5β甾族化合物的脂质体制剂的制作方法

专利名称：5β甾族化合物的脂质体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及能促进脱氢表雄酮(DHEA)和5β甾族化合物向肝脏输送的脂质体制剂。此外，该脂质体制剂还可用于输送在内含水相中的抗肥胖肽或蛋白。
脂质体是具有截留的含水体积的全封闭脂质双层膜。脂质体可以是单层囊(具有单一的双层膜)或多层囊(具有洋葱状结构，其特征为有多个双层膜，每个双层膜均由一个含水层将其和邻近的双层膜分开)。所述双层由两个脂质单层组成，该脂质单层有一个疏水的尾部和一个亲水的头部。所述双层膜结构是这样的脂质单层的疏水的(非极性的)尾部朝向该双层结构的中央，而亲水的头部朝向含水相。
最初由Bangham等(“分子生物学”(J.Mol.Biol.)，13，238-252(1965))制备的脂质体是这样制成的将磷脂悬浮于一种有机溶剂中，并将该混合物蒸干，在容器表面留下一层磷脂薄膜。加入水相，使所得混合物溶胀并用机械方法分散。由上述方法得到的脂质体由多层囊(MLVs)组成。后来，Papahadjopoulos等(“生物化学和生物物理学报”(Biochim.Biophys.Acta.)，13，624-638(1968)通过声处理该混合物制成了小的单层囊。
Cullis等在PCT申请号WO86/00238(1986年1月16日公开)中披露了在加压条件下通过薄膜滤器挤压的LUVETS单层囊，该文献被收作本文的参考。Luvets的直径范围通常为约100NM至500NM。
如在授予Lenk等的美国专利号4,522,803中所定义的，将具有大致均匀的层状溶质分布的脂质体定义为稳定多层囊(SPLV)。Fountain等在美国专利号4,588,578中描述了单相囊。Balley等在PCT公开号87/00043(
公开日为1987年1月15日)中披露了冰冻和解冻的多层囊(FATMLV)，这种囊是通过对囊至少进行一个冰冻和解冻的循环处理而制成的。以上文献被收作本文的参考，用于介绍脂质体的制备和各种用途。
就用于生产脂质体的脂类而言，一般，脂质单层的疏水非极性部分朝向双层的中央，而其亲水部分朝向水相。所述包括了溶于其中的任意物质的水相，可以由双层膜进行部分封闭或全封闭。脂类的例子有磷脂，如磷脂酰胆碱(PG)、卵磷脂酰胆碱(EPG)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、神经鞘磷脂等的单一形式或组合形式、特别是以其碳链的氢化或饱和形式。所述磷脂可以是人工合成的或是源于天然材料。合成的磷脂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油。
Janoff等在美国专利号5,041,287、5,231,112和5,330,689中披露了基于α生育酚双层囊，以上专利均被收作本文的参考。这种囊由α生育酚的有机酸衍生物制成，其可以在水溶液中形成全封闭的双层。
Janoff等在美国专利号5,231,112中披露了用胆甾醇半琥珀酸酯的盐制备脂质体的方法，该专利被收作本文的参考。
现在已经了解看来似乎对哺乳动物的发胖倾向和体重超过正常水平的倾向有影响的肽和蛋白。Y.Zhang等(“自然”(Nature)，372，425(1994))披露了小鼠的重组肥胖(ob)基因蛋白产物及其人体同系物。另外，如T.Murakami和K.Shima(“生物化学和生物物理研究通讯”(Biochemical and BiophysicalResearch Communications)，209(3)，944(1995)披露，明显无突变的大鼠同源基因已被克隆。R.A.Considine等(“临床研究杂志”(Journal of ClinicalInvestigation)，95(6)，2986(1995)披露，从人脂肪细胞的cDNA文库中分离到ob基因的全编码区，而且克隆序列的翻译产生一种蛋白，该蛋白具有正常蛋白的推断氨基酸序列。M.A.Pelleymounter等(“科学”(Science)，269，540(1995))、J.L.Halaas等(“科学”(Science，269，543(1995)和L.A.Campfield等(“科学”(Science)，269，546(1995))披露，当以肠胃外方式向带有ob ob突变的先天性肥胖小鼠给药这种蛋白时，该蛋白具有减轻体重的作用。另外，在ob ob小鼠中，通常明显高于正常的血清胰岛素含量和葡萄糖含量被以与剂量有关的方式明显降低，并且在试验的最高剂量(10mg/kg/日)时，这些含量被正常化至一般在未突变型小鼠中观察到的水平。M.A.Pelleymounter等还披露，可将上述蛋白溶解在pH7.4的磷酸缓冲的盐水中，并通过腹膜内注射方式给药。
