本发明属于医药化工领域，具体涉及一种化合物用于制备治疗氧化损伤相关疾病药物中的应用。
背景技术：
生命机体内有各种活性氧类(ros)来源，ros可使机体内各种生物大分子如核酸、脂质、蛋白质、糖等发生氧化损伤，从而导致一系列疾病。在正常情况下，dna氧化损伤是高频率的，且由于机体的修复系统并不完善，氧化损伤的dna及遭受诱变部位慢慢积累，从而导致某些癌症及机体的衰老。同时，研究表明，内皮功能障碍与氧化应激在动脉粥样硬化形成过程中起到了主导作用，活性氧簇作为氧化应激的主要诱因，促进了内皮细胞损伤及功能障碍的发生，加速了动脉粥样硬化的发生及发展。由于在动脉粥样硬化亚临床阶段还没有直接抗动脉粥样硬化的治疗途径，所以，抑制活性氧簇的活性被认为是改善及预防动脉粥样硬化疾病的合理思路[orekhovan,sobeninia,revinvv,bobryshevyv.developmentofantiatheroscleroticdrugsonthebasisofnaturalproductsusingcellmodelapproach.oxidmedcelllongev.2015；2015:463797.]。此外，近年研究还发现，白内障、老年黄斑变性等疾病的发生也与ros有关[老年黄斑编订血浆过氧化脂质和红细胞超氧化物歧化酶测定的临床意义，眼科研究，陈松等，1995，第2卷第13期]。
鉴于生命机体每时每刻都在遭受内源或外源性活性氧类的侵袭，从而诱发一系列疾病，例如动脉粥样硬化、癌症、白内障、老年黄斑变性等等。想要从根本上防治这些疾病，抗氧化损伤是关键[氧化损伤性疾病与抗氧化中药的研究，安徽中医学院学报，张秋菊，1997，第16卷第2期]。某些中草药中含有能减轻和消除ros对机体生物大分子损伤的化学物质，故它们对氧化损伤导致的多种疾病能取得好的治疗效果。例如：白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、花生、虎杖、决明、藜芦等植物中的天然抗氧化剂，现代研究表明其具有广泛的生物学活性，在治疗炎症、过敏、肿瘤、心血管疾病等方面都得以应用，而这些疾病的发生均与dna损伤及脂质过氧化密切相关[白藜芦醇抗氧化作用及其在相关疾病中的防治效果，张晓春等，食品与营养科学,2017,6(2):59-64]。为了能给新药研发和临床治疗提供更多的选择，开发更多的抗氧化损伤的物质是具有积极意义的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种化合物在制备治疗氧化损伤相关疾病的药物中的应用，本发明所述化合物具有如下式ⅰ所示的结构：
本发明所述氧化损伤相关疾病选自：动脉粥样硬化、癌症、白内障、老年黄斑变性、炎症。
本发明所述的式ⅰ化合物化学名称为3,4-二甲氧基苯基-1-o-β-d-阿拉伯糖-(1→6)-β-d-吡喃葡萄糖苷(3,4-dimethoxyphenyl-1-o-β-d-apiofuranosyl-(1→6)-β-d-glucopyranoside)，可从天然植物中提取得到或通过化学合成得到。可参考现有技术中公开的具体方法得到，例如现有技术已报道可从木兰科植物厚朴的树皮(phenolicglycosidesandotherconstituentsfromthebarkofmagnoliaofficinalis，journalofasiannaturalproductsresearch，2014，vol.16,no.4,400–405)，樟科肉桂的树皮(identificationofcompoundsfromthewatersolubleextractofcinnamomumcassiabarksandtheirinhibitoryeffectsagainsthigh-glucose-inducedmesangialcells，molecules2013,18,10930-10943)等分离得到该式ⅰ化合物。本发明所述式ⅰ化合物来自马尾松针提取物，为将马尾松鲜松叶用水回流提取后，分离、纯化得到；其中分离纯化步骤为，采用常规方法将提取物浸膏依次通过大孔树脂d101柱层析、mci柱层析、ods柱层析、sephadexlh-20柱层析、ymc柱层析、sephadexlh-20柱层析、硅胶柱层析进行分离纯化；具体包含如下步骤：
