固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途的制作方法

本发明属于医药、保健品或食品技术领域，尤其涉及固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途，具体涉及固绿作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂在医药、保健品或食品中的用途。

背景技术

随着全球人口的老龄化，阿尔茨海默病已经成为人类死亡的重要原因。阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)又称早老性痴呆，是一种中枢神经系统退行性疾病。临床表现为认知障碍、记忆逐渐减退，最终丧失思考能力，运动障碍，生活不能自理。病理特征主要是大脑皮层和海马区出现老年斑、胞内神经原纤维缠结积聚以及选择性神经元及突触丢失。

多年来临床用途的主要药物是胆碱酯酶抑制剂，它作用于胆碱能神经系统缓解症状，但不能阻止疾病的发生和发展。关于ad的发病机制，许多研究表明，过量的β-淀粉样蛋白(amlyiod-β，aβ)(sp的主要成分)的产生和聚集，并参与nft的形成，是ad重要的病理学特征。

aβ是i型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，app)在β-和γ-分泌酶的水解作用下形成的以α-螺旋或无规则卷曲为主的淀粉样多肽。由于γ-分泌酶的水解位点不同从而产生不同类型的aβ异构体，如aβ39，aβ40，aβ42和aβ43。

越来越多的研究表明aβ单体没有毒性，但其聚集体通过多种作用方式产生细胞毒性，引起神经元变性甚至凋亡，引发tau蛋白异常磷酸化、突触丢失、炎症反应等一系列变化。因此研究aβ的生成、聚集、清除及靶向治疗相关的药物已成为重点。

其中，阻止aβ聚集沉淀是当前研究的重中之重。现有的聚集抑制剂主要分为多肽类、蛋白及酶类、抗体类、纳米颗粒类、金属螯合剂类和有机小分子类等。其中，多肽类抑制剂大多是aβ的同源片段，因此自身会发生聚集。蛋白、酶、抗体和纳米颗粒类由于分子量过大，不容易穿过血脑屏障。金属螯合剂通过改变病灶区域金属离子浓度，在聚集过程中抑制aβ毒性，但其抑制聚集的过程不易调控。而小分子具有分子量小和易于穿过血脑屏障的特性，可以通过结合或体积排阻作用稳定初始构象，从而达到抑制聚集并降低其细胞毒性的目的，是聚集抑制剂的首选。

技术实现要素：

本发明提出固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途，通过抑制β-淀粉样蛋白聚集，从而预防或阻止ad疾病的产生。

本发明提出固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途。

进一步地，β-淀粉样蛋白为aβ39，aβ40，aβ42或aβ43中的一种或两种以上。

进一步地，β-淀粉样蛋白为aβ40。

进一步地，固绿作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品或食品中的用途。

进一步地，固绿作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

进一步地，固绿以水分散体系存在。

进一步地，固绿以浓度为0.3-90μm的固绿水分散体系存在。

进一步地，固绿以浓度为10-90μm的固绿水分散体系存在。

进一步地，药物的剂型为针剂、片剂、硬胶囊或软胶囊。

本发明的固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途具有以下优势：

本发明提出固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途，并将其用于制备药物、保健品或食品中，固绿能够有效抑制β-淀粉样蛋白聚集，从而防止ad的发生。在一定浓度范围内，随着固绿浓度增加，抑制效果越好；并且，固绿改变了聚集的形貌，阻止并减缓了其向纤维状形貌的转化；减缓了β-淀粉样蛋白中的二级结构向β-折叠转换的过程；有效抑制了β-淀粉样蛋白聚集体对细胞产生的毒性。固绿作为一种潜在的新药、保健品或食品分子，是理想的聚集抑制剂。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例1中不同浓度固绿与aβ40共培养不同时间后培养物的tht荧光图；

图2为实施例2中固绿与aβ40共培养不同时间后培养物的原子力显微镜(afm)图；

图3为实施例3中不同浓度固绿与aβ40共培养在不同时间的圆二色光谱(cd)图；图3a为不同浓度固绿与aβ40共培养0h的cd光谱图；图3b为不同浓度固绿与aβ40共培养48h的cd光谱图；

图4为实施例4中不同浓度固绿与aβ40共培养后培养物对pc12细胞的细胞毒性图；图4a为不同浓度固绿与aβ40共培养产生的细胞毒性；图4b为不同浓度固绿本身产生的细胞毒性；

图5为实施例5中固绿与aβ40共培养24h后培养物对pc12的fda/pi染色图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明实施例提供一种固绿在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的用途。