甾族脱氢表雄酮(3-β-羟基-雄-5-烯-17-酮，DHEA)及其硫酸盐衍生物是人体的主要甾族肾上腺分泌产物。DHEA在人体内代谢成两种主要的性激素，即睾酮(17-β-羟基-雄-4-烯-3-酮)和雌二醇(雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇)。DHEA的其它代谢产物包括3α-羟基-5β-雄烷-17-酮或α-本胆烷醇酮(αET)和3β-羟基-5β-雄烷-17-酮或β本胆烷醇酮(βET)。这两种物质被视为惰性代谢终产物，其仅缀合成葡糖苷酸或硫酸盐，并被分泌到尿液中。αET是DHEA的一种主要代谢产物，而且，在正常个体内，以每日约3-5mg的量被分泌到尿液中，而βET在人体内是一种次要的代谢产物。
下面将就这些化合物对肥胖和糖尿病的作用作一个总结。Yen等(“脂类”(Lipids)，12，409(1977))披露，以各种方式给药DHEA可以降低遗传性肥胖小鼠品系的增重速度。，而且，根据Coleman等(“糖尿病”(Diabetes)，3180(1982))的论文，DHEA治疗可显著降低遗传性肥胖小鼠和糖尿病小鼠的糖尿病发生，并且观察到摄取DHEA时有最佳效果。Coleman等(Endocrinolegy，115，239(1984))证实，αET和βET降低血糖，提高血浆胰岛素浓度，并对胰腺有保护作用，这一点由小岛β细胞形成颗粒的增加得到证实。另外，在阻止C57BL/KsJ-db/db糖尿病小鼠的糖尿病发病方面，αET和βET(而不是雄酮或表雄酮)的效率为DHEA的4倍。Coleman等在美国专利号4,518,595中证实，甚至在重度糖尿病哺乳动物中，口服DHEA也可把高血糖恢复至正常水平，并改善葡糖耐受性。Coleman等在美国专利号4,507,289中讲述了将αET和βET以及一种雌激素用于治疗糖尿病、肥胖综合症及相关的肾上腺皮质激素过多症的作用。
Coleman(“内分泌学”(Endocrinology)，117，2279(1985))披露，当向食物中补充αET和βET时，其有抗肥胖作用，并能阻止和抑制肥胖的发生，并且在患糖尿病的遗传性肥胖小鼠肥胖之后促进其体重的下降。授予Coleman和Applezweig的美国专利号4,666,898中公开了将本胆烷醇酮用于治疗肥胖、糖尿病及肾上腺皮质激素过多症的其它症状的作用。B.Zumoff等(“肥胖研究”(Obesity Research)，2，13(1994))披露，以4克/日的剂量口服ED能显著减少受治疗的肥胖人的脂肪。在为期20周的随机双盲交换研究中，14位受治疗者在口服5β-雄烷-3，17-二酮或本胆烷二酮(ED)的治疗期间所减少的体重和躯体脂肪的量显著多于在服用空白对照剂期间所减少的体重和躯体脂肪的量。在服用ED期间的平均体重减少量为2.8±5.5kg，相当于每周每100kg躯体脂肪减少0.5±0.91kg。躯体脂肪含量的光密度测定证实，平均体重减少量几乎正好与躯体脂肪的平均减少量相符合。在为期10周的服用ED过程中，平均脂肪减少量大约为原躯体脂肪含量的5％。服用ED无的主观或客观副作用。
授予Bradlow等的美国专利号5,006,517披露，向患有一种由染色体缺陷引起的先天性疾病Prader-Willi综合症的患者给药本胆烷醇酮或本胆烷二酮可以治疗这种疾病，使受治对象的体重减轻或是使体重的增重速度下降。
尽管已知有几种5β甾族化合物能有效控制肥胖及相关的糖尿病和/或肾上腺皮质机能亢进综合症，所述化合物在经口给药时对以上疾病的治疗是有效的。用各种分析方法通过血液含量测定，通过口服途径，5β甾族化合物的吸收量仅为5-15％。因此，大部分所服用的药物根本未被吸收到血液中，而绝大部分服用的药物被排出到粪便中。
为了获得高血清浓度，更有效的给药途径通常是肠胃外给药；然而，业已发现，以这种途径给药5β甾族化合物，不表现任何抗肥胖、抗糖尿病或抗肾上腺皮质机能亢进的活性。因此，最好是有一种制剂，该制剂使能肠胃外给药5β甾族化合物，优选以静脉内注射途径并且会保持这些化合物的抗肥胖、抗糖尿病抗肾上腺皮质机能亢进的活性。因此，可以大大节省取得一定效果所需活性药物的费用。
本发明的一个方面涉及提供一种用于诱导5β甾族化合物或DHEA治疗剂量的肝脏可得性增高的组合物。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗选自下列一组疾病的病症的方法肥胖、糖尿病综合症、与糖尿病相关的肾上腺皮质激素过多症及其组合，以及骨髓抑制症，该方法包括向需要这种治疗的哺乳动物给药一种含有脂质体的脂质体制剂，该脂质体中含有某一剂量的5β甾族化合物或DHEA或其混合物，该剂量的5β甾族化合物或DHEA或其混合物能有效治疗肥胖、糖尿病或肾上腺皮质激素过多症及其组合以及骨髓抑制症。
