本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种利用中西药联用治疗石斑鱼变形假单胞菌病的组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)已被证明是闽东地区海水鱼内脏白点病的病原菌。为网箱养殖海水鱼的常见病害，引起大黄鱼大规模死亡，给养殖业造成严重的损失，是一种典型的温度依赖性疾病，在水温16～20℃下爆发，当水温超过20℃时该病自然消退。变形假单胞菌不仅能引起养殖海水鱼的内脏白点病，在人工感染情况下也能引起石斑鱼(epinephelus)等海水鱼的内脏白点病，感染死亡率最高达100％。
抗生素是目前水产动物细菌性疾病治疗的主要手段，随着抗生素在治疗细菌性疾病中广泛应用，产生细菌耐药性、导致药物残留等缺点。而石斑鱼自身抵抗力日益降低，病害问题日趋严重，给石斑鱼养殖业带来了大的损失。石斑鱼变形假单胞菌病已造成严重经济损失，在养殖生产上治疗鱼病主要是西药，病菌已产生耐药性，治疗效果不佳。研究与开发中草药防治鱼病有重要意义。我国传统中药除可克服前述缺点外，还可增强水产养殖动物免疫力，实验表明中药及中药复方对细菌有较好的体外抑制效果。检索黄连、黄芪、黄柏均有少量专利，但是都是单方用药，用于加强动物的疾病防治等的配方中，并取得一定疗效。
然而现有技术中关于变形假单胞菌有多件专利，但是都是利用变形假单胞菌腈类化合物作为唯一能源进行生长繁殖，可降解丙烯腈废水中的腈类化合物等污染物，或微生物变形假单胞菌发酵产的精氨酸脱亚氨酶(adi)。现有技术对变形假单胞菌相关的专利均是该菌本身的利用，没有对变形假单胞菌病防治的专利，也未有关于石斑鱼变形假单胞菌病治疗方案的报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用中西药联用治疗石斑鱼变形假单胞菌病的组合物及其制备方法和应用，所述组合物对变形假单胞菌引起的病害有较强药效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供利用中西药联用治疗石斑鱼变形假单胞菌病的组合物，包括黄连、黄芪、黄柏和恩诺沙星；所述黄连、黄芪、黄柏和恩诺沙星的质量比为0.9～1.3：0.9～1.3：0.9～1.3：0.9～1.3。
优选的，所述黄连、黄芪、黄柏和恩诺沙星的质量比为1：1：1：1。
本发明提供了所述组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将黄连、黄芪和黄柏粉碎，得到中药粉末；
2)将所述中药粉末进行超微粉碎，得到超微药粉；
3)将所述超微药粉在60～70℃条件下烘烤24～48h，得到中药细粉；
4)将所述中药细粉和恩诺沙星混合，得到组合物。
优选的，步骤1)中中药粉末的粒径为140～160μm；
所述步骤2)中超微药粉的粒径为5～10μm。
优选的，所述步骤3)中烘烤的温度为65℃，所述烘烤的时间为36h。
本发明提供了所述组合物在制备治疗石斑鱼变形假单胞菌病药物中的应用。
优选的，所述组合物的有效抑菌浓度为60～80mg/l。
优选的，所述组合物的质量占石斑鱼饲料质量的1.8～2.4％。
优选的，所述组合物的投加量为石斑鱼鱼体重量的2％～3％。
优选的，所述药物治疗石斑鱼变形假单胞菌病的用药时间为30～45d。
本发明提供利用中西药联用治疗石斑鱼变形假单胞菌病的组合物，将黄连、黄芪、黄柏和恩诺沙星的质量比为0.9～1.3：0.9～1.3：0.9～1.3：0.9～1.3的比例组合，复方药有协同增效作用，可较大提高单方药的药效，降低各药的用量，同时制备的中西药联用的组合物能较大程度提高治疗石斑鱼变形假单胞菌病的药效，比未投药病鱼的成活率提高65％以上。
同时本发明提供的组合物中利用三联中药配方治疗石斑鱼变形假单胞菌病，与单方中药治疗效果相比较，有治疗时间更短，疗效更好等优点，尤其比纯西药治疗药物残留少。
本发明提供了所述组合物的制备方法，将中药组分黄连、黄芪和黄柏依次经过粉碎、超微粉碎和烘烤，得到的中药细粉与恩诺沙星混合，制备得到组合物。所述制备方法有利于中药组分中药物活性成分充分释放，提高药物功效，同时所述方法制备步骤简单，采用机械加工生产，重复性好，有利于实现批量化生产。
本发明提供了所述组合物在制备治疗石斑鱼变形假单胞菌病药物中的应用。所述组合物能有效抑制变形假单胞菌的生长，从而实现制备的药物具有有效治疗石斑鱼变形假单胞菌病的目的。