(1)取马尾松鲜松叶适量，加进入4倍量沸水中，回流提取1h，过滤，再次加入3倍量水，回流提取1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，备用；
(2)取步骤(1)中制得的浸膏，用水分散后分批上样至大孔树脂d101，再依次用水、20％乙醇洗脱3倍柱体积，收集20％乙醇洗脱部分，浓缩干燥得洗脱物a，备用；
(3)将步骤(2)的洗脱物a用水溶解后上样mci柱层析，依次经过水，10％乙醇洗脱。收集10％乙醇洗脱液，浓缩干燥得洗脱物b，备用；
(4)将步骤(3)的洗脱物b用水溶解后上样ods柱层析，依次经过水，10％乙醇洗脱，收集10％乙醇洗脱液，浓缩干燥得洗脱物c，备用；
(5)将步骤(4)的洗脱物c用20％乙醇溶解后，进行sephadexlh-20柱层析分离，20％洗脱，收集第3～4倍柱体积洗脱液，浓缩干燥得洗脱物d，备用；
(6)将步骤(5)的洗脱物d用水溶解后上样ymc柱层析，依次用2％，5％乙醇分别洗脱3倍柱体积，收集5％乙醇洗脱部分，浓缩干燥得洗脱物e，备用。
(7)将步骤(6)中洗脱物e用30％乙醇溶解后上样sephadexlh-20柱层析分离，30％乙醇洗脱，收集第3倍柱体积，浓缩干燥得洗脱物f，备用。
(8)将步骤(7)中洗脱物f用ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)溶解后上样硅胶柱层析分离，etoac：95％乙醇(6:1，v/v)洗脱，将洗脱液点薄层板，用etoac：95％乙醇(4:1，v/v)作展开剂进行分析，收集在薄层板上显示出主斑点的洗脱液，浓缩干燥得洗脱物g。
(9)将步骤(8)中洗脱物g用ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)溶解后上样硅胶柱层析分离，经ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)洗脱，将洗脱液点薄层板，用ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)作展开剂进行分析，收集在薄层板上显示单一斑点的洗脱液，浓缩干燥得到式ⅰ化合物。
本发明所述式ⅰ化合物可有效抑制过氧化氢诱导的细胞损伤，提高细胞生长率，具有显著的抗氧化损伤活性，可作为氧化损伤相关疾病的潜在治疗药物，为新药研发和临床治疗提供了新的选择。
具体实施方式
本发明中所用实验材料如下：
中压色谱分离凝胶(middlechromatogramisolatedgel，mci)：厂家：mitsubishichemicalcorporation，型号：chp20/p50；
ymc制备填料(ymc)：厂家：ymcco.,ltd.型号：ods-a-hg，s-50μm；
葡聚糖凝胶lh-20(sephadexlh-20)：厂家：gehealthcare,bio-sciencesab,18-111μm；
c18反相键合硅胶(ods)：厂家：sepaxtechnologies,inc，型号：gp-c18，50μm；
马尾松鲜松叶：2015年1月采集于四川省自贡市，经成都中医药大学严铸云教授鉴定为松科植物马尾松松针(pinusmassonianalamb.)；
大孔树脂：成都市科龙化工试剂厂，型号：d101；
内皮细胞培养基(sciencellresearchlaboratories，usa，lot.no.22099)；
胎牛血清(fetalbovineserum,fbs；sciencellresearchlaboratories，usa，lot.no.20540)；