本发明的再一方面涉及提供一种用于提高抗肥胖肽或蛋白在血液中的含量的组合物。本发明的另一方面涉及提供一种用于治疗肥胖及相关的糖尿病的组合物，该组合物包括一种含有脂质体的脂质体制剂，所述脂质体的脂类部分含有一定量的5β甾族化合物或DHEA或它们的混合物，该用量能有效治疗肥胖、糖尿病或肾上腺皮质激素过多症及其组合，所述质脂体的含水部分含有一定量的能有效治疗肥胖和与肥胖相关的糖尿病的抗肥胖肽或蛋白。
5β甾族化合物是指3α-羟基-5β-雄烷-17-酮或α-本胆烷醇酮(以下称αET)、3β-羟基-5β-雄烷-17-酮或β本胆烷醇酮(以下称βET)和5β-雄烷-3，17-二酮或本胆烷二酮(以下称ED)。此外，该定义还包括上述5β甾族化合物的某些烷基化衍生物。例如，16-烷基化5β雄烷-3-醇-17-酮和16-烷基化-5β-雄烷-3，7-二醇-17-酮(披露于美国专利号4,602,008中，该专利被收作本文的参考)，已证实其作为哺乳动物的抗糖尿病剂、抗肥胖剂和促丝细胞生成剂，在生物学上是有效的。可以用常规方法在甾环结构的第3或7位上将这种化合物酯化。
另外，17酮-5β甾族化合物的其它二醇可由商业渠道购买，并可以用于本发明中，可将连接-OH部分的碳酯化。因此，例如，可由商业渠道购买(Research Plus.Inc.，POB 324，Bayonne，New Jersey 07002 USA)的上述化合物有5β-雄烷-3α，11α-二醇-17-酮、5β-雄烷-3β，11β-二醇-17-酮、5β-雄烷-3α，11β-二醇-17-酮、5β-雄烷-11α-醇-3，17-二酮、5β-雄烷-11β-醇-3，17-二酮、5β-雄烷-3α，16α-二醇-17-酮，视情况而定，可以用常规方法在第11或16位将其酯化，以生成5β甾醇的有机酸衍生物。可以用任何合适的抗衡离子如tris将有机酸衍生物转化成其盐。
“脂质体的脂质部分”是指该脂质体的双层部分，它通常是由一种具有一个疏水端和一个亲水端的分子组成，其中，疏水端在存在有含水介质的情况下通常会自我结合形成双层。在本发明中，脂质体的脂质部分可以由上文所披露的任何脂类组成，如磷脂酰肌醇和神经鞘磷脂，或由类脂化合物组成，如5β甾族化合物的半琥珀酸酯、α生育酚和胆甾醇以及其相应的盐。
“脂质体的含水部分”是指被封入一般为全封闭的双层膜里的含水部分，所述双层膜组成脂质体的脂质部分。如果脂质体是多层的话，它可以有多个封闭或封入的部分，而如果脂体是单层的话，它只有一个密封的部分。
“ob基因的表达产物”是指通常用一种诸如大肠杆菌(E.Coli)之类的重组宿细胞由ob基因或其片段生产的一种蛋白。通常，将上述基因连接在与宿主细胞亲和的一种表达载体上，由该基因产生其mRNA转录物，随后由上述宿主细胞把该转录物翻译或表达成蛋白。通常，用层析法或其它方法对上述蛋白作进一步的加工、重折叠、裂解或纯化，或同时进行上述各种处理。由那些ob基因或其部分编码的具有活性的，如上述进一步加工、重折叠、裂解或纯化的蛋白也被包括在该定义内。
已由Coleman等发现，当给肥胖小鼠肌肉内(im)、腹膜内(ip)或静脉内(iv)注射α和βET时，不会起抗肥胖作用；但口服时上述3种化合物均能起抗肥胖作用。业已知道，经口服以后，口服药物的大部分由肠道血管吸收到血液里，而经肠系膜静脉由肠道流出的大部分血液又经过肝门脉转向至肝脏。因此，本发明人论证了口服αET、βET和ED的生物学活性，而未论静脉内给药或其它肠胃外给药途径的生物学活性，特别论证了5β甾化合物的抗肥胖和抗糖尿病活性主要是由于肝脏对大部分口服后循环至肝脏的药物起作用产生的。与此相反，肠胃外给药后5β甾族化合物的抗肥胖和抗糖尿病活性的缺乏被认为是由于以肠胃外方式给药后仅有较少量5β甾族化合物能进入肝循环。
本发明人发现，将5β甾族化合物以脂质体的一种成分的形式给药，在肠胃外给药后可以增加该化合物到达肝循环的量。本发明的脂质体制剂被网状内皮系统截留(肝脏是该系统的一部分)，随着脂质体的积累，5β甾族化合物富集在肝脏里。类似地，本发明人还发现，将化合物DHEA作为脂质体的一种成分给药也会是有利的。
可以将本发明的5β甾族化合物与组成脂质体的亲脂包膜的脂类混合。一般，这样的脂类是具有疏水的亲脂部分和至少一个亲水端的化合物。这样的脂类的例子有刚性脂类，其中链长约为16个碳原子单位，并且是饱和的。这种脂类的代表为棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱。另外，胆甾醇半琥珀酸酯三(羟甲基)氨基甲烷(CHStris)也是一种刚性脂类，并可用作本发明脂质体的一种成分。
另外，预计上面提到的5β甾族化合物和DHEA的半琥珀酸三(羟甲基)氨基甲烷衍生物也可以起刚性脂类的作用。5β甾族化合物的有活性的其它衍生物也可以与脂质体的脂质部分混合或作为脂质体的一种成分。因此，举例来说披露于美国专利号4,602,008(该专利被收作本文参考)中的16-亚甲基-βET和16-亚甲基-βET棕榈酸也可以用作本发明的脂质体的脂质部分。
