本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种介孔碳纳米粒及其应用。
背景技术
介孔碳是一类孔径介于2nm至50nm之间的新型碳纳米材料。介孔碳不仅具有一般介孔材料的性质如较大的比表面积、孔容和可调的孔径等，也具有一般碳的性质如热稳定性、对化学反应惰性等，这些性质使其在吸附、电化学和生物等领域有广泛的应用前景。对于高度分散的药物分子，介孔碳所具有大的比表面积和孔容，能提供高的载药能力；具有可调的有序介孔结构和孔隙，可以控制内装药物分子的释放，因此作为药物传送系统有巨大应用前景。
中国期刊《药学实践杂志》2016年3月刊登论文《pvp和peg表面修饰对有序介孔碳纳米粒分散性及细胞毒性的影响》，公开通过聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和培化磷脂酰乙醇胺(dspe-mpeg2000)对制备的有序介孔碳纳米粒(mcn)进行表面修饰，以改善材料的疏水性质，并考察其对mcn分散性和细胞毒性的影响。结果显示：mcn具有良好的生物相容性，用pvp和dspe-mpeg2000修饰后的mcn能明显减少细胞氧化应激的发生。中国期刊《药学实践杂志》2015年3月刊登论文《氧化介孔碳纳米粒作为紫杉醇载体的研究》，公开制备氧化介孔碳球纳米粒(omcn)，考察其理化性质以及作为抗肿瘤药物紫杉醇递送载体的研究。结果显示omcn的比表面积为704.63m2/g、孔容积率为0.57cm3/g、孔径分布约为3.23nm、平均粒径为140nm、zeta电位为-36mv、载药量高达45.6％，具有良好的药物负载与缓释性能，对小鼠肺癌llc细胞具有显著的抑制作用。福建中医药大学2016年公开硕士学位论文《介孔碳纳米粒的表面修饰及其生物相容性研究》，公开介绍介孔碳纳米粒的合成、表面修饰及相关表征，测定修饰前后介孔碳纳米粒的细胞毒性和对细胞的氧化应激水平的影响，对介孔碳纳米粒进行免疫毒性评价。现有技术中，关于本发明的介孔碳纳米粒及其应用，目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供高分子修饰的介孔碳纳米粒在制备药物载体中的应用。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种高分子修饰的介孔碳纳米粒。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
高分子修饰的介孔碳纳米粒在制备药物载体中的应用，所述高分子是指聚乙烯吡咯烷酮或二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000，所述介孔碳纳米粒可以在2h内被正常细胞和癌症细胞摄取。
作为本发明的一个优选实施方案，聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取mcn于去离子水中，制备介孔碳纳米粒溶液，将pvp、l-抗坏血酸加入介孔碳纳米粒溶液，搅拌，过滤，水洗，冻干，得到pvp修饰的介孔碳纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取50mgmcn粉末于200ml的去离子水中，超声，得0.25mg/ml介孔碳纳米粒溶液，将0.05gpvp(mw，40kg/mol)、0.1gl-抗坏血酸加入上述介孔碳纳米粒溶液中，室温下搅拌10min后，在80℃下继续搅拌4h，过滤，并用去离子水洗，冻干后收集粉末，得到pvp修饰的介孔碳纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取dspe-mpeg2000溶于氯仿中，加入介孔碳纳米粒并超声处理，保持温度低于30℃，除去多余的氯仿，重新分散，用去离子水洗，冻干，得到二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取10mgdspe-mpeg2000溶于10ml氯仿中，加入10mg介孔碳纳米粒于上述溶液中超声处理2h，保持水温低于30℃，室温下旋转蒸发除去多余的氯仿，用去离子水重新分散后，过滤并用去离子水洗，冻干后收集粉末，得到二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述正常细胞包括小鼠成纤维细胞，癌细胞包括人宫颈癌细胞。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种高分子修饰的介孔碳纳米粒，为聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔碳纳米粒或二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒；
