L-23R以剂 量依赖的方式抑制Bcl-XL表达。
[0021] 图5B:IL-23R介导的HeLa细胞凋亡也和内在线粒体途径密切相关。利用 anti-cytochrome c, anti Apaf-1, anti caspase 9 和 anti-caspase 3 抗体进行蛋白印迹 分析。内参为β-肌动蛋白。在图5A和5B中，以β-肌动蛋白为标准，利用Quantity One 软件计算每条带的相对强度。
[0022] 图6A : IL-23R抑制了 293ET细胞中的有丝分裂信号通路。利用抗体anti ERK, anti-p-ERK, anti STATl，anti-p-STATl, anti Akt 和 anti-p-Akt 进行蛋白印迹分析。 转染的Myc-IL-23R通过anti Myc抗体检测。内参为β-肌动蛋白。
[0023] 图6Β :IL-23R抑制了 293ΕΤ细胞中的有丝分裂信号通路。利用抗体anti STAT3 和anti-p-STAT3进行蛋白印迹分析。内参为β-肌动蛋白。在图6A和6B中，以β-肌动 蛋白为标准，利用Quantity One软件计算每条带的相对强度。
[0024] 图7A:过量表达IL-23R改变了 HeLa细胞中的信号通路。蛋白印迹检测 p-ERK，ERK，STAT3以及P-STAT3的表达。内参为β -肌动蛋白。
[0025] 图7Β:过量表达IL-23R改变了 HeLa细胞中的信号通路。蛋白印迹检测 p-Akt，Akt，p-STATl和STATl的表达。内参为β -肌动蛋白。在图7Α和7Β中，以β -肌动 蛋白为标准，利用Quantity One软件计算每条带的相对强度。
[0026] 图8A至图8B :利用半定量RT-PCR检测加入外源性IL-23R后，293ET细胞（图8A) 和HeLa细胞（图8B)中内源性IL-23 α和IL-12 β 1的表达。
[0027] 图8C至图8D :利用蛋白印迹检测IL-23R转染的293ΕΤ细胞（图8C)和HeLa细胞 (图8D)中内源性IL-12RM的表达。数据至少代表两次独立的转染实验。内参为β-肌 动蛋白，利用Quantity One软件计算每条带的相对强度。
[0028] 图8E :显示随着IL-23R转染的增加，培养液中IL-23配体的表达水平呈现显著下 降，说明在HeLa细胞中转染IL-23R并不能促进IL-23配体的分泌。
[0029] 图9A和图9B :IL-23R可诱导A549细胞的凋亡。
[0030] 图10A和图10B :IL-23R对胰腺癌细胞SW1990的促凋亡作用不明显。
【具体实施方式】
[0031] 1.细胞系、抗体和载体
[0032] 表达SV40T和EBNAl的人胚肾细胞系（293ET)、人宫颈癌细胞系（HeLa)(细胞中 心，北京协和医学院基础医学研宄所）；小鼠 anti-Myc抗体、兔anti-caspase 3抗体、小 鼠 anti β -肌动蛋白抗体、兔anti_STAT3抗体、兔anti-p-STAT3抗体、山羊anti-Aktl/2 抗体、兔 anti-p-Akt 1/2/3 抗体、兔 anti-ERKl 抗体、兔 anti-p-ERK 抗体（Santa Cruz，CA，USA);兔 anti-cytochrome C 抗体、兔 anti-PARPl 抗体（Epitomics, Inc, USA);兔 anti-Apafl 抗体（Biosynthesis Biotechnology，北京）；rabbit anti-STATl 抗体、rabbit anti-p-STATl抗体（Bioworld，USA);辣根过氧化物酶标记的二抗（中杉，北京）；人IL-23R 全长cDNA分离自PBMC的总RNA(Zhang，X. Y等人，2006)，之后亚克隆到pCMV-Myc载体的 Sall/Kpnl位点，构建成真核表达载体pCMV-Myc-IL-23R，该载体序列已通过DNA序列分析 得到证实。
[0033] 2.细胞培养与转染
[0034] 用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，置于37°C恒温箱（5% CO2)。利用 Vigofect转染试剂将目的质粒DNAs瞬时转染细胞。连续培养48h后收获细胞，进行下一步 实验。
[0035] 3. Cell-Counting Kit-8 (CCK-8)检测细胞增殖
[0036] 利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。培养细胞至浓度达到5 X IO4个/mL，转染细胞 24h、48h或72h后，将细胞转移到96孔板，并向每孔加入一定量的cck-8试剂。继续培养 2. 5h后，用酶标仪检测450nm处的吸光度。
[0037] 4.流式细胞仪分析
[0038] 利用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况。转染48h后，收获细胞并 用预冷的I XPBS洗绦，之后用50 μ L结合缓冲液重悬细胞。加入5 μ LAnnexin V-FITC和 5 yL Propidium Iodide (PI)，室温下避光反应15min。加入另外150 yL结合缓冲液，混勾 后上机检测（Accuri C6)。
[0039] 5. Caspase 3/7 检测
[0040] 利用Caspase-Glo 3/7检测试剂盒分析Caspase-3/7活性。转染48h后，收获细 胞并用预冷的IXPBS洗涤。转移细胞至96孔板，每孔各加入适量的Caspase-Glo 3/7试 剂。室温下孵育lh。光度计检测每孔信号强度。
[0041] 6.反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)
[0042] TRIzol法提取细胞总RNA。表1列出了 RT-PCR反应的引物。选用PrimeScript One Step RT-PCR kit (Takara Biotechnology, Dalian, China)，内参为 β-肌动蛋白。反
【主权项】
1. 人白细胞介素23受体在制备用于治疗哺乳动物中癌症的药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症选自：食道癌、肺癌、急性骨髓性白血病、 食管鳞状细胞癌、慢性B细胞恶性肿瘤、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、喉癌、肝癌、胰腺癌、黑色素 瘤、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、舌癌、皮肤癌、骨肉瘤、淋巴瘤、脑瘤、白血 病、神经母细胞瘤、胶质瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症选自：宫颈癌、胰腺癌、喉癌、肝癌、肺癌、 前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述人白细胞介素23受体的氨基酸序列如 Genebank登录号NM_144701. 2所示。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物选自：基因疗法药物、重组蛋白、重组多 肽、单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物为表达IL-23R或其衍生物的重组病毒表 达载体。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物选自：人、小鼠、大鼠。
【专利摘要】本发明涉及人白细胞介素23受体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。通过过量表达IL-23R，可以明显诱导293ET和HeLa细胞的凋亡。IL-23R过表达激活了Caspase3和Caspase9，同时增加了细胞色素C的释放。IL-23R均显著抑制了RAS/MAPK和STAT3通路，但对STAT1和PI-3K/Akt通路无明显影响，显示了IL-23R作为治疗靶点在抵抗人类肿瘤方面的应用。
【IPC分类】A61K48-00, A61K39-395, A61K38-00, A61P35-00
【公开号】CN104689342
【申请号】CN201410729249
【发明人】刘力, 石炜业
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年12月3日