工程化的三维结缔组织构建体及其制备方法
【专利说明】工程化的三维结缔组织构建体及其制备方法 相关申请的夺叉引用
[0001] 本申请要求2012年6月19日提交的美国申请序列号61/661，768的权益，并且是 2013年3月13日提交的美国申请序列号13/801,780的继续申请，二者均通过引用整体并 入本文。
【背景技术】
[0002] 医疗行业面临着许多紧迫的问题。截至2012年6月，有114, 636名患者因需要器 官移植而在器官分享联合网络（United Network for Organ Sharing，UNOS)上登记。根据 UNOS，在2012年I月至3月之间，只进行了 6, 838例移植。与进行的移植相比，每年有更多 的患者加入UNOS名单，导致等待移植的患者人数净增长。
[0003] 此外，一种新的药物化合物的研发成本约为18亿美元。参见Paul等（2010). How to improve R&D productivity:the pharmaceutical industry's grand challenge， Nature Reviews Drug Discovery 9(3) :203_214。药物发现是发现和/或设计药物的过 程。药物发现的过程通常至少包括以下步骤：确认候选物、合成、表征、筛选和分析治疗效 果。虽然在技术上和对生物系统的了解上有所进展，但药物发现仍旧是一个冗长、昂贵且低 效的过程，且新治疗剂发现率较低。
【发明内容】
[0004] 在一方面，本文公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体，其包含：彼此凝聚以 提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织构建细胞；其中该构建体基本不含预形成的支 架。在一些实施方案中，该构建体在使用时基本不含预形成的支架。在一些实施方案中，该 构建体是不受神经支配的。在一些实施方案中，该结缔组织细胞包含在体外源自多能细胞 的结缔组织细胞。在一些实施方案中，该多能细胞包含以下一种或多种：组织特异性祖细 胞、间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该 多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在 又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在构建 体的制造之前将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制 造期间将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制造之后 将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该构建体是生物打印的。在 进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物 打印的适用性。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施 方案中，所述构建体进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤 维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。在一些实施方案中，该构建体基本上是片、块 (patch)、环、管、立方体、多面体或球体的形式。在一些实施方案中，该构建体基本上是模拟 天然人类结缔组织在体内的形状或架构的形状的形式。在一些实施方案中，该构建体用于 植入受试者的损伤、病变或退化部位。在一些实施方案中，该构建体进一步包含一种或多种 离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中 创建间隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迀移和向内生长。
[0005] 在另一方面，本文公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体的阵列，每种构建体 均通过包括以下步骤的过程来制造：将多能细胞暴露于一种或多种分化信号以提供活的三 维结缔组织构建体；其中每种结缔组织构建体基本不含预形成的支架；其中每种结缔组织 构建体均在培养物中保持。在一些实施方案中，每种构建体在使用时基本不含任何预形成 的支架。在一些实施方案中，每种构建体均是不受神经支配的。在一些实施方案中，所述多 能细胞包含以下一种或多种：组织特异性祖细胞、间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能 干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实 施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、 非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在构建体的制造之前将多能细胞暴露于一种或多种 分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制造期间将多能细胞暴露于一种或多种分化信 号。在一些实施方案中，在构建体的制造之后将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在 一些实施方案中，每种构建体均是生物打印的。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、 软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，所述构建体进一步包含下列细胞类型中的一种或多 种：内皮细胞、成纤维细胞、干细胞/祖细胞、周细胞、卫星细胞或血管细胞。在一些实施方 案中，一种或多种结缔组织构建体是包含一种或多种结缔组织的复合组织构建体。在进一 步的实施方案中，一种或多种结缔组织构建体是包含结缔组织和非结缔组织的复合组织构 建体。在更进一步的实施方案中，一种或多种结缔组织构建体是包含骨组织和非结缔组织 的复合组织构建体。在一些实施方案中，所述阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中， 该阵列用于以下一种或多种：药物发现、药物检测、毒理学检测、疾病建模、三维生物学研宄 和细胞筛选。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理 信号，或它们的组合。在一些实施方案中，一种或多种构建体进一步包含一种或多种离散的 填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间 隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迀移和向内生长。