所述聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取mcn于去离子水中，制备介孔碳纳米粒溶液，将pvp、l-抗坏血酸加入介孔碳纳米粒溶液，搅拌，过滤，水洗，冻干，得到pvp修饰的介孔碳纳米粒；
所述二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取dspe-mpeg2000溶于氯仿中，加入介孔碳纳米粒并超声处理，保持温度低于30℃，除去多余的氯仿，重新分散，用去离子水洗，冻干，得到二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述聚乙烯吡咯烷酮修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取50mgmcn粉末于200ml的去离子水中，超声，得0.25mg/ml介孔碳纳米粒溶液，将0.05gpvp(mw，40kg/mol)、0.1gl-抗坏血酸加入上述介孔碳纳米粒溶液中，室温下搅拌10min后，在80℃下继续搅拌4h，过滤，并用去离子水洗，冻干后收集粉末，得到pvp修饰的介孔碳纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒的制备方法如下：取10mgdspe-mpeg2000溶于10ml氯仿中，加入10mg介孔碳纳米粒于上述溶液中超声处理2h，保持水温低于30℃，室温下旋转蒸发除去多余的氯仿，用去离子水重新分散后，过滤并用去离子水洗，冻干后收集粉末，得到二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的介孔碳纳米粒。
本发明通过低浓度水热法合成了有序介孔碳纳米粒，并用生物相容性的高分子通过介孔碳纳米粒强吸附作用修饰，提高介孔碳纳米粒的亲水性和分散性。通过一系列的表征及细胞摄取实验得出以下结论：合成的有序介孔碳粒径大小约为90nm，纳米粒大小均一，介孔孔道有序。pvp和dspe-mpeg2000成功修饰到介孔碳纳米粒的表面，提高了其亲水性和分散性。介孔碳纳米粒可以在短时间内(2h)被正常细胞和癌症细胞摄取，聚齐在细胞质。由此可得我们合成粒径90nm的介孔碳纳米粒可以作为很好的药物载体，可通过epr效应被动靶向肿瘤组织。
附图说明
附图1为介孔碳纳米粒合成及修饰示意图。
附图2为mcn的tem和sem图(a,b:tem；c:sem)。
附图3为mcn的氮气吸附-脱附等温线(a)和mcn的孔径分布曲线(b)。
附图4为mcn-pvp和mcn-peg的tem图(a:mcn-pvp；b:mcn-peg)。
附图5为材料的表征图(a,b:ftir；c:uv-vis；d:h-nmr)。
附图6为材料的热重分析图。
附图7为材料的粒径分布和zeta电位(a-c:mcn、mcn-pvp和mcn-peg的粒径分布图；d-f:mcn、mcn-pvp和mcn-peg的zeta电位图)。
附图8为100μg/ml的mcn(左)、mcn-pvp(中)和mcn-peg(右)溶液分别静止0h，1.5h，3h，6h的分散性照片。
附图9与不同浓度的mcn培养后的l929细胞的流式细胞表征图。
附图10与不同浓度的mcn培养后的hela细胞的荧光显微镜表征图(×100)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明首先通过水热处理自组装合成了有序介孔碳纳米粒(mcn)，并用亲水性的生物相容性材料聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(dspe-mpeg2000)对介孔碳纳米粒表面进行修饰改善介孔碳纳米粒表面疏水性，并考察了其对介孔碳纳米粒分散性的影响，介孔碳纳米粒合成及修饰示意图如图1所示。还采用透射电镜(tem)、扫描电镜(sem)、氮气吸附脱附仪、粒径仪和红外(ftir)等方法系统的表征了材料的性质。然后选取小鼠成纤维细胞(l929)和人宫颈癌细胞(hela)为模型细胞，分别通过流式细胞仪、荧光显微镜观察等方法考察了纳米粒被细胞摄取的情况。
