一种双模式成像功能复合材料的制备方法及其抗肿瘤活性的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料制备及其生物应用领域，特别涉及一种具有肿瘤双靶向、双模式成像、双重治疗的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]碳纳米管是由单层或多层石墨片卷曲而成的石墨管状晶体，内径一般为几个纳米左右，长度可达微米级，长径比较大，可看成一维的量子线。根据碳纳米管中碳原子层数的不同，可将其分为单壁碳纳米管(SWNT )和多壁碳纳米管(MWNT )两类。SWNT是由单层碳原子绕合而成的，结构具有较好的对称性与单一性；MWNT是由许多柱状碳管同轴套购而成的，形状像个同轴电缆。碳纳米管因其特殊的一维管状结构，高的比表面积，较强的吸附能力，管壁易进行表面修饰或功能化等特点，许多无机、有机和生物大分子可以共价或非共价地结合于碳纳米管的内外壁表面。在CNTs上修饰金属、金属氧化物和半导体纳米粒子，形成以CNTs为模板的纳米复合物，这些基于碳纳米管的一维复合材料具有更加优异的物理和化学特性，广泛用作催化剂、传感器和抗肿瘤生物材料。
[0003]磁性纳米复合物在药物递送、肿瘤治疗和磁共振成像等领域有着广阔的应用前景。FePt纳米材料是一种典型的磁性材料，具有较高的居里点、化学稳定性以及磁晶各向异性等，其无序结构具有出色的超顺磁性，在生物医学领域具有广泛的应用前景。超顺磁FePt在生物医学领域的的应用主要包括三个个方面:高灵敏度磁性分离及生物分子检测、磁共振成像造影剂以及作为新型化疗药物用于癌症治疗。利用FePt纳米材料的超顺磁性进行造影功能的尝试，FePt纳米粒子的r2弛豫效率大于氧化铁和四氧化三铁。FePt纳米粒子的磁性大于氧化铁纳米粒子，和铁、钴纳米粒子的磁性接近，良好的磁性使其有作为磁共振造影剂的潜力。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种实现双靶向、双模成像诊断、双重治疗的特异性诊疗功能纳米粒子及其制备方法，该方法操作简单、反应条件温和，碳纳米管复合材料抗肿瘤效果好，具有靶向肿瘤功能，且具有双模式成像的特性。
[0005]本发明的一种具有双模式成像功能的复合材料的制备方法及其抗肿瘤活性，所述复合材料通过EDC/NHS化学将聚乙二醇(PEG)、叶酸(FA)、荧光素(FITC)偶联到复合材料表面，合成复合材料集靶向、双模成像诊断和双重治疗一体的具有生物相容性的“诊疗”功能。
[0006]本发明的一种具有双模式成像功能的复合材料的制备方法，包括:
选用36 mL四甘醇为溶剂和还原剂，加入羧基化碳纳米管(CNTs，25 mg)、与0.15 gFeCl2、0.2 g H2PtCl6、0.15 g NaOH的混合物，超声混匀I h，在260°C，通氮气的条件下回流I h，12000 rpm，离心30 min，收集材料，三次水洗涤材料，制备带羧基的FePt/CNTs纳米复合材料。产物溶解于PBS缓冲溶液中(pH=7)。
[0007]通过EDC/NHS化学在复合材料表面键合氨基化的PEG衍生物，获得FePt/CNTs-PEG-NH2。FePt/CNTs溶解于PBS缓冲液，加入氨基化PEG，EDC/NHS (摩尔比1:2)，超声10 min，室温磁力搅拌。反应产物，利用超滤管，在12000rpm，离心20 min，三次水洗涤。
[0008]以FePt/CNTs-PEG-NH2m米材料为研宄对象，EDC/NHS化学将荧光素(FITC)偶联到复合材料表面，FePt/CNTs耦联FITC，结合FePt的超顺磁性，实现对肿瘤细胞的双模可视化(荧光+MRI)。FITC溶于二甲基亚砜，加入复合材料，超声30 min，加入EDC/NHS，室温反应 12 ho
[0009]EDC/NHS化学将叶酸(FA)偶联到复合材料表面，FePt/CNTs耦联FA，结合FePt的磁靶向，实现对肿瘤细胞的双靶向(FA+Fe)。FA溶于二甲基亚砜，加入复合材料，超声30min钟，加入EDC/NHS，室温反应12 h。产物透析，得到FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料。
[0010]一种具有双模式成像功能的复合材料的抗肿瘤活性实验的方法:
(l)FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料溶解于PBS缓冲液，与肿瘤细胞孵育2 h。用培养液稀释DCFH-DA，细胞六孔板的加入稀释好的DCFH-DA，体积为I毫升。37°C细胞培养箱内孵育20 min，验证其抗肿瘤机制。