或者，可以把不同形式的基于α生育酚的囊用于本发明的制剂中。用常规方法由α生育酚的有机酸衍生物制备α生育酚囊。可用于对α生育酚进行衍生化的有机酸包括羧酸、二羧酸、聚羧酸、羟酸、氨基酸和聚胺酸。所述衍生物可以是上述酸的脂或半酯。另外，能以相应酸的盐的形式来提供所述有机酸或可将其转化成盐。这种盐的形式可以提高相应有机酸的水溶性，从而形成一个较强驱动双层膜的形成的梯度，该双层膜为脂质体的形成所必需。
可溶于水的有机酸可以与α生育酚衍生物一起使用。可溶于水的有机酸有可溶于水的脂族羧酸，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等；可溶于水的脂族二羧酸，如丙二酸、琥珀酸、戊二酸、庚二酸、马来酸等；可溶于水的芳族二羧酸，如苯连三酸、1，3，5-苯三酸、琥珀酰亚胺等；可溶于水的羟酸，如乙醇酸、乳酸、扁桃酸、甘油酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等；以及任一种氨基酸和聚氨基酸。
衍生化α生育酚的盐可以这样制备将α生育酚的有机酸衍生物及所述盐的抗衡离子，如该盐的自由碱溶于一种合适的挥发性溶剂中，然后蒸发除去溶剂，留下由所述有机酸的盐组成的残余物。可以采用的抗衡离子包括，例如，tris、2-氨基-2-甲基-1-3-丙二醇、2-氨基乙醇、双-tris丙烷、三乙醇胺等。
因此，视情况而定，可以用二羧酸(如琥珀酸)将3αET、3βET和DHEA于甾环结构的第3碳原子酯化，酯化以后其余羧酸部分可以是游离的或为其盐。上述5β甾族化合物和DHEA的有机酸衍生物也可以选择性地被包括在组成脂类双层的成分中。
5β甾族化合物，DHEA及其衍生物基本上不溶于水的，并可以通过截留方式将其掺入α生育酚或其它脂质囊中，因为预计3β甾族化合物可以分布到α生育酚双层里。将5β甾族化合物溶于合适的有机溶剂中，然后蒸发，留下该化合物的一层薄膜或残余物。当把预先制备的脂质体的水悬液加入该残余物中时，残余物将被脂质体的脂类双层截留。在这种情况下采用单层囊或脂质体；如果采用多层囊或脂质体，5β甾族化合物仅能被截留于外层，而脂质或α生育酚的内层不含这种生育酚。
通常采用与上述制备α生育酚基脂质体相同的方法制备本发明的组合物，用胆甾醇半琥珀酸酯的tris盐作为脂质包膜，并向其中掺入5β甾族化合物或DHEA或其可溶于水的衍生物。
在所有的现有技术的脂质体中，甾醇类衍生物或α生育酚衍生物不是作为活性剂产生生物作用，而是作为某些其它通常不溶于水的、但有生物活性的化合物的输送工具。例如，授予Janoff等的美国专利5,041,278和5,231,112中都披露了将胆甾醇衍生物和α生育酚来输送不溶于水的抗真菌剂，如咪康唑和伊曲康唑的用途。在本发明中，作为一种有机酸的酯，治疗用的5β甾族化合物是脂质包膜的一个结构部分，而不是作为输送其它化合物的载体。通过把5β甾族化合物及其衍生物同时用作脂质体结构成分和活性剂，可以避免以静脉内注射形式向患者给药其它甾族化合物和甾族化合物衍生物或脂类。由于5β甾族化合物是活性抗肥胖剂，通过避免将其它甾族化合物和脂类作为输送载体的一部分，可以使肥胖患者免受额外循环的脂质含量和甾族化合物影响的健康危害。另外，避免将其它脂类和甾族化合物作为输送载体的一部分，不会人为地提高肥胖患者体内的循环脂水平，使得对上述患者体内脂质含量的监测更容易更准确。
上述脂质体可以用来以多种不同方法在其中截留一种可溶于水的化合物或可部分溶解于水的性化合物或不溶于水的化合物。无论脂质体是基于α生育酚-有机酸(或其盐)的还是胆甾醇半琥珀酸酯(或其盐)的常规脂质双层型，均可采用上述通用方法，其中均可含有分布于其中的5β甾族化合物。同样地，如果脂质体包膜是由5β甾族化合物或5β甾族化合物的衍生物制成，如由预计能形成双层的5β甾族化合物的有机酸酯制成的话，也可以采用上述通用方法。(为了进行说明，一些在上述化合物形成脂质体或类脂结构的双层包膜之后，无论是常规的基于α生育酚(及衍生物)、胆甾醇半琥珀酸基的或是基于5β甾族化合物(和衍生物)的脂质体和类脂结构均被称作“双层”。)在所述囊形成之前，可将分配到双层里的化合物或水可溶性化合物加入水相中，以使在囊形成时将这些化合物截留在其中。另外，可将不溶于水的或脂溶性化合物加入囊形成后的双层囊悬浮液里，在这一情况下，所述化合物已分布到双层中。在另一个实施方案中，可以将一种不溶于水的化合物和一种有机酸衍生物的盐加入一种有机溶剂中，以便溶解两种物质。然后蒸发有机溶剂，留下一层薄膜，其含有均匀分布于双层中不溶于水的化合物。然后，当向该膜中加入含水缓冲液并搅拌时，形成截留不溶于水的化合物的双层囊。然后对这种囊进行声处理，形成单层囊。