实施例
1实验材料
1.1主要仪器设备
yk-200水热釜：上海豫康科教仪器设备有限公司；
sk2-1-10电阻炉：上海意丰电炉有限公司；
sk2510hp超声波水浴：上海科导超声仪器有限公司；
jw-bk112全自动比表面积及孔径分析仪：北京精微高博科学技术有限公司；
l530高速离心机：湘仪离心机有限公司；
hitachi-7000型透射电镜：hitachi公司；
lambda25紫外-可见分光光度仪：美国derkinelmer公司；
nexus傅立叶红外光谱仪：美国nicolet公司；
avaneii600mhz核磁共振仪：德国bruker公司；
zetasizernanozs激光粒度-zeta电位测定仪：英国马尔文公司；
冷冻干燥机：美国labconco公司；
r系列旋转蒸发器：上海申生科技有限公司；
3111co2培养箱：美国赛默飞科技公司。
1.2主要材料和试剂
pluroier127(eo106po76eo106，sigma)；1640培养基、胎牛血清(gibco公司)；小鼠成纤维细胞(l929)；人宫颈癌细胞(hela)；去离子水(18.2mω，自制)；二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(dspe-mpeg2000，lipoid公司)；异硫氰酸荧光素(fitc，大连美仑生物技术有限公司)；0.25％胰酶(上海博光生物科技有限公司)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，罗氏公司)；4％多聚甲醛(武汉博士德生物工程有限公司)；四氢呋喃、苯酚、氢氧化钠、甲醛(37％)、无水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、l-抗坏血酸、氯仿等均购自国药集团化试剂公司。
2实验方法
2.1介孔碳纳米粒(mcn)的合成
通过水热处理自组装合成有序介孔碳纳米粒(mcn)。合成步骤如下：称取0.6g苯酚固体于250ml的圆底烧瓶中，并放于45℃水浴中融化后，立刻加入15ml、0.1mol/l的氢氧化钠溶液，搅拌10min。之后加入2.1ml、37％的甲醛溶液，整个体系升温至70℃，继续快速搅拌0.5h，得到低分子量的酚醛树脂(碳前驱物，resol)。另外称取0.96g的f127溶于65ml的去离子水(这一步在称量完苯酚后就要进行，为了使其充分溶解)，缓慢的加入上述混合液体系中，66℃下以(340±40)rpm/min的转速搅拌16～18h，至到瓶底出现沉积物停止。在室温下静置，沉积物溶解后，量取17.7ml的反应溶液转移至200ml水热釜中，用56ml去离子水稀释并密封，在烘箱中130℃水热24h。室温下冷却，以10000rpm/min离心10min收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤，室温干燥。所得干燥粉末研磨均匀后，在n2氛围中700℃焙烧3h，即得有序介孔碳纳米粒(mcn)。
2.2介孔碳纳米粒的表面修饰
称取50mgmcn粉末于200ml的去离子水中，超声半个小时，即得0.25mg/ml介孔碳纳米粒溶液。0.05gpvp(mw，40kg/mol)、0.1gl-抗坏血酸加入上述介孔碳纳米粒溶液中，室温下搅拌10min后，在80℃下继续搅拌4h，过滤，并用去离子水洗3遍，冻干后收集粉末，即得pvp修饰的介孔碳纳米粒(mcn-pvp)。
称取10mgdspe-mpeg2000溶于10ml氯仿中，加入10mg介孔碳纳米粒于上述溶液中超声处理2h，保持水温低于30℃(在超声池中加入冰，隔一段时间换冰)。室温下旋转蒸发除去多余的氯仿。用去离子水重新分散后，过滤并用去离子水洗3遍，冻干后收集粉末，即得dspe-mpeg2000修饰的介孔碳纳米粒(mcn-peg)。
2.3材料的表征
采用透射电子显微镜(tem)和扫描电子显微镜(sem)观察纳米粒的形貌及孔道结构特征。利用比表面积及孔径分析仪测定材料的结构参数，样品采用bet方法计算比表面积，bjh模型计算孔径和孔容(等温线吸附分支计算)，相对压力p/p0＝0.992时的吸附量计算孔容。