内皮细胞生长添加剂(sciencellresearchlaboratories，usa，lot.no.20540)；
100×青霉素/链霉素(sciencellresearchlaboratories，usa，lot.no.21668)；
0.25％edta胰酶(sciencellresearchlaboratories，usa，lot.no.18105；
磷酸盐缓冲液(pbs，0.0.1m，ph7.4，碧云天生物技术有限公司，lot.no.061716160629)；
细胞计数试剂盒(cellcountingkit，cck-8)(东仁化学科技(上海)有限公司，usa，lot.no.kr674)；
人脐静脉内皮细胞(huvec)(sciencellresearchlaboratories，usa，lot.no.11234)；
白藜芦醇：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，lot.no.slbl1881v；
高温蒸汽灭菌锅，日本三洋电机公司，mls-3750；
鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司，dhg-9053a；
超净工作台，escocorporation，acb-4a1；
细胞培养箱，日本三洋电机公司，mco-15ac；
离心机，上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂，0406-1；
显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司，ckx31sf-5；
酶标仪，美谷分子仪器(上海)有限公司，vesramax；
电子天平，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司，ms204s；
-80℃低温冰箱，newbrunswickscientificco.,inc，premiumu410；
核磁共振仪:瑞士brukeravanceiii600mhz(ma,usa)。
实施例1式ⅰ化合物的制备
采用如下方法从马尾松鲜松叶中分离制备式ⅰ化合物：
(1)马尾松鲜松叶250kg，加进入4倍量沸水中，回流提取1h，过滤，再次加入3倍量水，回流提取1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏21.59kg，备用；
(2)取步骤(1)中制得的浸膏7.82kg，用水分散后分批上样至大孔树脂d101，再依次用水、20％乙醇洗脱3倍柱体积，收集20％乙醇洗脱部分，浓缩干燥得洗脱物a(668g)，备用；
(3)将步骤(2)的洗脱物a用水溶解后上样mci柱层析，依次经过水，10％乙醇洗脱，收集10％乙醇洗脱液，浓缩干燥得洗脱物b(257g)，备用；
(4)将步骤(3)的洗脱物b用水溶解后上样ods柱层析，依次经过水，10％乙醇洗脱，收集10％乙醇洗脱液，浓缩干燥得洗脱物c(143g)，备用；
(5)将步骤(4)的洗脱物c用20％乙醇溶解后，进行sephadexlh-20柱层析分离，20％洗脱，收集第3～4倍柱体积洗脱液，浓缩干燥得洗脱物d(53g)，备用；
(6)将步骤(5)的洗脱物d用水溶解后上样ymc柱层析，依次用2％，5％乙醇分别洗脱3倍柱体积，收集5％乙醇洗脱部分，浓缩干燥得洗脱物e(13g)，备用。
(7)将步骤(6)中洗脱物e用30％乙醇溶解后上样sephadexlh-20柱层析分离，30％乙醇洗脱，收集第3倍柱体积，浓缩干燥得洗脱物f(1.8g)，备用。
(8)将步骤(7)中洗脱物f用ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)溶解后上样硅胶柱层析分离，etoac：95％乙醇(6:1，v/v)洗脱，将洗脱液点硅胶薄层板，用etoac：95％乙醇(4:1，v/v)作展开剂进行分析，收集在薄层板上显示出主斑点的洗脱液，浓缩干燥得洗脱物g。
