118]本发明的复合载药体系实现对大分子蛋白类药物的高活性装载及pH控制释放，解决了大分子蛋白类药物的装载与定点释放难题，为这类药物提供新的给药途径，避免了口服、注射等传统给药方式带来的高毒副作用，且该复合载体具有很好的生物相容性能。
[0119]本发明中，大分子蛋白药物是相对于小分子药物，如相对于地塞米松(分子量392)等而言，指的是分子量在5X 13?2X10 5g/mol之间的蛋白药物。
[0120]制备方法
[0121]本发明的复合载体的制备方法包括以下步骤:
[0122](a)将3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接到所述羧甲基壳聚糖的分子链上得到复合物；
[0123](b)步骤a)得到的复合物与介孔二氧化硅反应，所述羧甲基壳聚糖经3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷接枝到所述介孔二氧化硅的表面，得到所述复合载体。
[0124]当制备本发明的复合载药体系时，将大分子蛋白类药物装载于所述介孔二氧化硅，然后再与步骤a)得到的复合物反应，得到复合载药体系。
[0125]在一优选实施方式中，制备方法包括如下步骤:
[0126](i)将羧甲基壳聚糖分子分散在水中，其表面用3-缩水甘油醚三甲氧基硅烷进行改性；
[0127](ii)表面改性后的羧甲基壳聚糖分子和大介孔二氧化硅在中性溶液中反应，即得到复合支架。
[0128]在另一优选例中，所述中性溶液选自:中性去离子水。
[0129]根据本发明，所述大介孔二氧化硅可以通过本领域常规方法进行制备，如通过控制反应体系溶液的pH值，采用溶胶-凝胶法制备，所述溶胶-凝胶法采用的模板剂为非离子型表面活性剂。同时使用扩孔剂，所述扩孔剂为高分子有机化学扩孔剂。
[0130]本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0131]本发明的有益之处在于:
[0132](I)提供一种新型结构和组合的药物控释载体。
[0133](2)构建出一种新型的pH响应型合载药体系。
[0134](3)该体系不但具有优异的生物相容性能，并且具有高效的药物装载及释放效率，尤其是对于大分子蛋白类药物，克服了传统介孔硅基载体孔道尺寸上的局限，为大尺寸的蛋白类药物的装载及响应型定点释放提供了新的选择。
[0135]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0136]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0137]评价方法
[0138]材料的表征
[0139]采用JEM-2100型透射电子显微镜(JE0L，日本)观察材料的微观结构。
[0140]采用ASAP2010型全自动粉体分析仪(Micromeritics，美国)进行氮气等温吸附-脱附测定，分析材料的微孔结构。
[0141 ] 通过BET计算材料的比表面积。
[0142]根据Barrett-Joyner-Helen(BJH)等效圆柱模型法计算材料孔容和平均孔径。
[0143]采用Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Electics，美国)对材料中特定的分子结构进行分析研宄，扫描范围为4000-400011'
[0144]体外蛋白释放评价
[0145]选择牛血清白蛋白BSA(分子量:67000D)，辣根过氧化氢酶HRP(分子量:40000D)以及骨形态发生蛋白BMP-2 (分子量:26000D，分子尺寸:7nmX3.5nmX3nm)为模型蛋白，在不同pH条件下，对合成的纳米pH响应型羧甲基壳聚糖/大介孔二氧化娃复合材料的蛋白释放性能进行测试。
[0146]取1.5ml离心管，将一定量已负载BSA(HRP或BMP-2)的纳米pH响应型羧甲基壳聚糖/大介孔二氧化硅复合材料分散于ImL磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH为6.0或7.4)，将释放体系置于37°C恒温震荡箱中，震荡速度设定为lOOrpm。
[0147]另取塑料瓶装等量的载药介孔二氧化硅纳米粒子作为对照组。
[0148]释放至少持续72h。
[0149]在每个特定时间点，将该释放体系离心，并取出0.2mL上清液收集，同时向原释放体系中补加0.2ml PBS,并再次放入恒温震荡箱中。