采用傅立叶变换红外光谱仪(ftir)分析修饰产物的特征官能团结构：分别取mcn、mcn-pvp和mcn-peg粉末，采用溴化钾压片制备样品，在400～4000cm-1范围扫描测定红外光谱。利用1h核磁共振(1hnmr)分析mcn-peg中引入的氢原子，样品分散于d2o。紫外-可见分光光度仪分析mcn-pvp的紫外吸收，热重分析仪(tga)考察表面修饰pvp和peg量。激光粒度仪考察材料粒径大小和zeta电位。
2.4分散性评估
分别配制浓度为100μg/ml的mcn、mcn-pvp、mcn-peg的水溶液，超声处理30min后，室温下静置，每隔一个半小时进行拍照，观察溶液的分散情况。
2.5介孔碳纳米粒负载异硫氰酸荧光素(mcn-fitc)的合成
称取1.5mgfitc溶于10ml四氢呋喃，10mg介孔碳纳米粒于上述溶液中超声分散0.5h，再室温下磁力搅拌24h，旋转蒸发除去四氢呋喃，用去离子水重新分散后高速离心除去未负载的fitc，去离子水离心洗涤2遍，冻干，即得载异硫氰酸荧光素介孔碳纳米粒(mcn-fitc)。
2.6流式细胞仪检测mcn被l929细胞的吞噬
将对数期生长的l929细胞，用胰酶消化收集l929细胞，用含10％血清的1640培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为1×105个/ml，每孔2ml，铺板接种于6孔板，置于37℃、5％co2的培养箱中过夜。第二天，吸弃细胞培养基并用pbs洗两遍，之后分别加入2ml浓度为25、50、100μg/ml的mcn-fitc培养基溶液于6孔板中，同时设一个空白对照组，继续在37℃、5％co2的培养箱中培养，2h后取出6孔板，吸弃培养基，用pbs洗尽残余的纳米粒或溶液，胰酶消化后收集细胞，用pbs洗两遍，在pbs中得到细胞悬液用流式细胞仪对荧光强度进行定量分析，激发波长λ＝488nm。
2.7荧光显微镜考察hela细胞对mcn的摄取
将对数期生长的hela细胞，用胰酶消化收集hela细胞，用含10％血清的1640培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为1×105个/ml，每孔2ml，铺板接种于6孔板，置于37℃、5％co2的培养箱中过夜。第二天，吸弃细胞培养基并用pbs洗两遍，之后分别加入2ml浓度为25、50、100μg/ml的mcn-fitc培养基溶液于6孔板中，继续在37℃、5％co2的培养箱中培养，2h后取出6孔板，吸弃培养基，用pbs洗尽残余的纳米粒或溶液。用1ml4％多聚甲醛固定细胞20min后，pbs洗涤3次，再加入1ml的1μg/mldapi在37℃下染核20min，pbs洗涤3次后，荧光显微镜观察纳米粒在hela细胞的摄取。
3结果与讨论
3.1mcn的合成和表征
利用tem和sem对合成的mcn进行表征，从图2(a、b)可以看出合成的mcn粒径大约为90nm，纳米粒为规则、均一的球形，可以观察到纳米粒表面的介孔孔道，由图2(c)可知mcn为有序的纳米小球，尺寸大小均一。50～200nm的纳米粒由于epr效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect)对肿瘤组织具有被动靶向的作用，所以我们合成的介孔碳可以作为抗肿瘤药物载体，在肿瘤治疗中起到被动靶向的作用。
根据mcn纳米粒的对氮气吸附-脱附的性能，从图3可得mcn的氮气吸附-脱附等温曲线呈现出典型的langmuirⅳ型吸附曲线，表明具有介孔结构，出现了h1型滞后环，说明介孔碳纳米粒的孔径比较均一，mcn的比表面积、孔容、孔径的大小见表1-1。由于介孔碳高的比表面积、大的孔容和比较强的吸附能力，成为药物传递系统的具有潜质的载体。
表1-1mcn的介观结构参数
3.2mcn的表面修饰及表征
为了改善介孔碳纳米粒表面的疏水性和提高溶液中的分散性，用两亲性的高分子pvp、dspe-mpeg2000来修饰介孔纳米粒，通过纳米粒较强的吸附作用合成pvp、dspe-mpeg2000修饰的介孔碳纳米粒(mcn-pvp和mcn-peg)。从tem(图4)可以观察到修饰后mcn仍然呈均一的球形，从图中可以明显的看出mcn表面覆盖了一层有机物，介孔孔道排列有序，说明修饰的过程中并没有破坏mcn原有的介孔结构。
