nual of Basic Techniques 中，对于这些信息通过引用将其内容并入本文。在Doyle, A. ,Griffiths, J.B.，Newell, D. G·，（编）Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)中也描述了可 与本发明一起使用的普通哺乳动物细胞培养技术、细胞系和细胞培养系统，对于这些信息 通过引用将其内容并入本文。
[0065] 适合于培养中的哺乳动物细胞的生长条件是本领域公知的。细胞培养基通常包含 必需营养物和任选的附加成分，例如生长因子、盐、矿物质、维生素等，它们可根据所培养的 细胞类型而选择。可选择特定的成分来加强细胞生长、分化和特定蛋白质的分泌等。通常， 标准的生长培养基包括Dulbecco改良Eagle培养基，低葡萄糖（DMEM)，其含有110mg/L丙 酮酸盐和谷氨酰胺，补充有10-20%的胎牛血清（FBS)、牛血清或人血清并且lOOU/ml青霉 素、0. lmg/ml链霉素是适当的，如同本领域技术人员公知的各种其他标准培养基。优选地， 细胞在无菌条件下、在1-21% O2和优选3-5% 0)2的气氛中、在接近或处于细胞来源动物体 温的温度下培养。例如，人类细胞优选在约37°C下培养。关于间充质干细胞/基质细胞，合 适的培养基包括在补充有L-谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM中含有5-10% (v:v)胎牛血清的 基础培养基。任选地，间充质干细胞/基质细胞在氧张力小于21 %氧气（相当于大气氧张 力）的条件下培养和扩充。在一些实施方案中，细胞在3-5%氧气条件下培养。
[0066] 细胞也可使用细胞分化剂来培养，以诱导细胞沿着所需线路分化。例如，在一些实 施方案中，干细胞与分化培养基相接触地孵育以产生一系列的细胞类型。许多类型的分化 培养基是合适的。在各个实施方案中，干细胞与分化培养基相接触地孵育，作为非限制性 的实例，该分化培养基包括成骨分化培养基、成软骨分化培养基、成脂分化培养基、神经分 化培养基、心肌细胞分化培养基和肠细胞分化培养基（例如，肠上皮）。关于间充质干细胞 /基质细胞，在一些实施方案中，该细胞与分化培养基相接触地孵育，作为非限制性的实例， 该分化培养基包括成骨分化培养基、成软骨分化培养基或成脂分化培养基。
[0067] 此外，细胞可与生长因子、细胞因子等一起培养。在一些实施方案中，术语"生长 因子"是指蛋白质、多肽或多肽的复合物，包括细胞因子，它们是由细胞产生的，并且可影响 其自身和/或多种相邻的或远处的其他细胞。一般而言，生长因子或者发育性地或者响应 于众多生理学或环境刺激影响特定类型的细胞的生长和/或分化。一些但不是全部生长因 子是激素。示例性的生长因子是胰岛素、胰岛素样生长因子（IGF)、神经生长因子（NGF)、 血管内皮生长因子（VEGF)、角质形成细胞生长因子（KGF)、成纤维细胞生长因子（FGF，包括 碱性FGF (bFGF))、血小板衍生生长因子（PDGF，包括TOGF-AA和TOGF-AB)、肝细胞生长因子 (HGF)、转化生长因子a (TGF- α )、转化生长因子β (TGF- β，包括TGF β 1和TGF β 3)、表皮 生长因子（EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、 白细胞介素 _6(IL-6)、IL-8 等。除了其他地方外，在 Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell 等人编，1986 ;Principles of Tissue Engineering,第二 版，Lanza等人编，Academic Press, 2000中讨论了生长因子。本领域技术人员将会理解： 在本文描述的条件培养基中的任何及所有培养衍生的生长因子都在本发明的范围内。 牛物墨水和多细朐聚集体
[0068] 在某些实施方案中，本文公开了包含生物打印的细胞的组织（包括结缔组织构建 体）、其阵列和方法。在一些实施方案中，通过从生物打印机沉积或挤出生物墨水来对细胞 进行生物打印。在一些实施方案中，"生物墨水"包括包含多个细胞的液体、半固体或固体组 合物。