当把形成本发明双层囊用于截留不溶于水的生物活性剂或很少溶于水的化合物时，是有利的。就此而言，非5β甾化合物的衍生物可以截留在双层里。因此，在双层囊形成以后可将αET、βET、ED、DHEA各自单独或以其中两种或两种以上的混合物的形式加入双层囊中，以便分配到双层里。另外，可以把αET、βET、ED、DHEA各自单独或以其中两种或两种以上混合物的形式加入含有将要组成双层的化合物的溶剂中。当以蒸发或其它方式除去溶剂时，形成一层薄膜，αET、βET、ED、DHEA或其混合物以均匀分布包含于双层中。在含水缓冲液中进行振动或超声处理之后，形成囊。采用这种方法可以形成α生育酚半琥珀酸酯或胆甾醇琥珀酸酯或常规脂类的双层囊，其中还另外分别含有αET、βET、ED、DHEA或其中两种或两种以上所述5β甾族化合物的混合物。
另外，可以将5β甾族化合物的一种或几种衍生物用于形成本发明囊的双层。具体地讲，可按上述方法生产有机酸和5β甾族化合物的任一种酯，并由此制成双层囊。上述机酸衍生物包括但不限于有机酸与下述化合物的酯5β-雄烷-3α，11α-二醇-17-酮、5β-雄烷-3β，11β-二醇-17-酮、5β-雄烷-3α，11β-二醇-17-酮、5β-雄烷-11α-醇-3，17-二酮、5β-雄烷-11β-醇-3，17-二酮、5β-雄烷-3α，16α-二醇-17酮的酯，其中，所述酯于有机酸与第11或16羟基的碳之间形成。另外，可以用一种有机酸将16-甲基-7-羟基-5β-雄烷-3-醇-17-酮的第7羟基酯化，以产生相应的衍生物。另外，类似的酯可以在有机酸与αET、βET或DHEA第3羟基的碳原子之间形成。有机酸可以是上文中列举的任何有机酸，例如，可将二羧酸琥珀酸酯用于产生相应的5β甾族化合物的半琥珀酸酯衍生物。可以由商业渠道获得的5β甾族化合物的某些有机酸衍生物，其包括但不局限于5β-雄烷-3α-醇-17酮-3-半琥珀酸酯和5β-雄烷-3β-醇-17-酮-3-半琥珀酸酯。
如果将5β甾族化合物的酯衍生物用于形成本发明的囊的双层，可以完全由所述酯衍生物或5β甾族化合物的酯衍生物和其它脂类的混合物或α生育酚或胆甾醇半琥珀酸酯制成该双层。同样，可将由5β甾族化合物任的一种酯衍生物形成的双层用来再包含截留在此双层中的非5β甾族化合物的衍生物。因此，在由5β甾族化合物的酯衍生物组成的双层囊形成之后，可分别将αET、βET、ED、DHEA单独地或以其中两种或两种以上的混合物形式加入囊中，以使其分布到双层中。或者，可分别将αET、βET、ED、DHEA或以其中两种或两种以上的混合物形式加至含有将形成所述双层5β甾族化合物的酯衍生物的溶剂中。当通过蒸发或其它方式除去溶剂形成薄膜时，αET、βET、ED、DHEA或其化合物被以均匀分布来包含于双层中。在含水缓冲液中搅拌或声处理以后形成囊。用这种方法由5β甾族化合物的酯类衍生物形成的双层中还另外分别含有αET、βET、ED、DHEA或这类5β甾族化合物的两种或两种以上的混合物。
另外，所有上述脂质体均可用于在脂质体里包被和包含一种含水相。该含水相中也可以溶解或悬浮有一种治疗剂。在本发明中，所述含水相最好还含有一种可溶于水的有抗肥胖效果的产品。具体地讲，所述蛋白是由小鼠ob基因及其人类的等同基因编码的蛋白产品或其有抗肥胖作用的任何片段，它可溶于磷酸缓冲的盐溶液中，因此可溶于本发明脂质体的水相中。优选在pH7.4条件下使用由ob基因或其人类等同基因编码的蛋白产物。可用常规方法将含有所述蛋白的水相加入单层、多层、LUVET或其它形式的脂质体中。最好是，该方法能使所述水相和所述溶解在于其中的蛋白有大的截留体积。
本发明技术人员应将以下实施例视为本发明的范例，而不是对本发明的限定。
实施例I制备含有αET的脂质体囊A.含有α生育酚半琥珀酸酯和αET的囊1.制备α生育酚半琥珀酸酯的Tris盐将5gα生育酚氢琥珀酸酯(Sigma化学公司，St.Louis，Mo)溶于100ml乙醚中。将Tris碱(Fisher，Fair Lawn NJ.)(1.14g)溶于约50ml水中，然后以0.5ml的各份将其加入上述乙醚溶液中，同时搅拌或振荡。将该溶液旋转蒸干，然后在高真空下进一步干燥，以生成α生育酚半琥珀酸酯的Tris盐。
2.制备胆甾醇半琥珀酸Tris盐将50.3g，0.11摩尔胆甾醇氢琥珀酸酯(ICN，Cleveland Ohio)溶于1.5L乙醚中。将Tris碱(12.1g，0.1摩尔)(Tisher，Fairlawn，N.J.)溶于30ml水中。将Tris溶液加入胆甾醇溶液中，并将所得到的溶液旋转蒸发成湿的乳状残余物。将该残余物冻干12小时，并将胆甾醇半琥珀酸酯Tris盐产物从约5L体积的沸煮乙酸乙酯中进行三次再结晶。
趁热过滤乙酸乙酯溶液，并冷却至室温。通过1000ml的烧结玻板漏斗过滤，产生凝胶状胆甾醇半琥珀酸酯Tris盐，通过挤压和机械压缩除去乙酸乙酯。在0.1mmHg压力下抽真空12小时，进一步除去其它溶剂，得到重约23g的硬脆性白色材料。将所得到的块状物用研钵和研棒粉碎，通过加热至50℃并施加0.1mmHg的真空除去微量的乙酸乙酸。
