乙酸酯类化合物在制备环鸟腺苷合成酶乙酰化药物中的用途的制作方法

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一类以下式i所示的乙酸酯类化合物在制备环鸟腺苷合成酶乙酰化药物中的用途。
背景技术：
：细胞质中dna的出现通常被机体认为是微生物感染或组织损伤的信号，因此细胞质dna作为一种危险信号可以引起强烈的先天免疫反应(annualreviewofimmunology，2011，29，185-214)。细胞质dna的识别是机体防御微生物感染的重要机制。cgas(cyclicgmp-ampsynthase，环鸟腺苷合成酶)是主要的细胞质dna感受器，它可以迅速识别dna刺激并激活免疫反应。与dna结合后，激活的cgas可以催化atp和gtp产生环状小分子cgamp(cyclicgmp-amp)(science，2013，339，786-791；science，2013，339，826-830)。cgamp可以作为第二信使结合并激活内质网蛋白质sting(也被称作mita，mpys，eris)(nature，2008，455，674-678；molecularandcellularbiology，2008，28，5014-5026；procnatlacadsciusa，2009，106,8653-8658；immunity，2008，29，538-550)，sting可以介导下游tbk1和irf3的激活，并产生i型干扰素(sciencesignaling，2012，5，pe9)。i型干扰素在抗病毒反应中发挥着重要作用，它可以诱导一系列干扰素诱导的基因isgs的表达(procnatlacadsciusa，2015，112,e5699-5705)。除了微生物感染以外，细胞损伤或者细胞内源逆转录病毒也可以产生细胞质自身dna(currentopinioninimmunology，2014，31，121-126；naturereviewsimmunology，2016，16，207-219；science，2013，339，763-764)。后生动物进化出了dna酶，它们可以清除细胞自身dna，进而防止cgas的不当激活引起的免疫反应。例如，trex1可以降解细胞质中的dna，在诸如ags综合征(aicardi–goutièressyndrome)和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病患者中发现了trex1功能的缺失(currentopinioninimmunology，2014，31，121-126；annalsofneurology，1984，15，49-54；naturereviewsimmunology，2015，15，429-440；lancet，2014，384，1878-1888)。ags综合征患者因含有trex1基因的突变而在细胞质中积累自身dna，可以慢性刺激cgas产生i型干扰素(naturegenetics，2006，38，917-920；procnatlacadsciusa，2015，112，e5699-5705；journalofimmunology，2015，195，1939-1943；cell，2008，134，587-598)。产生的过量干扰素可以引起机体系统性炎症及其他自身免疫反应(currentopinioninrheumatology，2012，24，499-505)。在小鼠中敲除trex1会产生依赖cgas-sting通路的严重的自身免疫反应(procnatlacadsciusa，2015，112；journalofimmunology，2015，195，1939-1943)。这些研究表明抑制cgas可用于治疗自身dna引起的自身免疫疾病。然而，对cgas调控机制理解的匮乏阻碍了有效治疗手段的发现。技术实现要素：本发明的一方面，提供式i所示的乙酸酯类化合物、其药学上可接受的盐或者溶剂合物在制备cgas乙酰化药物中的用途：其中ar为苯基或6,7-二氢-4h-噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基，x为取代或未取代的羰基、取代或未取代的胺酰基、取代或未取代的c1-c8烷基、取代或未取代的酰胺基、羧基，其中含有的取代基选自c1-c6氧烷基、含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基、卤素原子。优选地，当ar为苯基时，式i所述化合物的结构可以由下式ii表示，其中y为氧或者氮原子，r’为氢原子，取代或未取代的c1-c8烷基，其中取代的c1-c8烷基中的取代基选自含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基、c1-c6氧烷基；或者y和r’与连接它们的碳原子一起形成含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基。进一步优选地，当ar为苯基时，式i所述化合物的结构可以由式ii表示，其中y为氧或者氮原子，r’为氢原子，取代或未取代的c1-c3烷基，其中取代的c1-c3烷基中的取代基选自含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基、c1-c3氧烷基。优选地，当ar为6,7-二氢-4h-噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基时，式i所述化合物的结构可以由下式iii表示，其中r”为取代或未取代的c1-c6烷基，其中取代的c1-c6烷基中的取代基选自含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基、卤素原子取代的苯基、c3-c6环烷基取代的羰基。