[0069] 在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞 浓缩物。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体的多细胞聚集体或多细胞体。在 进一步的实施方案中，通过如下步骤产生生物墨水：1)以预先确定的比例，将多个细胞或 细胞聚集体与生物相容性液体或凝胶混合，以形成生物墨水；和2)使该生物墨水致密化， 以产生具有所需细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，通过离心作用、切向流过 滤（"TFF"）或其组合来实现生物墨水的致密化。在一些实施方案中，生物墨水的致密化产 生了可挤出的组合物，从而允许形成多细胞聚集体或多细胞体。在一些实施方案中，"可挤 出的"意指能够通过被迫（例如在压力下）穿过喷嘴或孔口（例如，一个或多个洞或管）而 成形。在一些实施方案中，生物墨水的致密化是由细胞生长到合适的密度而引起的。该生 物墨水所需的细胞密度会随着所使用的细胞和要产生的组织或器官而变化。在一些实施方 案中，该生物墨水的细胞是凝聚和/或粘附的。在一些实施方案中，"凝聚（cohere) "、"凝 聚的（cohered) "和"凝聚（cohesion) "是指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的 层结合起来的细胞-细胞粘附性质。在一些实施方案中，该术语可以与"融合（fuse) "、"融 合的（fused)"和"融合（fusion)"互换使用。在一些实施方案中，该生物墨水另外包含支 持材料、细胞培养基、细胞外基质（或其组分）、细胞粘着剂、细胞死亡抑制剂、抗凋亡剂、抗 氧化剂、挤出化合物和它们的组合。
[0070] 在各个实施方案中，所述细胞是任何合适的细胞。在进一步的各个实施方案中，所 述细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。在一些实施方案中，所述 细胞包括干细胞。在进一步的实施方案中，该干细胞是人类干细胞。在一些实施方案中，所 述细胞包括间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该间充质干细胞/基质细 胞是人类间充质干细胞/基质细胞。在一些实施方案中，本文所公开的方法中使用的细胞 类型依赖于所产生的构建体或组织的类型。在一些实施方案中，所述生物墨水包含一种细 胞类型。在一些实施方案中，所述生物墨水包含超过一种细胞类型。 细胞培养基
[0071] 在一些实施方案中，所述生物墨水包含细胞培养基。该细胞培养基是任何合适的 培养基。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的细胞培养基包括：Dulbecco磷 酸盐缓冲盐水、Earle平衡盐、Hanks平衡盐、Tyrode盐、Alsever溶液、Gey平衡盐溶液、 Kreb' s-Henseleit改良缓冲系、Kreb' s-Ringer碳酸氢盐缓冲系、Puck盐水、Dulbecco改 良Eagle培养基、Dulbecco改良Eagle培养基/营养F-12Ham、营养混合物F-IOHam(Ham's F-10)、培养基199、基本必需培养基Eagle、RPMI-1640培养基、Ames培养基、BGJb培养基 (Fitton-Jackson 改良）、Click 培养基、CMRL-1066 培养基、Fischer 培养基、Glascow 基本 必需培养基（GMEM)、Iscove 改良 Dulbecco 培养基（MDM)、L-15 培养基（Leibovitz)、McCoy 5A改良培养基、NCTC培养基、Swim S-77培养基、Waymouth培养基、William培养基E或它 们的组合。在一些实施方案中，该细胞培养基得到改良或补充。在一些实施方案中，该细胞 培养基进一步包含白蛋白、硒、转铁蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因 子、激素、抗生素、脂质、脂质载体、环糊精或其组合。在一些实施方案中，该细胞培养基是干 细胞分化培养基。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，该干细胞分化培养基是成 骨分化培养基、成软骨分化培养基或成脂分化培养基。 细胞外基质
[0072] 在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含细胞外基质或其衍生物的一种或多 种组分。在一些实施方案中，"细胞外基质"包括由细胞产生并从细胞中转运到细胞外隙内 的蛋白质，在细胞外隙中它们可作为支持体将组织保持在一起、提供拉伸强度和/或促进 细胞信号传导。细胞外基质组分的实例包括但不限于：胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、透 明质酸盐、弹性蛋白和蛋白聚糖。例如，多细胞聚集体可含有多种ECM蛋白质（例如，明胶、 纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或蛋白聚糖）。可将 ECM组分或ECM组分的衍生物加入到用于形成多细胞聚集体的细胞糊中。加入到细胞糊中 的ECM组分或ECM组分的衍生物可从人类或动物源纯化，或者通过本领域已知的重组方法 产生。或者，该ECM组分或ECM组分的衍生物可由伸长细胞体中的细胞自然分泌，或者可通 过任何本领域已知的合适方法对用于形成该伸长细胞体的细胞进行遗传操作，以改变一种 或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基底粘附分 子（例如，选择素、整合素、免疫球蛋白和粘附素）的表达水平。ECM组分或ECM组分的衍生 物可促进细胞在多细胞聚集体中的凝聚。例如，可将明胶和/或纤维蛋白原适当地加入到 细胞糊中，该糊料用于形成多细胞聚集体。随后可通过加入凝血酶将纤维蛋白原转变为纤 维蛋白。