[0006] 在另一方面，本文公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，其包括：孵育包含 已沉积到支持体上并暴露于一种或多种分化信号的多能细胞的生物墨水，从而允许该生物 墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30 天。在一些实施方案中，该多能细胞包含以下一种或多种：间充质干细胞/基质细胞、诱导 的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在 其他实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非 脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在将生物墨水沉积到支持体上之前约1-21天 至将生物墨水沉积到支持体上之后约1-21天之间的一个或多个时间间隔时，将结缔组织 细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，生物墨水通过生物打印而沉积。在 一些实施方案中，所述构建体在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中， 该构建体是不受神经支配的。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。 在一些实施方案中，生物墨水进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细 胞、成纤维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。在一些实施方案中，生物墨水进一步 包含挤出化合物。在一种实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或 物理信号，或它们的组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括沉积一种或多种离散的填 料体的步骤，每种填料体均包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中 创建间隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迀移和向内生长。 在一些实施方案中，该方法进一步包括通过将构建体在空间上限制在生物相容性表面之上 或之内而将多个活的三维结缔组织构建体组装为阵列的步骤。在一些实施方案中，该构建 体适合于植入受试者的损伤、病变或退化部位。
[0007] 在另一方面，本文公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法包括以下 步骤：制备包含多能细胞的生物墨水；将生物墨水沉积到支持体上；并孵育生物墨水以允 许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至 约30天；条件是将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该多能细胞 包含下列一种或多种：间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一 些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实施方案中，该多能细胞源自哺 乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施 方案中，在将生物墨水沉积到支持体上之前约1-21天至将生物墨水沉积到支持体上之后 约1-21天之间的一个或更多时间间隔时，将结缔组织细胞暴露于一种或多种分化信号。在 一些实施方案中，该生物墨水通过生物打印而沉积。在一些实施方案中，所述构建体在使用 时基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。在一 些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，所述生物墨水 进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、干细 胞/祖细胞、免疫细胞。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含挤出化合物。在一种实 施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理信号，或它们的组合。在 一种实施方案中，该方法进一步包括沉积一种或多种离散的填料体的步骤，每种填料体均 包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在进一步 的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迀移和向内生长。在一些实施方案中，该方法 进一步包括通过将构建体在空间上限制在生物相容性表面之上或之内而将多个活的三维 结缔组织构建体组装为阵列的步骤。在一些实施方案中，该构建体适合于植入受试者的损 伤、病变或退化部位。
【附图说明】
[0008] 在所附权利要求书中详细阐明了本发明的新颖特征。通过参考以下对其中利用了 本发明原理的说明性实施方案加以阐述的发明详述和附图，将会获得对本发明特征和优点 的更好的理解，附图中：