固绿结构式如下：

现有技术中，固绿作为一类食品添加剂类小分子，主要作为酸性染料，用于食品，化妆品和医药领域的着色。而本申请中，提供了一种固绿在制备β-淀粉样蛋白聚集抑制剂的新用途，为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂的研究提供了新思路。

在本发明一实施例中，β-淀粉样蛋白可以为aβ39，aβ40，aβ42或aβ43中的一种或两种以上。β-淀粉样蛋白aβ是i型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，app)在β-和γ-分泌酶的水解作用下形成的以α-螺旋或无规则卷曲为主的淀粉样多肽。由于γ-分泌酶的水解位点不同从而产生不同类型的aβ异构体，如aβ39，aβ40，aβ42和aβ43。

优选的，β-淀粉样蛋白为aβ40。aβ40是最主要的短肽之一，在ad形成和发展中起至关重要的作用。

在本发明又一实施例中，固绿作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品或食品中的用途。本发明充分利用固绿作为食品添加剂类小分子，毒副作用小、来源丰富、适用于长期服用，且食用方便，患者顺应性良好的特性，将其用于药物、保健品或食品的新开发。

在一些实施例中，固绿可以以水分散体系存在。例如可以以0.3-90μm、10-90μm的浓度存在。

优选的，固绿可作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂在制备药物中的用途。

具体而言，固绿可作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物。阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病。正常生理条件下，aβ是可溶的，它的产生、降解和清除是一个动态平衡过程。但在ad患者脑内，这种平衡被破坏，aβ通过自身聚集形成难溶的沉淀，并生成老年斑，这是发生ad的关键环节。将固绿用途于制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中，可通过抑制β-淀粉样蛋白(aβ)的产生和聚集，从而防止阿尔茨海默病(ad)的发生。

进一步地，固绿也作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂在制备食品和保健品中的用途。固绿作为β-淀粉样蛋白聚集的抑制剂制备的保健品或食品也可用于预防阿尔茨海默病的发生。保健品和食品对人体的毒副作用相对较小，将其用于预防阿尔茨海默病具有良好效果。

可见，本发明实施例提供的用途进一步促进了治疗阿尔茨海默病的研究进展。

如上所述，固绿可以以水分散体系存在。具体而言，固绿可以以浓度为0.3-90μm的固绿水分散体系存在。具体可以为0.3μm、1.0μm、3.0μm、9.0μm、10μm，30μm，90μm等。

在本发明又一实施例中，药物的剂型可以为针剂、片剂、硬胶囊或软胶囊。具体地，固绿可以以粉末混合物的形式存在，可以用于制备用于抑制β-淀粉样蛋白聚集的粉末混合物型药物，如片剂、硬胶囊；或者，可以以固绿的分散体系的形式存在，即，固绿可以用于制备用于抑制β-淀粉样蛋白聚集的液体型药物，如针剂、注射液、软胶囊。

下面参照具体实施例进一步阐述固绿在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物、保健品或食品的用途。

实施例1：不同浓度固绿与aβ40共培养不同时间后培养物的硫黄素(tht)荧光强度变化

首先，将aβ40溶于六氟异丙醇溶液，得到1mg/ml的aβ40溶液，超声10min，使aβ40处于单分散状态，冷冻干燥，获得aβ40干粉，于-20℃保存。然后，称取0.6mgaβ40粉末，溶于0.4ml20mm的naoh溶液中，使其终浓度为330μm，超声10min，使之充分溶解，得浓度为330μm的aβ40母液。

其次，称取10.512mgtht溶于100ml磷酸盐缓冲液(pbs，phosphatebuffersaline，其中磷酸盐浓度为100mm，nacl浓度为10mm)，得浓度为330μm的tht母液。

称取16000g浓度为330μm的aβ40母液离心20min，去除已经发生聚集的多肽。取上清体积75％，加入tht母液，按aβ40与tht的终浓度比为1：1用pbs稀释至30μm，37℃酶标仪中原位培养。

称取0.81mg固绿溶于1ml超纯水中获得浓度为1mm的固绿母液。

将浓度为330μm的aβ40母液、浓度为330μm的tht母液与固绿母液按梯度稀释，获得固绿终浓度分别为1μm，3μm，10μm，30μm，90μm的aβ40溶液(其中，溶液中的aβ40和tht的浓度均为30μm)，也即aβ40：固绿分别为30:1、10:1、3:1、1:1、1:3，37℃进行原位培养。

在不同培养时间下测定其在440nm处激发波长和480nm处发射波长下的荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图，结果如图1所示。