(9)将步骤(8)中洗脱物g用ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)溶解后上样硅胶柱层析分离，经ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)洗脱，将洗脱液点硅胶薄层板，用ch2cl2：95％乙醇(4:1，v/v)作展开剂进行分析，收集在薄层板上显示单一斑点的洗脱液，浓缩干燥得到式ⅰ化合物240mg。
实施例2式ⅰ化合物结构鉴定
称取5mg式ⅰ化合物，用0.5ml氘代甲醇溶解，装入核磁管，测定1h-nmr(600mhz)谱。称取25mg式ⅰ化合物，用0.5ml氘代甲醇溶解，装入核磁管，测定13c-nmr(150mhz)谱。结果如下：
1h-nmr(600mhz,cd3od):6.89(1h,d,j＝9.0hz,h-5),6.80(1h,d,j＝2.4hz,h-2),6.70(1h,dd,j＝9.0,2.4hz,h-6),5.00(1h,d,j＝2.4hz,h-1″),4.77(1h,d,j＝7.2hz,h-1′),4.04(1h,dd,j＝10.8,1.8hz,h-6′a),3.98(1h,d,j＝9.6hz,h-4″a),3.93(1h,d,j＝2.4hz,h-2″),3.83(3h,s,ome-3),3.80(3h,s,ome-4),3.77(1h,d,j＝9.6hz,h-4″b),3.62(1h,m,h-6′b),3.59(2h,s,h-5″),3.57(1h,dd,j＝6.6,1.8hz,h-3′),3.45(2h,m,h-2′,5′),3.35(1h,m,h-4′).13c-nmr(150mhz,cd3od):153.8(c-1),151.1(c-3),146.2(c-4),114.1(c-5),111.0(c-1″),109.5(c-6),104.4(c-2),103.5(c-1′),80.5(c-3″),78.0(c-3′),77.9(c-5′),77.0(c-2″),75.0(c-4″),74.9(c-2′),71.7(c-4′),68.8(c-6′),65.6(c-5″),57.2(ome-4),56.6(ome-3).该化合物为白色粉末，易溶于乙醇。以上数据与文献(bioactivedrimanesesquiterpenoidsandaromaticglycosides,bioorganic&medicinalchemistryletters,2017,27,1754–1759)报道一致，故鉴定该化合物为3,4-dimethoxyphenyl-1-o-β-d-apiofuranosyl-(1→6)-β-d-glucopyranoside.
实施例3式ⅰ化合物抗氧化损伤活性研究
3.1细胞培养及传代
新购买的huvec细胞定义为0代细胞，使用5％fbs培养基对细胞进行培养，培养基配置过程为：将25ml胎牛血清、5ml内皮细胞生长添加剂与5ml青霉素/链霉素溶液加入到500ml内皮细胞培养基中，混匀即可使用。
待细胞融合率达到80％时，对细胞进行传代：首先将5％fbs培养基及胰酶从4℃冰箱拿出，37℃水浴锅中预热，完毕后转移至无菌操作台上。然后将细胞瓶从孵箱中取出置于操作台上进行消化步骤的操作：将瓶中培养基倒出，吸取5mlpbs加入到培养瓶中，振荡瓶身洗涤细胞，随后将pbs倒入废液瓶中。随后吸取2ml0.25％edta胰酶置于培养瓶中，轻摇瓶身使得胰酶能够覆盖全部细胞，然后将培养瓶置于显微镜下观察，待细胞间隙明显、细胞出现变形后，在操作台上将胰酶倒出，迅速加入10ml5％fbs培养基，轻摇瓶身使得培养基覆盖全部细胞。随后使用吸管对细胞进行吹打，直至镜下观察细胞呈单个存在即可，吹打时应控制好力度，以免损伤细胞。
消化步骤结束后，依据细胞密度将含有细胞的培养基平均分成2-3份后分装于新的细胞培养瓶中。随后将传代的细胞瓶放入37℃，5％co2孵箱中培养，过程中避免培养基接触培养瓶的瓶口造成污染的隐患。待新传代的细胞融合率达到80％时，重复上述步骤进行传代，传至4代细胞后分96孔板进行活性检测试验。