进一步优选地，当ar为6,7-二氢-4h-噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基时，其中r”为取代或未取代的亚甲基或亚乙基，其中取代基选自含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基、卤素原子取代的苯基、c3-c6环烷基取代的羰基。优选地，所述卤素原子选自氟、氯、溴或碘，优选为氟、氯或溴，更优选为氟或氯。优选地，根据本发明的式i所示的化合物选自以下化合物中：本发明的再一方面，提供一种cgas乙酰化药物组合物，其含有作为活性成分的式i所示化合物、其药学上可接受的盐或者溶剂合物，以及药学上可接受的载体。根据本发明的所述cgas乙酰化药物组合物可用于治疗多发性硬化症，红斑狼疮，肿瘤，肝硬化，肺纤维化，以及cgas过度活化的遗传性疾病如aicardi-goutières综合症等疾病。根据本发明的所述cgas乙酰化药物组合物可以制为多种制剂形式，包括但不限于胶囊剂，片剂，注射剂，栓剂，输液剂，搽剂，乳剂等。有益效果本发明首次发现cgas乙酰化可以抑制cgas合成cgamp，进而可以抑制其下游信号通路的激活，从而抑制i型干扰素的产生，具有治疗红斑狼疮、多发性硬化症、牛皮癣等自身免疫疾病、肿瘤、肝纤维化、肺纤维化等疾病的作用，为这些疾病的治疗提供了一种全新机制的治疗策略；本发明提供的式i所示化合物具有乙酰化cgas的功能，具有治疗红斑狼疮、多发性硬化症、牛皮癣等自身免疫疾病、肿瘤、肝纤维化、肺纤维化等疾病的用途。附图说明图1为实施例5中乙酰水杨酸(阿司匹林)乙酰化cgas蛋白质免疫印迹试验(westernblot)图；图2为实施例6中乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制细胞中cgas酶活性的对比图；图3为实施例7中乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制细胞中cgas通路的激活免疫印迹试验(westernblot)图；图4为实施例8中实施例4的化合物和普拉格雷乙酰化cgas蛋白质免疫印迹试验(westernblot)图；图5a和图5b分别为实施例9中实施例4的化合物和普拉格雷抑制cgas酶活性试验对比图。具体实施方式以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。本发明的发明人发现cgas乙酰化可以抑制cgas合成cgamp，进而可以抑制其下游信号通路的激活，从而抑制i型干扰素的产生，具有治疗红斑狼疮、多发性硬化症、牛皮癣等自身免疫疾病、肿瘤、肝纤维化、肺纤维化等疾病的作用。基于该发现，本发明的发明人筛选出由式i表示的化合物，其可以有效地用于cgas乙酰化，进而实现治疗红斑狼疮等疾病的目的。另外根据所述式i表示的化合物在制备cgas乙酰化药物中的用途，本发明开发了新的药物组合物，其中含有作为活性成分的式i所示化合物、其药学上可接受的盐或者溶剂合物，以及药学上可接受的载体。所述“药学上可接受的盐”为式(i)化合物与无机酸或有机酸反应形成的常规的无毒盐。例如，所述常规的无毒盐可通过式(i)化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，以及所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者通式(i)化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者通式(i)化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或者通式(i)化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸和乙磺酸形成的对应的有机酸盐。术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考remington：thescienceandpracticeofpharmacy,21sted.,lippincott,williams&wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位剂量中包含0.05-200mg通式(i)化合物，优选地，制剂配方的单位剂量中包含0.1mg-100mg通式(i)化合物。本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的材料、试剂和仪器等，如无特殊说明，均为市售可得产品。实施例1.2-((2-吗啉乙基)氨酰基)苯酚乙酸酯的合成将乙酰水杨酸(3.6g，20mmol)加入到无水二甲基甲酰胺(50ml)中，加入hobt(8.3g,22mmol),edci(22mmol，4.2g)，然后室温搅拌2小时，加入2-吗啉乙胺(2.9g，20mmol)，保持室温反应过夜。第二天，减压蒸出二甲基甲酰胺，残余物用二氯甲烷萃取100ml×3，合并有机相，用饱和氯化铵水溶液洗涤50ml×3，无水硫酸钠干燥过夜。柱层析(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝3:1～1:1)得到类白色固体5.5g。收率94％。1hnmr(400mhz,dmso-d6):8.80(brs,1h),8.06(d,1h),7.88-7.90(m,2h),7.34(m,1h),3.52-3.54(d,2h),3.60-3.64(m,4h),2.42-2.46(m,6h),2.39(s,3h).实施例2.2-(吗啉-4-酰基)苯酚乙酸酯合成除了反应起始原料不同外，合成方法同实施例1。