[0009] 图1示出了干细胞分化的非限制性示例性时程；在这种情况下，分化的时程表明 分化前、围分化（peri-differentiation)、分化后阶段，其中干细胞与成骨分化培养基相接 触而被孵育。
[0010] 图2A是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的图像；在这种情况下，示 出了在分化培养基中培养的生物打印的MSC构建体的原位碱性磷酸酶染色。该图证明了暴 露于分化培养基的构建体中碱性磷酸酶的表达。
[0011] 图2B是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的图像；在这种情况下，示 出了在基础MSC培养基中培养的生物打印的MSC构建体的原位碱性磷酸酶染色。在暴露于 基础MSC培养基的构建体中未观察到碱性磷酸酶的表达。
[0012] 图2C是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的20x显微照片；在这种情 况下，生物打印的MSC构建体在打印后立即在分化培养基中培养并使用茜素红S进行染色 以识别钙沉积物。
[0013] 图2D是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的20x显微照片；在这种情 况下，生物打印的MSC构建体在打印后立即在基础MSC培养基中培养并使用茜素红S进行 染色。在暴露于基础MSC培养基的构建体中未观察到钙沉积物。
[0014] 图3是在生物打印后在分化培养基中孵育5天后，福尔马林固定、石蜡包埋的MSC 构建体的组织切片免疫荧光染色的非限制性显微照片，检测骨桥蛋白的表达，其指示MSC 分化和骨生成。
[0015] 图4A和4B是示出了含有间充质干细胞的构建体的20x显微照片，该构建体是生 物打印的并在成骨分化培养基或仅在基础间充质干细胞培养基中培养的。利用生物打印的 构建体的组织学碱性磷酸酶染色来检测成骨细胞活性。图4A显示在仅暴露于基础间充质 干细胞培养基的构建体中没有或几乎没有碱性磷酸酶的表达。而图4B显示了在暴露于成 骨分化培养基的构建体中碱性磷酸酶的表达。 发明详沭
[0016] 在2008年初，有75,834人登记需要肾脏；在该年年底，这个数字已经增长到 80,972。当年进行了 16, 546例肾脏移植，但该名单中增加了 33, 005名新的患者。UNOS登 记需要肾脏的患者在2008年的移植率为20%。等待名单中的患者的死亡率为7%。此外， 许多个体患有移植并不是其当前的医疗模式的慢性退行性疾病。因此，活的功能性结缔组 织（骨、腱、韧带等）将具有巨大的临床价值。对促进再生医学和组织工程技术应用于缓解 对可植入组织和器官的迫切需求的材料、工具和技术存在需求。更具体地说，对适用于创伤 修复、组织修复、组织增大、器官修复和器官置换的可植入组织和器官存在需求。同样重要 的是，对能大大增加创新的、成本有效的新药的数量和质量而不造成不可持续的研宄和开 发成本的材料、工具和技术存在需求。
[0017] 先前的模型集中在通过将细胞接种到三维支架材料上来提供工程化的组织构建 体，该三维支架材料是预形成的并且成形为适应预期应用。接种到支架材料上的细胞曾经 是原代细胞、细胞系、工程化细胞和/或干细胞/祖细胞。当利用多能干细胞或祖细胞时， 它们或者在接种到三维支架材料上之前在二维单层培养中经历分化程序，或者首先被接种 到支架材料上并随后在原位或在体外经历分化程序以产生期望的组织。就细胞产率、细胞 在构建体内进行终末分化所需的时间以及所得三维结构的总细胞性而言，传统方法既费力 又低效。
[0018] 本发明涉及再生医学和组织工程学领域。更具体地说，本发明涉及活的三维结缔 组织构建体、其阵列和制造方法。结缔组织构建体可用作可植入/治疗装置，或作为用于体 外实验（即，药物开发、化合物筛选、毒理学和疾病建模）的阵列化组织构建体。
[0019] 在某些实施方案中，本文公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体，其包含：彼 此凝聚以提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织细胞；其中该构建体基本上不含预形成 的支架。
[0020] 在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体阵列，每种 构建体均通过包括以下步骤的过程来制造：将多能细胞暴露于一种或多种分化信号以提供 活的三维结缔组织构建体；其中每种构建体基本上均不含预形成的支架；其中每种结缔组 织均在培养物中保持。
[0021] 在某些实施方案中，本文还公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法 包括：孵育包含已沉积在支持体上并暴露于一种或多种分化信号的多能细胞的生物墨水， 从而允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1 小时至约30天。
[0022] 在某些实施方案中，本文还公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法 包括以下步骤：制备包含多能细胞的生物墨水；将生物墨水沉积到支持体上；并孵育生物 墨水以允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约 1小时至约30天；条件是将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。 某_宙义
[0023] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的相同的含义。如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式"一 个"、"一种"和"该"包括复数的指代，除非上下文另有明确规定。本文中任何提及的"或" 意在包括"和/或"，除非另有说明。
[0024] 如本文中使用的，"阵列"是指一种科学工具，其包括多个空间排布的元件的关联 (association)，以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或 兼具两者。