3.2细胞消化后计数
首先将融合率达到80％的huvec细胞进行消化处理，步骤同3.1。待huvec细胞消化完毕后，吸取10μl细胞悬液至细胞计数板上，在三分钟内完成活细胞计数。计数区域为16×25型细胞计数器边缘四个大角，1ml培养基中的细胞数＝四个角的细胞总数/4×104。
3.3细胞分96孔板
细胞计数完毕后，将细胞悬液与5％培养基按照比例混匀使得细胞悬液密度为3×104个/ml，然后分96孔板。分板要求为3000个/孔，体积为100μl/孔。96孔板分板时最外周孔不加入细胞，用于加入pbs以避免内部孔培养基蒸发影响细胞活力，并留有最右测11列孔不加入细胞只加入培养基作为空白组孔。实验分板时原代细胞传代数与实验限制代数相同，故分板剩余细胞丢弃不做使用。过夜后进行药物干预实验。
3.4药物干预实验
将过夜后的96孔板中的细胞按列分组为空白组、阴性组、模型组、500μg.ml-1、250μg.ml-1、125μg.ml-1样品组以及250μg.ml-1白藜芦醇组(n＝6)。
首先配置1％fbs培养基与各浓度梯度样品与阳性药溶液：
一、配置1％fbs培养基：将5ml胎牛血清、5ml内皮细胞生长添加剂与5ml青霉素/链霉素溶液加入到500ml内皮细胞培养基中，混匀即可使用；
二、配置各浓度梯度样品溶液：将0.7ml浓度为1mg.ml-1样品原溶液与等体积1％fbs培养基混匀后，得到1.4ml浓度为500μg.ml-1的溶液；随后吸取该溶液0.7ml再次与1％fbs培养基混匀，得到1.4ml浓度为250μg.ml-1的溶液；按照此稀释原则再次得到0.7ml125μg.ml-1的样品溶液；
三、配置阳性药溶液：使用0.4mldmso将100mg规格的白藜芦醇溶解，得到浓度为250mg.ml-1的白藜芦醇原药液。吸取3μl白藜芦醇原药液与1.5ml1％fbs培养基混匀，即得到500μg.ml-1白藜芦醇溶液，随后按照对倍稀释原则得到0.7ml浓度为250μg.ml-1的白藜芦醇溶液。
按照分组将配置好的药品溶液加入到96孔板中，同时在模型组、阴性组与空白组对应孔中加入100μl1％fbs内皮细胞培养基，其中阴性组与空白组分别作为阴性对照与空白对照。
3.5模型建立实验
各浓度药品溶液作用于细胞24h后，将模型组、药品组孔内的培养基吸出，加入100μl400μμh2o2溶液(1％fbs培养基稀释)，空白组与阴性组孔内的培养基同时换为新鲜的培养基(1％fbs培养基稀释)，作用24h。
3.6实验结果检测
将600μlcck-8试剂与5.4ml1％fbs培养基混匀后得到6mlcck-8溶液，随后将此溶液加入到96孔板中的各组孔中，加入前吸除孔内所有培养基。cck-8溶液作用4h后，在酶标仪上检测96孔板各孔的od值，然后计算各组细胞生长率。计算过程如下，根据各样品组生长率(％)评价该样品是否具有细胞保护作用。
采用spss17.0软件(spssinc.,chicago,il,usa)将重复试验得到多次试验结果进行统计学分析，以±s表示，各组之间比较采用t检验，以*p<0.05或**p<0.01表示存在统计学差异。
表1式ⅰ化合物抗过氧化损伤活性实验
p：相对于模型组
根据表1结果可知，模型组细胞生长率为60.61％，与阴性组相比p值为0.0003，具有显著的统计学差异，说明细胞模型建立成功。式ⅰ化合物高、中、低浓度对过氧化氢诱导的细胞损伤均有一定的抑制作用，可显著提升细胞生长率，延缓或抑制细胞凋亡，具有显著的抗氧化损伤活性,其活性与模型组相比具有显著的统计学意义(p<0.05，p<0.01或者p<0.001)。与阳性对照组(白藜芦醇1.096mm)相比，本发明式ⅰ化合物在明显更低的给药浓度(0.279mm)下能产生相当的抗氧化活性，而在基本相当的给药浓度下(1.115mm)，本发明式ⅰ化合物修复氧化损伤，提高细胞生长率的活性显著高于阳性对照组。可见，本发明式ⅰ化合物可有效抑制过氧化氢诱导的细胞损伤，提高细胞生长率，具有显著的抗氧化损伤活性。