分别将红外光谱图(图5a)中的mcn、mcn-pvp和pvp的特征峰对比可知，mcn-pvp的红外光谱图中出现了pvp的特征峰，如1261cm-1处为c-n伸缩振动峰；2918cm-1处是亚甲基的伸缩振动峰；1421cm-1处为亚甲基剪式弯曲振动引起的吸收峰；1639cm-1处是pvp环上羰基的伸缩振动峰。由此可得：生物相容性高分子pvp已经成功修饰到介孔碳纳米粒表面。将mcn和mcn-peg的红外光谱图(图5b)进行对比后可以发现，经dspe-mpeg2000修饰的mcn出现了peg的特征峰，如2922cm-1，2848cm-1处甲基、亚甲基的伸缩振动峰，1960cm-1处是c-o的吸收峰，说明在mcn表面成功连接了peg。
uv-vis结果如图5c所示，mcn在波数200～400nm间紫外吸收比较弱，pvp修饰后的mcn-pvp紫外吸收明显强，表明成功地在mcn表面进行pvp修饰。1h-nmr表征结果如图5d所示，纯的mcn只有溶剂峰(4.7ppm)，而mcn-peg出现了peg链段上的质子峰(3.63ppm归属(-och2-)n)，说明dspe-mpeg2000成功修饰到mcn的表面。
图6为材料的热重分析图，未修饰的mcn在0～550℃的温度范围内几乎没有失重，因为介孔碳纳米粒已经在氮气中高温焙烧去除表面活性剂来得到介孔孔道，而纯的pvp失重量为86.8％，mcn-pvp失重量约为9％，说明mcn的表面吸附着pvp，才导致mcn-pvp在此温度范围内失重。同时，纯的peg失重量约为90％，mcn-peg失重约16％，表明dspe-mpeg2000成功修饰到mcn的表面。
利用动态光散射表征，结果如图7，mcn的粒径约为94.81nm，而修饰后mcn-pvp粒径为108nm，mcn-peg粒径为112.3nm，修饰后介孔碳纳米粒的粒径稍微增加。mcn的zeta电荷为-16.9mv，修饰后的mcn-pvp、mcn-peg的zeta电荷分别为-0.445mv、-1.12mv，zeta电荷有所改变，是由于pvp和dspe-mpeg2000的屏蔽作用而降低，mcn表面的电荷的变化也可以证明pvp、dspe-mpeg2000成功修饰到纳米粒表面。
3.3pvp和dspeg-mpeg2000修饰对mcn的分散性的影响
如图8所示，0～3h内，mcn发生明显聚集沉降，而mcn-pvp与mcn-peg仍然呈均匀分散，6h以后，mcn与mcn-pvp沉降完全，而mcn-peg仍具有较好的分散性。说明pvp、dspe-mpeg2000修饰可以有效地改善mcn的分散性，其中mcn-peg的分散性最好。
3.4流式细胞仪检测mcn被l929细胞的吞噬
mcn-fitc中负载的fitc发出的绿色荧光可以通过流式细胞仪检测被细胞吞噬的荧光强度。从图9可以得出高、中、低剂量的mcn-fitc与l929细胞共孵育2小时后，被细胞吞噬量都高于95％，并且平均荧光强度与浓度成正相关，随着纳米粒浓度的增加，细胞的荧光强度也增强(在横线m1中表示被细胞吞噬量，xmean表示被细胞吞噬纳米粒的荧光强度)。介孔碳纳米粒负载fitc后可以完全的被正常细胞吞噬，作为药物载体可以在短时间内被细胞吞噬。
3.5荧光显微镜观察hela细胞对mcn的摄取
dapi为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链dna结合而发挥标记的作用，荧光显微镜可以看到显蓝色荧光的细胞。如图10所示，明场中可以观察到介孔碳纳米粒确实被hela摄入，聚集在细胞质，绿色荧光表明fitc通过mcn递送通过细胞膜进入到细胞中，随着mcn-fitc浓度的增加，绿色荧光强度也增强，与流式细胞仪检测mcn被l929细胞的吞噬的结果一致。
4结论
本发明通过低浓度水热法合成了有序介孔碳纳米粒，并用生物相容性的高分子通过介孔碳纳米粒强吸附作用修饰，提高介孔碳纳米粒的亲水性和分散性。通过一系列的表征及细胞摄取实验结果可以得出以下结论：合成的有序介孔碳粒径大小约为90nm，纳米粒大小均一，介孔孔道有序。pvp和dspe-mpeg2000成功修饰到介孔碳纳米粒的表面，提高了其亲水性和分散性。介孔碳纳米粒可以在短时间内(2h)被正常细胞和癌症细胞摄取，聚齐在细胞质。由此可得我们合成粒径90nm的介孔碳纳米粒可以作为很好的药物载体，可能通过epr效应被动靶向肿瘤组织。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。