[0073] 在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含促进细胞粘附的试剂。
[0074] 在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含抑制细胞死亡（例如，坏死、凋亡或 自体吞噬）的试剂。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抗凋亡剂。抑制细胞死 亡的试剂包括但不限于：小分子、抗体、肽、肽体或它们的组合。在一些实施方案中，抑制 细胞死亡的试剂选自：抗-TNF剂、抑制白细胞介素活性的试剂、抑制干扰素活性的试剂、 抑制GCSF(粒细胞集落刺激因子）活性的试剂、抑制巨噬细胞炎性蛋白活性的试剂、抑制 TGF-B(转化生长因子B)活性的试剂、抑制MMP(基质金属蛋白酶）活性的试剂、抑制胱天 蛋白酶活性的试剂、抑制MAPK/JNK信号级联活性的试剂、抑制Src激酶活性的试剂、抑制 JAKCJanus激酶）活性的试剂或它们的组合。在一些实施方案中，该生物墨水包含抗氧化 剂。 挤出化合物
[0075] 在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含挤出化合物（即，改变生物墨水的 挤出性质的化合物）。挤出化合物的实例包括但不限于：凝胶、水凝胶、表面活性剂多元醇 (例如Pluronic F-127或PF-127)、热响应性聚合物、紫外线响应性聚合物、透明质酸盐、藻 酸盐、细胞外基质组分（及其衍生物）、明胶、胶原、肽水凝胶、其他生物相容性天然或合成 聚合物、纳米纤维和自组装的纳米纤维。
[0076] 凝胶，有时被称作胶状物，已经以各种方式进行了定义。例如，《美国药典》将凝胶 定义为由小无机粒子组成的悬浮液或被液体互相渗透的大有机分子组成的半固体体系。凝 胶包括单相或两相体系。单相凝胶由均勾分布在整个液体中的有机大分子组成，其分布方 式使得在分散的大分子和液体之间不存在明显的边界。某些单相凝胶是由合成大分子（例 如卡波姆）或由天然树胶（例如西黄蓍胶）制备的。在一些实施方案中，单相凝胶通常是 水性的，但是也可以利用醇和油来制备。两相凝胶由小离散粒子的网络组成。
[0077] 凝胶也可被分类为亲水的或疏水的。在某些实施方案中，疏水凝胶的基质由液体 石蜡与聚乙烯，或用胶态二氧化硅胶凝的脂肪油，或铝或锌皂组成。相反，亲水凝胶的基质 一般由水、甘油或用合适的胶凝剂（例如，西黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧基乙烯基聚合 物和硅酸镁铝）胶凝的丙二醇组成。在某些实施方案中，本文中公开的组合物或装置的流 变学是假塑性、塑性、触变性或膨胀性的。
[0078] 适宜的水凝胶包括衍生自胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及 其组合的水凝胶。在其他实施方案中，适宜的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案 中，适宜的水凝胶包括衍生自聚（丙烯酸）或其衍生物、聚（环氧乙烷）及其共聚物、聚 (乙烯醇）、聚磷腈及其组合的水凝胶。在多个具体实施方案中，限制材料选自：水凝胶、 NovoGel?、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel?、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚（异丙基正 聚丙烯酰胺）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙 烯酰胺、聚（乳酸）、硅、丝、肽水凝胶或它们的组合。