[0011]所述步骤(I)中所述FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料中Fe浓度为20、60、lOOM-g/ml ο
[0012]所述步骤(I)中PBS缓冲溶液的pH值为7。
[0013](2) FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料与肿瘤细胞孵育24 h，抽提DNA。检测细胞DNA损伤，样品材料扰乱DNA的正常双螺旋结构使局部变性失活，并且造成了 DNA的断裂。
[0014]所述步骤(2)中所述FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料中Fe浓度为20、60、100
Mg /ml ο
[0015](3)将FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料对两种细胞进行检测，验证其靶向性。
[0016]所述步骤(3)中所述细胞实验FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料里Fe的浓度为
20 M-g /ml ο
【附图说明】
图1为实施例1制备的FePt/CNTs纳米材料的TEM图；
图2为实施例2所得的FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料对肿瘤细胞的激光共聚焦显微镜检测结果图；
图3为实施例3所得的FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料对肿瘤细胞的ROS检测结果图；
图4为实施例4所得的FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料对肿瘤细胞的DNA Ladder结果图；
图5为实施例5所得的FePt/CNTs-PEG-FA-FITC纳米材料对肿瘤细胞的半致死浓度检测结果图。
【主权项】
1.一种具有肿瘤双靶向、双模式成像、双重治疗的FePt/CNTs纳米复合材料，其特征在于:为了增加其水溶性，通过EDC/NHS化学在复合材料表面键合氨基化的PEG衍生物，获得FePt/CNTs-PEG-NH2，FePt/CNTs 溶解于 PBS 缓冲液，加入氨基化 PEG，EDC/NHS(摩尔比 1:2)，超声10 min，室温磁力搅拌；反应产物，利用超滤管，在12000 rpm，离心20 min，三次水洗涤。
2.—种如权利要求1所述的具有肿瘤双靶向、双模式成像、双重治疗的FePt/CNTs纳米复合材料的制备方法，其特征在于:以FePt/CNTs-PEG-NH2m米材料为研宄对象，EDC/NHS化学将荧光素(FITC)偶联到复合材料表面，FePt/CNTs耦联FITC，结合FePt的超顺磁性，实现对肿瘤细胞的双模可视化(荧光+MRI) ;FITC溶于二甲基亚砜，加入复合材料，超声30min，加入EDC/NHS，室温反应12 h。
3.根据权利要求2所述的一种具有肿瘤双靶向、双模式成像、双重治疗的FePt/CNTs纳米复合材料的制备方法，其特征在于:EDC/NHS化学将叶酸(FA)偶联到复合材料表面，FePt/CNTs耦联FA，结合FePt的磁靶向，实现对肿瘤细胞的双靶向(FA+Fe) ；FA溶于二甲基亚砜，加入复合材料，超声30 min,加入EDC/NHS，室温反应12 h，产物超滤，得到FePt/CNTs-PEG-FA-FITCo
4.根据权利要求3所述的一种具有肿瘤双靶向、双模式成像、双重治疗的FePt/CNTs纳米复合材料在作为抗肿瘤药物载体中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种对肿瘤能够实现双靶向、双模成像诊断、双重治疗的特异性诊疗功能纳米粒子。选用四甘醇为溶剂和还原剂，在260℃的条件下回流羧基化碳纳米管（CNTs）与FeCl2、H2PtCl6、NaOH的混合物，制备了高质量的FePt/CNTs。EDC/NHS化学将聚乙二醇（PEG）、叶酸（FA）、荧光素（FITC）偶联到复合材料表面，合成复合材料集靶向、双模成像诊断和双重治疗一体的“诊疗”功能。纳米复合材料在肿瘤细胞内诱导肿瘤细胞凋亡机制，并诱导形成活性氧（ROS）。本发明的新型载药材料具有双靶向、双模成像诊断、双重治疗的特异性，可以用于抗肿瘤研究，有着很好的实用价值。
【IPC分类】A61K49-12, A61P35-00, A61K49-08, A61K47-34, A61K49-00, A61K47-04
【公开号】CN104587475
【申请号】CN201510022267
【发明人】陈卫红, 郑秀文, 温馨
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月16日