由图1可知，加入固绿后aβ40的tht荧光强度明显下降，且tht荧光下降程度与固绿浓度呈正比，说明固绿有效抑制了aβ40的聚集。

实施例2：固绿与aβ40共培养不同时间后培养物的聚集形态变化

按照与实施例1相同的方法处理aβ40，并配制含有浓度为90μm固绿的aβ40溶液，溶液中aβ40的终浓度为30μm，也即aβ40：固绿为1:3。将上述溶液于酶标仪中37℃，每10min震荡5s条件下进行培养。

培养48h时，取100μlaβ40培养液，超声10min；在干净的培养皿中用双面胶固定圆形铁片，再在圆形铁片上固定云母片，用透明胶带连续将云母片粘三次，去掉云母片的不干净层数。用20μl的移液枪取20μl超声好的样品滴在云母片上，待5-10min后，再用移液枪取200μl哇哈哈纯净水缓慢冲洗5次(总共冲洗用水量为1ml)后，自然晾干。然后用原子力显微镜(multimode8，bruker，usa)进行观察，选取放大尺度为5μm的图像进行观察，结果如图2所示。

由图2可知，加入固绿后aβ40聚集体的形貌发生了变化，培养时间为48h时，aβ40单独培养组出现了大量的成熟纤维(图2a)，加入固绿组则出现大量的不规则聚集体，并未出现成熟的纤维聚集体(图2b)。这说明固绿的存在改变了aβ40聚集体的形貌，阻止了其向纤维的转化。

实施例3：不同浓度固绿与aβ40共培养不同时间后培养物的二级结构变化

按照与实施例一相同的方法处理aβ40，并配制含不同固绿浓度(1μm，3μm，10μm，30μm，90μm)的aβ40培养液、其中aβ40终浓度为30μm，也即溶液中aβ40与固绿的浓度比为30:1、10:1、3:1、1:1、1:3，将上述溶液置于37℃，140rpm条件下进行培养。

培养48h时，取培养液400μl加入光程为1mm的cd检测池中进行检测，波长扫描范围为190-260nm，带宽2nm，扫描速度为100nm/min，实验结果为三次扫描平均值，结果如图3所示。由图3可得，aβ40自身与加入不同浓度固绿的二级结构随着培养时间的推移发生转化。

如图3a所示，培养起始阶段，aβ40与加入不同浓度固绿的cd图谱在190-200nm处有一负峰，说明此时的二级结构主要是无规卷曲。

如图3b所示，培养48h后，该负峰逐渐消失，逐渐出现了表征β-折叠的处于216nm左右的负谱带，说明aβ40的二级结构由无规卷曲转化为β-折叠，并且aβ40、aβ40：固绿＝30：1、aβ40：固绿＝10：1组谱图出现195nm左右的正峰和216nm左右的负峰，说明此时aβ40聚集的二级结构转化为β-折叠。且在195正峰处随着固绿浓度的增加峰强逐渐变弱。当固绿浓度继续增加后在195nm处的正峰逐渐消失。上述结果表明，固绿减缓了aβ40中的二级结构向β-折叠转换的过程，并随着其浓度的增加，减缓转换效果越明显。

实施例4：用mtt方法检测不同浓度的固绿与aβ40共培养24h后培养物对pc12细胞的毒性

细胞毒性实验中使用的细胞为鼠嗜铬细胞瘤株(pc12)。rpmi1640培养基加体积分数为10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素，5％co2，37℃培养细胞。待细胞增长至70％融合时，用含0.1g·l^-1乙二胺二乙酸二钠盐的0.5g·l^-1胰蛋白酶消化，再用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的rpmimedium1640basic培养基以适当浓度稀释细胞，以5×10³cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔90μl。5％co2，37℃培养24h。

先配制终浓度分别为0.3μm，1.0μm，3.0μm，9.0μm的固绿溶液，再配制固绿终浓度分别为0μm、3μm、10μm、30μm、90μm的aβ40溶液(此时溶液中的aβ40的浓度均为30μm)，也即aβ40：固绿分别为10:1、3:1、1:1、1:3，其中aβ40的处理方法与实施例1相同，37℃培养48h。

将上述老化好的aβ40和加入不同浓度固绿的aβ40溶液加入到已经培养24h的含有pc12细胞的96孔板中，10μl/孔。空白对照孔中不加固绿和aβ40溶液，只加入pbs缓冲液10μl/孔。加药孔每孔中固绿终浓度为0.3μm，1.0μm，3.0μm，9.0μm，aβ40的终浓度为3μm。