[0079] 在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆的凝胶（也称为热响应性 凝胶或热凝胶）。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在室温下不是液体。在具体实施 方案中，合适的水凝胶的胶凝温度（Tgel)为约10°C、约15°C、约20°C、约25°C、约30°C、约 35°C和约40°C，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约10°C至约 25°C。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水（例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型 和其他添加剂等）在室温下不是液体。在具体的实施方案中，本文所述的生物墨水的胶凝 温度（Tgel)为约10°C、约15°C、约20°C、约25°C、约30°C、约35°C和约40°C，包括其中的增 量。在某些实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel为约10°C至约25°C。
[0080] 当引入水溶液中时，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯组成的聚合物形成热可逆的凝 胶。在可被保持在生物打印机设备中的温度下，这些聚合物具有从液态变为凝胶态的能力。 该液态至凝胶态的相变取决于聚合物的浓度和溶液中的成分。
[0081] 泊洛沙姆407 (Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物组 成的非离子表面活性剂。其他泊洛沙姆包括188 (F-68级）、237 (F-87级）、338 (F-108级）。 泊洛沙姆的水溶液在酸、碱和金属离子的存在下是稳定的。PF-127是通式E106P70E106的 可商购的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩尔质量。该聚合物 可采用增强聚合物的胶凝性质的合适的方法进一步纯化。它含有大约70%的氧化乙烯，这 解释了它的亲水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一种。PF-127具有良好的增溶 能力、低毒性，因此被认为是合适的挤出化合物。
[0082] 在一些实施方案中，通过任何所述的手段来测量本文中提出的水凝胶和生物墨水 的粘度。例如，在一些实施方案中，采用LVDV-II+CP Cone Plate粘度计和Cone Spindle CPE-40来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其他实施方案中，采用Brookfield (轴和杯） 粘度计来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，本文中提及的粘度范围是在 室温下测量的。在其他实施方案中，本文中提及的粘度范围是在体温下（例如，在健康人的 平均体温下）测量的。
[0083] 在进一步的实施方案中，该水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有约500至 1，000, 000 厘泊、约 750 至 1，000, 000 厘泊、约 1000 至 1，000, 000 厘泊、约 1000 至 400, 000 厘泊、约2000至100, 000厘泊、约3000至50, 000厘泊、约4000至25, 000厘泊、约5000至 20, 000厘泊或约6000至15, 000厘泊的粘度。
[0084] 在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞和适合于连续生物打印的挤出化合物。 在具体实施方案中，该生物墨水具有约1500mPa*s的粘度。Pluronic F-127和细胞材料的 混合物可适合于连续生物打印。这样的生物墨水可通过以下步骤制备：通过在冷（4°C )磷 酸盐缓冲盐水（PBS)中连续混合48小时溶解Pluronic F-127粉末至30% (w/vhPluronic F-127也可溶解在水中。可采用标准无菌细胞培养技术培养和扩充细胞。例如可将该细胞 在200g下沉淀，并重悬浮在30% Pluronic F-127中，并抽吸到附着在生物打印机上的储存 器中，可使之在该储存器中在约KTC至约25°C的胶凝温度下凝固。在生物打印之前生物墨 水的胶凝是任选的。生物墨水，包括包含Pluronic F-127的生物墨水，可作为液体来分配。
[0085] 在各个实施方案中，Pluronic F-127的浓度可以是具有合适的粘度和/或细胞毒 性的任意值。Pluronic F-127的合适的浓度也可以能够在生物打印时支撑重量同时保持 其形状。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约10%、约15%、约20%、约25%、 约30%、约35%、约40%、约45%或约50%。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度 为约30 %至约40%，或者约30 %至约35%。