[0025] 如本文中使用的，"分析（assay)"是指测试或测量物质（例如化学品、分子、生物 化学品、蛋白质、激素或药物等）在有机或生物样品（例如细胞聚集体、组织、器官、生物体 等）中的存在或活性的程序。
[0026] 如本文中使用的，"生物相容性的（biocompatible) "是指对细胞造成伤害或毒性 的风险有限。如在说明书和权利要求书中所呈现的，"生物相容性多孔容器"和"生物相容 性膜"对哺乳动物细胞造成伤害或毒性的风险有限，但该定义并未延伸到隐含了这些生物 相容性元件可以被体内植入到哺乳动物体中。
[0027] 如本文中使用的，"生物打印"是指：经由与自动化的、计算机辅助的三维原型装置 (例如生物打印机）相匹配的方法，利用细胞（例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、 细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等）的三维精确沉积。
[0028] 如本文中使用的，"凝聚（cohere) "、"凝聚的（cohered) "和"凝聚（cohesion) "是 指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。这些 术语可以与"融合（fuse)"、"融合的（fused)"和"融合（fusion)"互换使用。
[0029] 如本文中使用的，"多能细胞"是指能够经历分化成为两种或更多种细胞类型的细 胞。多能细胞包括，例如，间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。
[0030] 如本文中使用的，"间充质干细胞/基质细胞"是指多能细胞的具体类型，其潜在地 分化成多种细胞类型并表现出本文中进一步描述的性质和特征。在一些实施方案中，术语 "间充质干细胞"和"间充质基质细胞"可与"间充质干细胞/基质细胞"互换使用。
[0031] 如本文中使用的，"支架"是指：合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非 合成的支架，例如预形成的细胞外基质层和脱细胞的组织；以及任何下述其他类型的预 形成的支架：其对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是重要的，并且不能在不损 坏/破坏组织和/或器官的情况下从该组织和/或器官中除去。因此，术语"无支架的 (scaffoldless)"意在隐含了在使用时，支架不是工程化组织整体的一部分，或者已经被除 去或者作为工程化组织的惰性组分而保留。"无支架的（Scaffoldless)"可以与"不含支架 的（scaffold-free) "和"不含预形成的支架的"互换使用。
[0032] 如本文中使用的，"受试者"是指可为人、非人的动物、任意哺乳动物或任意脊椎动 物的任意个体。该术语可以与"患者"、"接受者"和"供体"互换。
[0033] 如本文中使用的，"组织"是指细胞的聚集体。组织的实例包括但不限于：结缔组织 (例如，网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织）、肌肉组织（例 如，骨骼肌、平滑肌和心肌）、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组 织（例如，单层上皮和复层上皮）、外胚层组织、内胚层组织或中胚层组织。 组织工稈化
[0034] 组织工程化是一个跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理进行 生物替代品的开发，该生物替代品通过器官的增大（augmentation)、修复或替换来恢复、保 持或改善组织功能。经典组织工程学的基本方法是将活细胞接种到生物相容且最终可生物 降解的环境（例如支架）中，随后在生物反应器中培养该构建体，以使得初始细胞群体可进 一步扩充和成熟，以在植入后生成目标组织。采用模拟该生物细胞外基质（ECM)的适当支 架，发育中的组织在体外和体内成熟之后可获取所需器官的形式和功能。然而，由于控制细 胞在整个支架上的分布和空间布置的能力有限，达到足够高的细胞密度并具有类似于天然 组织的架构是具有挑战性的。这些限制可导致组织或器官具有较差的机械性能和/或不足 的功能。在支架的生物降解性、残留聚合物的夹杂和制造工艺的工业规模化方面，存在额外 的挑战。已经尝试了无支架的方法。目前的无支架方法受到数种限制： ?复杂的几何形状（例如多层结构，其中各层包含不同的细胞类型或包含在空间上受 限制的特定细胞区室）可能需要将细胞类型在特定的架构中进行明确的、高分辨率的放 置，以便可再现地获得类似于天然组织的结果。 ?规模和几何形状受到扩散和/或营养供给需要功能性血管网络的限制。 ?组织的存活力可受到限制材料的损害，该限制材料限制了扩散并限制细胞获得营养 物。
[0035] 在某些实施方案中，本文公开了工程化组织、工程化结缔组织构建体、其阵列以及 制造方法。本文公开的组织工程化方法具有下列优点： ?它们能使用大量复杂的三维拓扑学产生包含细胞的组织和/或器官。 ?它们通过利用发育生物学的原理来模拟天然组织形成过程的环境条件。 ?它们与自动化制造手段相匹配，并且是可规模化的。
[0036] 生物打印使得能够改善生成包含细胞的可植入组织的方法，所述可植入组织可用 于组织修复、组织增大和组织替换。生物打印进一步使得能够改善生成微小规模组织类似 物（包括对体外分析有用的那些）的方法。 牛物打印
[0037] 在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）及其阵列的至少一种组 分是生物打印的。在进一步的实施方案中，工程化组织整个是生物打印的。在更进一步的实 施方案中，生物打印的构建体是采用使用了快速原型技术的方法制成的，该快速原型技术 是基于通过三维递送装置（例如生物打印机）将细胞和任选的限制材料向生物相容性表面 (例如由水凝胶和/或多孔膜构成的）上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积，该细胞包括 细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的