不加aβ40组，只加入固绿溶液，其终浓度分别为0.3μm，1.0μm，3.0μm，9.0μm。细胞在培养箱中以5％co2，37℃培养48h后，加入10μl/孔的mtt溶液，使得培养基中的mtt终浓度为0.5mg/ml。5％co2，37℃条件继续培养4h。

将96孔板按1500rpm/min离心10min。移除96孔板中溶液，每孔加入100μl的dmso摇床震荡10min，检测570nm处吸光值。将培养基中不含aβ40和固绿的孔作为空白对照组，记为细胞活性为100％，然后将其作为对照计算加药组的细胞存活率(图4)。实验中每个固绿浓度梯度设置6个复孔。

由图4a可知，aβ40单独存在时，细胞存活率为43％。而加入不同浓度的固绿(0.3，1.0，3.0，9.0μm)后细胞存活率提高到46％、46％、55％、65％，说明固绿能够有效抑制aβ40产生的细胞毒性，并且随着固绿浓度的增加其效果越好。

由图4b可知，固绿本身也具有轻微的细胞保护作用。

实施例5：用fda/pi混合双染检测固绿与aβ40共培养24h后培养物对pc12的细胞毒性

配制储藏液，称取fda5mg，加入15ml离心管。加入1ml的丙酮，振荡，包住锡纸并标记，-4℃度低温保存。称取pi1mg，加入15ml离心管。加入lml的pbs缓冲液，振荡，包住锡纸并标记，-4℃低温保存。配制工作液，取10ml的pbs到离心管，加入fda储存液20μl，pi储存液50μl，使fda终浓度为10μg/ml，pi终浓度为5μg/ml，包住锡纸并标记，-4℃低温保存。

取与实施例4相同方法分化处理好的pc12细胞，以密度5×10⁴cell/ml稀释细胞，加入到6孔板，每孔2ml。5％co2，37℃培养24h。

配制浓度为90μm的固绿溶液，aβ40，固绿终浓度为90μm的aβ40溶液(此时溶液中的aβ40的浓度均为30μm)，其中aβ40的处理方法与实施例1相同，37℃培养24h。

将上述老化好的固绿，aβ40，固绿的aβ40溶液加入到已经培养24h的含有pc12的6孔板中，200μl/孔。空白对照孔中加入pbs缓冲液200μl/孔。细胞在培养箱中以5％co2，37℃培养48h后，进行fda/pi混合双染。

慢速轻轻吸出培养基。用pbs轻洗2次并吸出。慢速贴壁加入染色液染色1-2min，pbs轻洗后荧光显微镜进行观察。如图5所示，与对照组相比，aβ40可以使能被fda染色的存活细胞数量减少，使能被pi染色的凋亡细胞数量增加。加入固绿后，可以明显降低aβ40引起的细胞凋亡，并且其本身并没有细胞毒性，且具有弱细胞保护作用。

固绿作为β-淀粉样蛋白聚集抑制剂不仅在制备药物中应用广泛，在保健品或食品中也有重要的应用。

实施例6：固绿用于保健品的制备

重量份组成为(每份为0.01g)：固绿1份、维生素a10份、维生素b110份、维生素b210份、维生素c10份、维生素h10份、硫酸亚铁5份、氧化锌1份。

引用时加水150ml冲服。

使用该保健品与aβ40的制得的混合溶液进行荧光强度测试，与对照组(未添加固绿的保健品与aβ40形成的溶液)进行比较，加入固绿后aβ40的荧光强度明显下降，说明固绿有效抑制了aβ40的聚集。

实施例7：固绿用于饮料的制备

重量份数为：固绿0.06份、柠檬酸50份、低聚糖25份、水1000份。

通过溶解活性组分，混合，在85℃下搅拌1h，过滤，然后将所有组分填装进瓶中进行灭菌制得健康饮料。

使用该饮品与aβ40的混合溶液进行荧光强度测试，与对照组(未添加固绿的饮品与aβ40形成的溶液)进行比较，加入固绿后aβ40溶液的荧光强度明显下降，说明固绿有效抑制了aβ40的聚集。

aβ聚集抑制剂是ad治疗新药开发的主要热点。aβ聚集抑制剂通过抑制β-淀粉样蛋白(aβ)的产生和聚集，从而预防或治疗ad。本发明提出了固绿在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，并将其用于aβ40聚集和细胞毒性抑制实验，为ad治疗新药提供新的候选者。

本发明已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。