具体实施方式
本发明提供利用中西药联用治疗石斑鱼变形假单胞菌病的组合物，包括黄连、黄芪、黄柏和恩诺沙星；所述黄连、黄芪、黄柏和恩诺沙星的质量比为0.9～1.3：0.9～1.3：0.9～1.3：0.9～1.3，更优选为1:1:1:1。
本发明对所述黄连、黄芪、黄柏的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的黄连、黄芪、黄柏即可。在本发明实施例中，所述黄连、黄芪和黄柏购自厦门连福堂药店。
本发明提供了所述组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将黄连、黄芪和黄柏粉碎，得到中药粉末；
2)将所述中药粉末进行超微粉碎，得到超微药粉；
3)将所述超微药粉在60～70℃条件下烘烤24～48h，得到的中药细粉；
4)将所述中药细粉和恩诺沙星混合，得到组合物。
本发明将黄连、黄芪和黄柏粉碎，得到中药粉末。粉碎后的中药粉末的粒径优选为140～160μm。更优选为150μm。所述粉碎时包括黄连、黄芪和黄柏分别粉碎或者将黄连、黄芪和黄柏按照上述配比混合再粉碎。本发明对所述粉碎的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的粉碎方法即可。在本发明实施例中，所述粉碎用仪器为型号为fw177的粉碎机，购自天津市泰斯特仪器有限公司。本发明对所述恩诺沙星的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的恩诺沙星即可。在本发明实施例中，所述恩诺沙星购自兴化市恒威生物技术有限公司。
得到中药粉末后，本发明将所述中药粉末进行超微粉碎，得到超微药粉。
在本发明中，所述超微粉碎前优选将所述中药粉末进行烘烤。所述烘烤的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述烘烤的时间优选为24～48h，更优选为36h。烘烤使超微药粉的含水量降低，使符合超微粉碎的要求。
在本发明中，所述超微药粉的粒径优选为5～10μm，更优选为6～9μm，最优选为8μm。本发明对所述超微粉碎的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的超微粉碎的方法即可。在本发明实施例中，所述超微粉碎用仪器为型号为sqw-60的三清振动微粉机，购自山东三清不锈钢设备有限公司。所述超微粉碎有利于中药中药物活性成分充分释放出来。
得到超微药粉后，本发明将所述超微药粉在60～70℃条件下烘烤24～48h，得到中药细粉。在本发明中，所述烘烤的温度优为65℃，所述烘烤的时间优为36h。烘烤使超微药粉的含水量降低。
得到中药细粉后，本发明将所述中药细粉和恩诺沙星混合，得到组合物。本发明对所述混合的方式没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合方案即可。
本发明提供了所述组合物在制备治疗石斑鱼变形假单胞菌病药物中的应用。
在本发明中，三种中药形成的中药组合物对石斑鱼变形假单胞菌的抑菌实验包括以下步骤：所述中药组合物配制为溶液，将得到的中药组合物溶液对0.1ml菌量浓度108cfu/ml的变形假单胞菌滴入平板、涂匀，观察抑菌情况。结果发现中药组合物溶液的有效浓度为60～80mg/l为极敏感。中药组合物溶液的有效浓度更优选为65～75mg/l，最优选为70mg/l。
在本发明中，将组合物添加到斜带石斑鱼基础饲料中做成药物颗粒，所述组合物的质量优选占药物总质量的1.8％～2.4％，更优选为2.0％。所述组合物的投饲量优选为鱼体质量的2％～3％，更优选为2.5％。
在本发明中，所述药物的制备方法优选包括以下步骤：将基础饲料制成饲料细粉，将上述方案制备的组合物与饲料细粉混合，制粒，得到药物。本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合方法即可。本发明对所述制粒的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制粒方法即可。