[0086] 在一些实施方案中，在使用之前除去生物墨水的非细胞组分（例如，挤出化合物 等）。在进一步的实施方案中，非细胞组分例如是：水凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚 合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原或其他生物相容性天然或合成聚合物。在更进一步的实施 方案中，通过物理、化学或酶手段除去非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时，一部分非 细胞组分仍与细胞组分相关联。
[0087] 在一些实施方案中，预处理细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在生物墨水成 形之前增强细胞-细胞相互作用，可在离心之后在离心管内孵育细胞。 示例性的细胞比例
[0088] 在一些实施方案中，所述生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含间充质 干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步 包含间充质干细胞/基质细胞和一种或多种其他细胞类型。在更进一步的实施方案中，该 生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含间充质干细胞/基质细胞和内皮细胞、成 纤维细胞，或内皮细胞和成纤维细胞两者。
[0089] 在一些实施方案中，使用任何合适的间充质干细胞/基质细胞与其他细胞类型的 比例制备生物墨水。例如，在一些实施方案中，使用约5 :1至约20 :1的间充质干细胞/基 质细胞与内皮细胞的比例制备生物墨水。在多个进一步的实施方案中，间充质干细胞/基 质细胞与内皮细胞的比例为约5 :1、约6 :1、约7 :1、约8 :1、约9 :1、约10 :1、约11 :1、约12 : 1、约13 :1、约14 :1、约15 :1、约16 :1、约17 :1、约18 :1、约19 :1或约20 :1，包括其中的增 量。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约9 :1。
[0090] 进一步举例来说，在一些实施方案中，使用约5 :1至约20 :1的间充质干细胞/基 质细胞与成纤维细胞的比例制备生物墨水。在多个进一步的实施方案中，间充质干细胞/ 基质细胞与成纤维细胞的比例为约5 :1、约6 :1、约7 :1、约8 :1、约9 :1、约10 :1、约11 :1、 约 12 :1、约 13 :1、约 14 :1、约 15 :1、约 16 :1、约 17 :1、约 18 :1、约 19 :1 或约 20 :1，包括其 中的增量。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与成纤维细胞的比例为约 9 :1〇 细胞的自分选
[0091] 在一些实施方案中，用于形成构建体或组织的多细胞聚集体包含将要包括在工程 化组织中的所有细胞类型（例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等）；在这样的实例 中，每种细胞类型迀移到合适的位置（例如，在成熟期间），以形成工程化组织，如结缔组织 构建体。在其他实施方案中，用于形成结构的多细胞聚集体包含比将要包括在工程化组织 中的所有细胞类型要少的细胞类型。在一些实施方案中，每种类型的细胞均匀分布在多细 胞聚集体中，或组织的区域或层中。在其他实施方案中，每种类型的细胞定位在多细胞聚集 体内的特定区域或组织的层或区域内。 分化信号
[0092] 在一些实施方案中，本文公开了包含彼此凝聚的结缔组织细胞的工程化组织及其 阵列，其中该结缔组织细胞源自多能细胞。本文还公开了包含彼此凝聚的多能细胞的工程 化组织及其阵列，其中该多能细胞已暴露于一种或多种分化信号。在各个实施方案中，多能 细胞已暴露于，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多 种分化信号。 分化信号的类型
[0093] 在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械或物理信号，包括它 们的组合。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，机械、生物机械或物理信号包括 拉伸、弯曲、压缩、增加的大气压、由流体流动引起的剪切力以及它们的组合。
[0094] 在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括化学或生物化学信号，包括它们的 组合。在进一步的实施方案中，作为非限