3.αET的加溶作用将50mgα生育酚半琥珀酸酯Tris盐，50mg胆甾醇半琥珀酸酯Tris盐(按上述方法制备)和20mgαET(Research Plus，Bayonne NJ)加至过量的甲醇中，并在圆底烧瓶中在真空条件下干燥。将所得到的薄膜重悬于1.0ml的10mMTris-HCl缓冲液中，在有玻珠的条件下搅拌，以增强混合直至凝胶形成。对凝胶进行声处理，以形成直径0.2-04微米的囊。
B.含有胆甾醇半琥珀酸酯Tris盐和αET的脂质体囊将100mg胆甾醇琥珀酸酯Tris盐和20mgαET加至过量的甲醇中，并在真空条件下在圆底烧瓶中干燥。将所得到的膜重新悬浮1.0ml的10mMTris-HCl缓冲液里，在有玻珠的条件下搅拌，以增强混合，直至凝胶形成。对凝胶进行声处理，以形成含有IαET的直径为0.2-0.4微米的囊。
实施例II制备含βET的脂质体囊A.含α生育酚半琥珀酸酯和βET的脂质体囊除用20mgβET(Research Plus，Bayonne NJ)取代αET以外，按上述实施例1中步骤A1、A2和A3的方法制备含α生育酚半琥珀酸酯和βET的脂质体囊B.含有胆甾醇半琥珀酸酯和βET的脂质体囊除用20mgβET取代αET以外，按上述实施例1中步骤B的方法制备含有胆甾醇半琥珀酸酯和βET的脂质体囊。
实施例III制备含ED的脂质体囊A.含α生育酚半琥珀酸酯的脂质体囊除用ED(Research Plus，Bayonne NJ)取代αET以外，按上述实施例1中步骤A1、A2和A3的方法制备含α生育酚半琥珀酸酯和ED的脂质体囊。
B.含有胆甾醇半琥珀酸酯和ED的脂质体囊除用20mgED取代了αET以外，按实施例1中步骤B的方法制备含胆甾醇半琥珀酸酯和ED的脂质体囊。
实施例IV制备含αET半琥珀酸酯的脂质体囊A.制备含α生育酚半琥珀酸酯和αET半琥珀酸酯的脂质体囊I.制备5β-雄烷-3α-醇-17-酮3半琥珀酸酯的Tris盐将39g，0.1摩尔5β-雄烷-3α-醇-17-酮-3-半琥珀酸酯(以下称5αET 3-半琥珀酸酯)(Research Plus，Inc.)溶于1.5L乙醚中。将Ths碱(12.1g，0.1摩尔)(Fisher，Fairlawn，N.J.)溶于30ml水中。将Tris溶液加入到5αET-3-半琥珀酸酯溶液中，并将所得到的溶液旋转蒸发成湿的乳状残余物。将该残余物冰冻干燥12小时，并从约5L的沸煮乙酸乙酯中三次再结晶产物5αET 3-半琥珀酸酯Tris盐。
趁热过滤乙酸乙酯溶液，并冷却至室温。产生凝胶状5αET3-半琥珀酸酸酯Tris盐，将其通过一个1000ml的烧结玻板漏斗过滤，并通过挤压和机械压缩除去乙酸乙酯。在0.1mmHg压力下持续12小时，除去其它溶剂，以得到一种重约23g的硬脆的白色材料。用研钵和研棒将所得到的块状物粉碎，通过加热至50℃并施加0.1mmHg的真空除去微量乙酸乙酸。
2.按实施例I中步骤A.1的方法制备α生育酚半琥珀酸酯的Tris盐将50mg按上述方法制成的α生育酚半琥珀酸酯Tris盐和55mgαET半琥珀的酸酯Tris盐加至过量的甲醇中，并在圆底烧瓶中在真空条件下干燥。然后将所得到的膜重悬于1.0ml的10mM Tris-HCl缓冲液中，在有玻珠的条件下搅拌，以增强混合，直至凝胶形成。对该凝胶进行声处理，以形成直径为0.2-0.4微米的囊。
实施例V制备含α生育酚半琥珀酸酯和βET半琥珀酸酯的脂质体囊A.制备5-β-雄烷-3β-醇-17-酮-3-半琥珀酸酯(以下称βET半琥珀酸酯)的Tris盐除用5-β-雄烷-3β-醇-17-酮半琥珀酸酯代表了5β雄烷-3α-醇-17-酮-3-半琥珀酸酯以外，按实施例IV中A1的方法制备βET半琥珀酸酯的Tris盐。
B.制备含α生育酚半琥珀酸酯Tris盐和Bet半琥珀酸酯Tris盐脂质体除用βET半琥珀酸的Tris盐代替了ET半琥珀酸酯的Tris盐以外，按上述实施例IV A2的方法制备α生育酚半琥珀酸酯Tris盐和βET半琥珀酸Tris盐的脂质体。
实施例VI含αET半琥珀酸酯和βET半琥珀酸酯的脂质体囊按实施例IV中A1的方法制备5-β-雄烷-3α-醇-17-酮半琥珀酸酯的Tris盐。
按实施例V中A的方法制备5-β-雄烷-3β-醇-17-酮半琥珀酸酯的Tris盐。
用βET半琥珀酸酯的Tris盐代替了α生育酚的Tris盐，按实施例IV中A2的方法制备含αET半琥珀酸酯的Tris盐和βET半琥珀酸酯的Tris盐的脂质体囊。
实施例VII制备含αET半琥珀酸酯或βET半琥珀酸酯和αET以及βET或ED脂质体囊A.含αET半琥珀酸酯Tris盐和αET或βET或ED的脂质体囊1.αET半琥珀酸酯Tris盐和αET按上述方法制备αET半琥珀酸酯Tris盐。将100mgαET半琥珀酸酯Tris盐和20mgαET加至过量的甲醇中，并在真空条件下在一个圆底烧瓶中干燥。将所得到的膜重悬于1.0ml的10mM Tris-HCl缓冲液中，在有玻珠的条件下搅拌，以增强混合，直至凝胶形成。对凝胶进行声处理，以形成直径为0.2-0.4微米的含αET的囊。
