagtccgtc360

ggcccgctctccgttggcccgcaggctgttggcccgctctccgtt405

ggcccgcagtccgtcggcccgctctctgttggcccgcaggctgtt450

ggcccgctctctgttggcccgcagtccgttggcccgctctccgtt495

ggcccgcagtctgttggcccgctctccgttggctcgcagtccgtc540

ggcccgctctctgttggtccgcagtccgtcggcccgctctccgtt585

ggcccgcagtctgtcggcccgctctccgttggcccgcagtccgtc630

ggcccgctctccgttggtccgcagtccgttggcccgctctccgtt675

ggcccgcagtccgttgacgtttctccggtgtct708