[0150]使用BCA试剂盒测定蛋白的浓度(每个取样点20微升)，以时间为X轴，吸光度为Y轴作图。
[0151]体外生物性能评价
[0152]a、MTT细胞毒性测试
[0153]选择BMSCs骨髓间充质干细胞为模型，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)测试所制备纳米复合材料的细胞毒性。
[0154]将纳米复合材料在120°C高温处理30分钟，保证完全灭菌处理。处理好的材料以lmg/ml的浓度分散在细胞培养液中。将BMSCs细胞以每孔约1.0X 104/ml培养基细胞浓度接种于24孔培养板里，于37°C恒温、5% CO2中培养24小时后，去除培养基并用PBS清洗两次，分别加入Iml含特定浓度材料的培养液(100及200 μ g/mL)，培养I天，3天和5天。
[0155]培养结束后，向每孔加入100 μ L的四甲基偶氮唑盐试剂，37°C继续孵育4小时后，吸弃上清液，加入1000 μ L DMSO,轻轻震荡20min，使结晶物溶解，从中吸取100 μ L的溶液到96孔板中，使用连续光谱酶标仪在492nm处测定溶液的光吸收值。
[0156]b、BMP_2的蛋白活性检测
[0157]BMP-2在体外细胞试验中具有促进BMSCs骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。BMP-2的蛋白活性可以通过BMSCs的碱性磷酸酶活性(ALP)来定量检测。具体步骤如下:
[0158]消化细胞并计数，使细胞(BMSCs)以5 X 14/孔的密度接种在96孔板上，于37°C、5% CO2的培养箱培养I天，并用PBS清洗两次。将从缓释溶液中收集的BMP-2以0.2 μ g/mL的浓度分散在细胞培养液中。以原BMP-2溶液配成0.2 μ g/mL的浓度作为阳性对照组，另外做5组空白样作为阴性对照组，加入200 μ I培养液。同时接2块板置于37°C、5% CO2的培养箱培养4天、7天。
[0159]培养结束后，小心吸掉培基，用PBS润洗一次，每孔加入50 μ I ΝΡ-40 (细胞裂解液)，置于37°C恒温震荡箱lh。每组的5个平行样中，分别从每个孔中吸取2 μ I (共10 μ I)清液于一块新的96孔板中，并加入10 μ I PBS，以及200 μ I BCA试剂，置于37°C恒温箱中30min，使用酶标仪在562nm下测OD值，计算总蛋白量。
[0160]同时，向细胞裂解液中100 μ I/孔，2.5%的PNPP-Na ALP底物显色液，避光置于37°C恒温箱中lh。最后加入100 μ I/孔，0.1M NaOH终止显色反应，用酶标仪测定波长为405nm 的 OD 值。
[0161]通过以下公式计算碱性磷酸酶活性，进而比较释放前后的BMP-2蛋白活性。
[0162]ALP = OD值/时间/总蛋白含量(mg)
[0163]实施例1
[0164]N，O-羧甲基壳聚糖(NOCC)的合成
[0165]称取1g壳聚糖(分子量3X 105g/mol，脱乙酰度90% )粉末，在室温搅拌下加入到盛有10ml异丙醇的500ml三口烧瓶中，然后将25ml浓度为10mol/L的NaOH均分为5份，在25min内分别加入到烧瓶中，加入完毕后继续搅拌30min。
[0166]搅拌结束后，称取60g —氯乙酸，分成5份，每隔一分钟向烧瓶中加入一份。
[0167]加料结束后，将体系温度升高至60°C，继续反应3h。
[0168]反应终止，将得到的产物过滤，并用无水甲醇清洗滤出物，于60°C真空干燥，得到黄色固体物(分子量3X105g/mol，脱乙酰度90% )。下文中标记为N0CC。
[0169]从图1中可以看出，壳聚糖在1654.δαιΓ1处显示出-NH 2弯曲振动峰，而NOCC在1632.8CHT1出现-C00-基团的显著吸收峰，说明NOCC分子中在氨基位成功引入了羧基基团。二者都在波数1089(31^1和1030CI!!—1处显示出吸收峰，分别代表了二级羟基吸收峰(-CH-0H)和一级羟基吸收峰(-CH2-OH)。
[0170]由于二级羟基基团不受羧甲基改性的影响，因此可以通过计算一级羟基峰和二级羟基峰的强度比值(-ch2-oh/-ch-oh)说明是否发生了羧甲基化反应。通过计算发现，NOCC的比值由CTS的比值0.965降低为0.829，从而说明发生了羧甲基化反应，即在羟基位引入了羧基基团，成功制得羧甲基改性壳聚糖N0CC。
[0171]实施例