在本发明中，所述药物治疗石斑鱼变形假单胞菌病的用药时间优选为30～45d。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用中西药联用治疗石斑鱼变形假单胞菌病的组合物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从厦门连福堂药店购买黄连、黄芪、黄柏；将中药用中药粉碎机粉碎(fw177，天津市泰斯特仪器有限公司)粉碎至约150μm，然后放入超微粉碎机(三清振动微粉机,sqw-60，山东三清不锈钢设备有限公司)中进一步粉碎，直至颗粒粒径大小为5～10μm，收集超微药粉备用。将所述三种超微药粉分别在60℃条件下烘烤48h，得到中药细粉；称量上述得到的中药细粉，黄连细粉0.9kg，黄芪细粉1.3kg，黄柏细粉0.9kg，得到组合物。
实施例2
将黄柏、黄连、黄芪的中药粉碎至160μm，得到三种中药粉末；将所述三种中药粉末分别进行超微粉碎至粒径10μm，得到三种超微药粉；将所述三种超微药粉分别在70℃条件下烘烤24h，得到中药细粉；称量上述得到的中药细粉，黄连细粉1.2kg，黄芪细粉0.9kg，黄柏细粉1.0kg，混合，得到组合物。
实施例3
将黄柏、黄连、黄芪的中药粉碎至150μm，得到三种中药粉末；将所述三种中药粉末分别进行超微粉碎至粒径8μm，得到三种超微药粉；将所述三种超微药粉分别在65℃条件下烘烤36h，得到中药细粉；称量上述得到的中药细粉，黄连细粉1.0kg，黄芪细粉1.0kg，黄柏细粉1.0kg，混合，得到组合物。
对比例1
称量实施例3制备的黄连中药细粉1.0kg，得到单方药物。
对比例2
称量实施例3制备的黄芪细粉2.0kg和黄柏细粉2.0kg，得到复方二联中药组合物。
对比例3
从江阴天江药业有限公司购买连翘，按照实施例3的方法制备得到连翘中药细粉，称量连翘中药细粉1.5kg，与实施例3制备的黄连细粉1.5kg和黄芪细粉1.5kg混合，得到复方三联中药组合物。
对比例4
将1×108cfu/ml变形假单胞菌200μl菌悬液均匀涂布于lb培养基平板上，放入恩诺沙星药敏纸片(购自杭州天和微生物试剂有限公司)，根据clsim100的最新标准判定结果。测量抑菌圈直径，判定变形假单胞菌的敏感性。
实施例4～6
将实施例1制备的组合物与水混合，并隔水加热，制备成溶液相当于生药的质量浓度为60mg/ml、70mg/ml和80mg/ml。实施例2和3制备的组合物按照上述方法同样制备成60mg/ml、70mg/ml和80mg/ml的药物溶液。
利用牛津杯法研究药物对细菌的作用效果，在平板中倒入10～12ml灭菌后的lb固体培养基，待凝固后，用镊子轻轻在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯浸入培养基中，取12～15ml的lb培养基(温度以不烫手为宜)混合均匀倒入平板上，待凝固后，将牛津杯取下，将变形假单胞菌稀释至1.0x108～3.0x108cfu/ml，用移液枪吸取0.1ml菌悬液，滴入平板，用涂布器涂匀，用移液枪在1个孔中加入200μl的无菌水为对照，在另3个孔中用移液枪加入上述3种不同浓度的药液200μl，每个试验组和对照组均设置3个重复组。置于26～30℃条件下，恒温培养18～36h，观察抑菌圈，并用supcreg1菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪(杭州迅数科技有限公司)测量抑菌圈大小，每个实验3次重复。计算平均值，进行对比研究，根据抑菌圈直径大小判定其抑菌能力的强弱。抑菌圈结果见表1。
表1实施例1～3制备的组合物不同浓度溶液的抑菌情况
对比例5～8
按照实施例4～6的方法将对比例1～4制备的中药溶液进行抑菌实验，观察抑菌圈和抑菌能力。结果见表2。
表2对比例1～4制备的组合物不同浓度溶液的抑菌情况
实施例7～11
将实施例1～3制备的中药组合物分别与石斑鱼基础饲料按照1.8～2.4：98.2～97.6的质量比混合，制粒，得到3组药物。
每尾试验石斑鱼用103cfu/g的变形假单胞菌活菌菌悬液通过胸腔注射的方式对受试鱼进行攻毒。变形假单胞菌活菌液0.2ml，攻毒后每组都投喂基础饲料，喂养40d，得到患有变形假单胞菌感染的石斑鱼。每个养殖池投放20尾患有变形假单胞菌感染的石斑鱼。