2.αET半琥珀酸酯Tris盐和βET除用βET代替了αET以外，按实施例VII中A.1.的方法制备囊。
3.αET半琥珀酸酯Tris盐和ED除用ED代替了αET以外，按实施例VII中A.1.的方法制备囊。
B.含βET半琥珀酸酯Tris盐以及αET或βET或ED的脂质体囊1.βET半琥珀酸酯Tris盐和αET按上述方法制备βET半琥珀酸酯Tris盐。将100mgβET半琥珀酸酯Tris盐和20mgαET加至过量的甲醇中，并在真空条件下，在圆底烧瓶中干燥。将所得到的膜溶于1.0ml的10mM Tris-HCl缓冲液中，在有玻珠的条件下搅拌，以增强混合，直至凝胶形成。对凝胶进行声处理，以形成直径为0.2-0.4微米的含αET的囊。
2.βET半琥珀酸酯Tris盐和βET按实施例VII B.1.的方法制备囊，不同的是，用βET代替了αET。
3.βET半琥珀酸酯Tris盐和ED除用ED代替了ET以外，按实施例VII B.1.的方法制备囊。
实施例VIII制备含5β甾族化合物、5β甾族化合物的Tris盐和ob基因蛋白的脂质体A.制备ob基因蛋白按M.A.Pellymounter等披露的方法(“科学”(Science)，269，540(1995))制备0b基因蛋白。简单地说，将止于信号序列(nt 178-612)的小鼠和人ob基因的OB-编码序列亚克隆到诸如PET 15b的合适表达载体上，并利用T7 RNA聚合酶系统在E.coli[BL 21(DE3)pIYsS]中进行超量表达。在30℃下让细胞生长至在595nm下的光吸收值为0.7，用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷吡喃糖苷酶诱导过夜，并通过低速离心收集细胞。用3次冰冻解冻循环裂解细胞，并用脱氧核糖核酸酶I消化。对膜进行超声处理并通过洗涤剂加溶萃取，将最终的包含体沉淀溶于6M盐酸·胍，浓度为20mM(pH8.4)中。通过固定化金属亲合层析(IMAC)用一个Ni-离子亲合柱使重组蛋白变性以进行纯化，并用剂量逐渐增加的咪唑洗脱。将纯化的变性OB蛋白存放于9M盐酸.胍，10mM乙酸钠(pH5.0)中，并在室温下用1mM二硫苏糖醇还原1小时。
通过与20％乙二醇、5mM CaCl2、5mM乙酸钠(pH5.0)混合并在室温下温育8-12小时将还原的蛋白复性。复性以后，通过加入Tris至10mM调pH至8.4，并通过凝血酶裂解除去六组氨酸标记。通过IMAC对裂解、复性的蛋白进行再提纯，以便将产物与凝血酶和未裂解的融合蛋白分离。裂解、复性的蛋白被用40mM的咪唑从Ni-离子亲和柱上洗脱，而凝血酶未留下，未裂解的融合蛋白被0.2M的咪唑洗脱。然后浓缩该产物，用100mMEDTA和10mM氰铁酸钾处理，并通过用Pharmacia Superdex 7S 16/80柱进行凝胶过滤作进一步纯化。将纯化的蛋白以0.6mg/ml的浓度溶于磷酸缓冲盐水(pH7.4)中。
制备脂质体按照上述方法制备实施例I-VI中所述的各种脂质体，所不同的是，用含有0.6mg/ml OB蛋白的1.0ml磷酸缓冲盐水(PBS)(pH7.4)代替了1.0ml的10mM Tris-HCl缓冲液。
当给药本发明的脂质体制剂时，5β甾族化合物的平均日剂量大致在约0.1～100mg/kg体重范围内变化，优选在约0.1-10mg/kg体重范围内变化。OB蛋白的量为0.01～10mg/kg。
尽管本文中描述了有或没有OB蛋白的、含5β甾族化合物的脂质体的具体制剂，但本发明人认为，优选以在一种合适的注射载体中含有5β甾族化合物和OB蛋白的肠胃外脂质体组制剂，使用两种活性剂的不同机理以发挥最大优点。
尽管优选也可以用本发明的制剂制备适于口服和增加摄入5β甾族化合物的悬液来以肠胃外途径输送所述组合物，但也可以用本发明的组合物制成悬浮液，这种悬液适于口服并能增加5β甾族化合物的吸收。
尽管本文已描述了脂质体的具体制剂，但其他采用类似和不同脂类或类脂成分的脂质体的制剂也可用于本发明的制剂中，以输送5β甾族化合物，这样做并未违背本发明的实质。
权利要求
1.一种含有脂质体的脂质体制剂，所述脂质体的脂质部分含有能有效治疗肥胖、糖尿病或肾上腺皮质激素过多症及其组合的量的5β甾族化合物。
2.如权利要求1的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是5-β-雄烷-3，17-二酮。
3.如权利要求1的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是3α-羟基-5-β-雄烷-17-酮。
4.如权利要求1的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是3β-羟基-5-β-雄烷-17-酮。
5.如权利要求1的脂质体制剂，其中，所述脂质体的含水部分含有抗肥胖有效剂量的抗肥胖肽或蛋白。