收率90％。1hnmr(400mhz,dmso-d6):8.06(d,1h),7.88-7.90(m,2h),7.34(m,1h),3.50-3.54(m,4h),3.61-3.64(m,4h),2.39(s,3h).实施例3.2-((2-甲氧基乙基)酰基)苯酚乙酸酯除了反应起始原料不同外，合成方法同实施例1。收率96％。1hnmr(400mhz,dmso-d6):8.06(d,1h),7.88-7.90(m,2h),7.34(m,1h),3.71(d,2h),3.30(s,3h),3.28(d,2h),2.39(s,3h).实施例4.5-(噻吩-2-基甲基)-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基乙酸酯将四氢噻吩并吡啶盐酸盐(3.5g，20mmol)溶于二氯甲烷(30ml)中，加入三乙胺(4.8g，48mmol)，搅拌2小时，加入2-溴甲基噻吩(3.5g，20mmol)，升温至45℃反应6小时。降温至室温，搅拌下加入氯化铵饱和溶液，取有机层，水相用二氯甲烷萃取100ml×3。合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜。柱层析分离，得到淡黄色油状物，将其溶于乙酸乙酯降温至0℃，缓慢滴加盐酸乙酸乙酯溶液，析出白色固体。抽滤，得到3.9g，收率66％。1hnmr(400mhz,dmso-d6):11.8(brs,1h),7.72(d,1h),7.49(d,1h),7.46(d,1h),7.17(m,1h),4.69(s,2h),4.19(s,2h),3.72-3.37(m,2h),3.29-3.09(m,2h)。实施例5.乙酰水杨酸(阿司匹林aspirin)乙酰化cgas试验将体外纯化的cgas重组蛋白质与梯度浓度的阿司匹林(购自北京偶合科技)在hepes(20mm)，ph7.5，mgcl2(5mm)的溶液中37摄氏度共孵育2小时，加入上样缓冲液，沸水煮样10分钟。用免疫印迹法检测cgas乙酰化。通过广谱乙酰化抗体检测，显示cgas的乙酰化有明显的梯度增加。证明阿司匹林可以直接乙酰化cgas。图1为乙酰水杨酸(阿司匹林)乙酰化cgas蛋白质实施例6.乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制cgas合成cgamp试验用pma分化thp1细胞72小时后，加dmso或阿司匹林(4mm)处理细胞24小时。加ht-dna(1μg/ml)，刺激约2小时。刺激结束后，用pbs或者生理盐水将细胞洗2遍。加入800μl冷的萃取溶液(体积比为甲醇:乙腈:水＝40:40:20)，将细胞刮下。将整个萃取液置于冰箱-20摄氏度，静置30分钟。萃取30分钟后，12000rpm，4摄氏度离心10分钟。取上清液，干燥，用lc-ms/mrm检测cgamp。结果显示，阿司匹林处理可以显著抑制细胞中cgamp的合成。图2为乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制细胞中cgas酶活性实施例7.乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制干扰素信号通路激活试验用pma分化thp1细胞72小时后，加dmso或4mm阿司匹林处理细胞24小时。加hsv-1(moi＝10:1)，刺激不同时间点。刺激结束后，用pbs或者生理盐水将细胞洗2遍。用m2细胞裂解液冰上裂解细胞30分钟后，12000rpm，4摄氏度离心15分钟。取上清液，加入上样缓冲液，沸水煮样10分钟。用免疫印迹法检测irf3的磷酸化情况。结果显示，阿司匹林处理可以显著抑制hsv-1刺激引起的细胞中irf3的激活。图3为乙酰水杨酸(阿司匹林)抑制细胞中cgas通路的激活实施例8.5-(噻吩-2-基甲基)-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基乙酸酯(实施例4的化合物)和普拉格雷乙酰化cgas试验将体外纯化的cgas重组蛋白质与5-(噻吩-2-基甲基)-4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶-2-基乙酸酯(实施例4的化合物，0.1mm)或者普拉格雷(0.1mm，购自北京偶合科技)加入到hepes(20mm)ph7.5，mgcl2(5mm)溶液中37摄氏度共孵育2小时，加入上样缓冲液，沸水煮样10分钟。用免疫印迹法检测cgas乙酰化。通过广谱乙酰化抗体检测，显示cgas的乙酰化有显著增加。证明实施例4的化合物和普拉格雷可以直接乙酰化cgas。图4为实施例4的化合物和普拉格雷乙酰化cgas蛋白质实施例9.实施例4的化合物和普拉格雷抑制cgas合成cgamp试验将体外纯化的cgas重组蛋白质与梯度浓度的zhou-0312或者普拉格雷hepes(20mm)ph7.5，mgcl2(5mm)溶液中37摄氏度共孵育2小时。后再加入ht-dna(0.2μg/μl)，atp(2mm),gtp(2mm)37摄氏度共孵育2小时。加入4倍体积的冷的萃取溶液(体积比为甲醇:乙腈＝40:40)。将整个萃取液置于冰箱-2摄氏度，静置30分钟。萃取30分钟后，12000rpm，4摄氏度离心10分钟。取上清，干燥，用lc-ms/mrm检测cgamp。结果显示，实施例4的化合物和普拉格雷可以显著抑制细胞中cgamp的合成。图5a为实施例4的化合物抑制cgas酶活性图5b为普拉格雷抑制cgas酶活性。实施例10.实施例1、实施例2和实施例3的化合物的cgas乙酰化实验实验方法同实施例5，通过比较westernblot乙酰化条带计算乙酰化百分率，结果列于下表1中。表1化合物(1um)乙酰化百分率实施例185％实施例280％实施例395％当前第1页12