试验组1～3投喂上述制备的3组药物，具体饲喂关系见表3，饲喂量相当于实施例1～3制备的组合物的投加量为鱼体重的2％～3％，每天饲喂的次数为2次，共饲喂40d。待鱼饱食后吸出残饵。日换水一次，换水量为总体积的1/3。同时还设立对照组ⅰ(正常喂基础饲料，健康鱼)和对照组ⅱ(正常喂基础饲料，变形假单胞菌攻毒鱼)，每个试验组和对照组均设置3个重复组。每天保持观察并记录存活情况(观察40d)，记录发病症状及死亡情况，解剖检查死亡鱼，计算累积死亡率(cumulativemortalityrate)。
每一组实验中鱼如仍有存活，仍继续以上方式投喂，至鱼全部死亡。统计鱼50％、100％死亡时间。
表3试验组1～3投喂上述制备的3组药物和对照组的累积死亡率
实施例12
称量恩诺沙星(购自兴化市恒威生物技术有限公司)1.3kg，与实施例1中制备的组合物混合，得到中西药复配药物组合物。
实施例13
称量恩诺沙星(购自兴化市恒威生物技术有限公司)0.9kg，与实施例2中制备的组合物混合，得到中西药复配药物组合物。
实施例14
称量恩诺沙星(购自兴化市恒威生物技术有限公司)1.0kg，与实施例3中制备的组合物混合，得到中西药复配药物组合物。
实施例15～17
人工攻毒与中西药防治石斑鱼变形假单胞菌病：
1、人工感染实验:实验开始前，对实验斜带石斑鱼注射变形假单胞菌进行攻毒预实验，80％以上发生病症但不引起死亡的浓度定为实验菌液浓度。斜带石斑鱼购自福建省漳浦市某养殖场，体长(11±2)cm，暂养于1t水体的循环水养殖系统。暂养1周后用于实验。把体重、大小相当的健康斜带石斑鱼随机分成实验组和对照组，每组各20尾，分别在18℃的循环水养殖系统内适应性饲养一周。用103cfu/g的变形假单胞菌菌悬液通过胸腔注射的方式对受试鱼进行攻毒。对照组斜带石斑鱼则用pbs缓冲液注射。然后分别把4组鱼转入饲养水体中进行喂养。试验设对照组ⅰ(喂饲料，健康鱼)、对照组ⅱ(喂饲料，变形假单胞菌攻毒鱼)，试验组ⅰ(喂饲料加实施例12制备的药物组合物，变形假单胞菌攻毒鱼)，试验组ⅱ(喂饲料加实施例13制备的药物组合物，变形假单胞菌攻毒鱼)，试验组ⅲ(喂饲料加实施例14制备的药物组合物，变形假单胞菌攻毒鱼)，另与生产中常用药物进行治疗效果对比，设对照组ⅲ(喂饲料加2.2％板黄散，变形假单胞菌攻毒鱼)、对照组ⅳ(喂饲料加2.2％大黄五倍子散，变形假单胞菌攻毒鱼)，每个试验组和对照组均设置3个重复组。试验开始后，每日于8:00、17:00投喂2次，投饲量为鱼体质量的2％～3％，并根据生长、摄食情况作调整。待鱼饱食后吸出残饵。日换水一次，换水量为总体积的1/3。试验基础饲料由公司提供。试验饲料分别中添加复方中草药制剂、中西药联用制剂，对照组饲料中不添加任何药物。
每天保持观察并记录存活情况(观察40d)，记录发病症状及死亡情况，解剖检查死亡鱼，计算累积死亡率(cumulativemortalityrate)。但鱼如仍有存活，仍继续以上方式投喂，至鱼全部死亡。统计鱼50％、100％死亡时间。
rcm＝[(n0－nt)/n0]×100％式a
式a中:rcm为累积死亡率(％)；n0为试验初鱼数；nt为试验结束鱼数；进行相关指标检测。测死亡率(初始鱼成活率、半数鱼死亡时间、全部鱼死亡时间)。
2、中西药治疗石斑鱼变形假单胞菌病，药饵组和对照组鱼的成活率
对照组和经活菌人工感染斜带石斑鱼后试验组，各组的死亡情况如表4。
攻毒试验结果在攻毒试验5天后，各组斜带石斑鱼实验组陆续出现死亡，试验鱼开始出现病症。
试验证明，攻毒后40d内鱼的死亡趋于稳定，故本试验记录攻毒后30d内各组的死亡数，在攻毒第1天和第2天各试验组鱼摄食量明显减少，病鱼死亡数量对照组ⅱ>对照组ⅳ>对照组ⅲ>试验组ⅲ>试验组ⅱ>试验组ⅰ>对照组ⅰ。
试验结束时，对照组ⅰ(空白对照组、健康鱼投饲料)均健康存活，成活率为100.00％，且活动和摄食均正常，无肉眼可见的病症。
对照组ⅱ在菌悬液注射后3d出现死亡1尾，14～15d为死亡高峰期，17d全部死亡(20尾)。
试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ，菌悬液注射后15d出现死亡1尾，45～55d为死亡高峰期，死亡10尾。100％死亡时间为60～73天。而使用常用药治疗组对照组ⅲ、对照组ⅳ40d的死亡率分别为85.00％、95％。死亡率高于本发明试验组用药。
结果表明：喂饲料加中西药复方能较好治疗斜带石斑鱼变形假单胞菌病，且其治疗效果优于生产常用药板黄散、大黄五倍子散。
表4对照组和经活菌人工感染斜带石斑鱼后试验组的死亡情况
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。