6.如权利要求5的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是5-β-雄烷3，17二酮。
7.如权利要求5的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是3α-羟基-5-β-雄烷，17-酮。
8.如权利要求5的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是3β-羟基-5-β-雄烷，17-酮。
9.如权利要求5的脂质体制剂，其中，所述抗肥胖肽或蛋白是ob基因的表达产物。
10.如权利要求9的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是5-β-雄烷3，17二酮。
11.如权利要求9的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是3α-羟基-5-β-雄烷，17-酮。
12.如权利要求9的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是3β-羟基-5-β-雄烷，17-酮。
13.一种脂质体制剂，其含有一种具有两个羧酸部分的有机酸，所述羧酸部分之一是以酯键与5-β甾族化合物结合，而另一个羧酸部分是游离的或为其盐的形式。
14.如权利要求13的脂质体制剂，其中，所述酯键位于所述5β甾族化合物的第3碳原子上。
15.如权利要求13的脂质体制剂，其中，所述甾族化合物是5β-雄烷3α-半琥珀酸酯-17酮。
16.如权利要求13的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是5-β-雄烷3β-半琥珀酸酯-17酮。
17.如权利要求13的脂质体制剂，其中，所述5β甾族化合物是5-β-雄烷3α-半琥珀酸酯-17酮与5-β-雄烷3β-半琥珀酸酯-17酮的混合物。
18.如权利要求13的脂质体制剂，其中，所述脂质体的含水部分含有抗肥胖有效剂量的抗肥胖肽或蛋白。
19.如权利要求18的脂质体制剂，其中，所述抗肥胖肽或蛋白是ob基因的表达产物。
20.一种含有脂质体的脂质体制剂，所述脂质体的脂质部分含有能有效治疗肥胖、糖尿病或肾上腺皮质激素过多症及其组合的量的DHEA。
21.如权利要求20的脂质体制剂，其中，一种有机酸具有两个羧酸部分，所述羧酸部分之一通过酯键与DHEA结合，而另一个羧酸部分是游离的或为其盐的形式。
22.如权利要求21的脂质体制剂，其中，所述脂键位于DHEA的第3碳原子上。
23.如权利要求22的脂质体制剂，其中，所述DHEA是雄烷-3β半琥珀酸酯-17-酮。
24.如权利要求22的脂质体制剂，其中，所述脂质体的含水部分含有抗肥胖有效剂量的抗肥胖肽或蛋白。
25.如权利要求24的脂质体制剂，其中，所述抗肥胖肽或蛋白是ob基因的表达产物或其抗肥胖活性片段。
26.如权利要求1的组合物，其中，所述5β甾族化合物的用量是在每一剂为约1～1000mg的剂量范围内。
27.如权利要求26的组合物，其中，所述DHEA的用量是在每一剂为约1～1000mg的剂量范围内。
28.一种药用组合物，其含有权利要求1的组合物和一种可以药用的载本或稀释剂。
29.一种药用组合物，其含有权利要求23的组合物和一种可以药用的载体或稀释剂。
30.一种用于治疗选自肥胖、糖尿病综合症、与糖尿病相关的肾上腺皮质激素过多症及其组合以及骨髓抑制症的一种疾病的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物给药含有脂质体的脂质体制剂，所述脂质体的脂质部分含有某一剂量的5-β甾族化合物，该剂量能有效治疗肥胖、糖尿病或肾上腺皮质激素过多症及其组合以及骨髓抑制病。
31.一种用于治疗选自肥胖、糖尿病综合症、与糖尿病相关的肾上腺皮质激素过多症及其组合以及骨髓抑制症的一种疾病的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物给药含有脂质体的脂质体制剂，所述脂质体的脂类部分含有某一剂量的DHEA，该剂量能有效治疗肥胖、糖尿病或肾上腺皮质激素过多症及其组合以及骨髓抑制病。
全文摘要
本申请描述了脂质体制剂,其含有一种脂类或类脂化合物,以及5β甾族化合物、DHEA,或者含有5β甾族化合物或DHEA的有机酸衍生物。该脂质体也可以包括截留的含水部分,该截留的含水部分含有溶于其中的ob基因表达产物。还要求了用这种脂质体制剂治疗包括肥胖、肾上腺皮质激素过多症和糖尿病在内的疾病的方法。
文档编号A61P3/08GK1173815SQ96191876
公开日1998年2月18日 申请日期1996年9月27日 优先权日1995年10月12日
发明者约瑟夫·鲁宾费尔德, 埃利奥特·L·法恩曼 申请人:萨珀根公司