制性的实例，化学或生物化学信号包括暴露于营养 物、激素、生长因子或化学剂。
[0095] 在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括在分化培养基中的孵育。在进一步 的实施方案中，分化培养基支持、促进和/或触发干细胞的体外培养物向一种或多种特定 表型的分化。在更进一步的实施方案中，分化培养基支持、促进和/或触发间充质干细胞/ 基质细胞的体外培养物通过骨生成、软骨生成和/或脂肪生成向一种或多种结缔组织表型 的分化。
[0096] 向一种或多种分化信号的暴露具有宽范围的适宜的持续时间。在各个实施方案 中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 秒或更 多秒，包括其中的增量。在各种实施方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多 种分化信号 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟或更多分钟，包括其中的增量。在各种进一步的实施 方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更多小时，包括其中的增量。在各种 进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 天或 更多天，包括其中的增量。 暴露于分化信号的时期
[0097] 与工程化组织构建体的制造相关的许多时期适合于多能细胞（例如，干细胞）向 一种或多种分化信号的暴露。在一些实施方案中，在组织构建体的制造之前，干细胞暴露于 一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在生物墨水产生之前或细胞/生物墨水沉 积以形成组织构建体之前（例如，沉积前），将细胞暴露于细胞培养物中的一种或多种分化 信号。在更进一步的实施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水 沉积以形成组织构建体之前约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天。在一些实施方案中，沉积前暴露于一种或多 种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体之前约5天至约21天。在一些实 施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体 之前约5天至约0天。
[0098] 在一些实施方案中，在组织构建体制造时附近和/或在制造期间将干细胞暴露于 一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在产生生物墨水时附近和/或在此期间将 细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在细胞/生物墨水沉积以形成 组织构建体时附近和/或在此期间（例如，围沉积（peri-deposition))将细胞暴露于一种 或多种分化信号。在更进一步的实施方案中，围沉积暴露于一种或多种分化信号是在细胞/ 生物墨水沉积以形成组织构建体的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24小时或更多小时内。在更进一步的实施方案中，围沉积暴露于一种或多 种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或 更多天内。在一些实施方案中，围沉积暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉 积以形成组织构建体的约5天内。在一些实施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号 是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体的约2天内。
[0099] 在一些实施方案中，在组织构建体的制造后将干细胞暴露于一种或多种分化信 号。在进一步的实施方案中，在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后（例如沉积后）， 将细胞暴露于培养物中的一种或多种分化信号。在更进一步的实施方案中，沉积后暴露于 一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后的约1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 天或更多天。 在一些实施方案中，沉积后暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组 织构建体后的约1天到约21天。在一些实施方案中，沉积后暴露于一种或多种分化信号是 在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后的约5天到约0天。
[0100] 在一些实施方案中，生物墨水和/或结缔组织构建体中的间充质干细胞/基质细 胞的一些部分是以向在哺乳动物结缔组织中存在的细胞类型（作为非限制性的实例，包括 骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞）的部分或完全分化为特征的。在各种实施方案中，1、5、10、 20、30、40、50、60、70、80、90、95、98、99或100%的间充质干细胞/基质细胞展现出一定程度 的分化。
[0101] 参照图1，在特定实施方案中，多种时期适合于间充质干细胞/基质细胞向成骨分 化培养基的暴露。在本实施方案中，相对于通过细胞沉积（例如经由生物打印机的）对组 织构建体的制造定义了 3个合适的时期。此外，在本实施方案中，间充质干细胞/基质细胞 任选地在沉积前、围沉积和/或沉积后暴露于成骨分化培养基。在这种情况下，沉积前时期 从沉积前5天延伸至沉积当天；围沉积时期从沉积前2天延伸至沉积后3天；而沉积后时期 从沉积当天延伸至沉积后5天。
[0102] 在一些实施方案中，本文公开了包含彼此凝聚的间充质干细胞/基质细胞的工程 化结缔组织构建体及其阵列，其中该间充质干细胞/基质细胞已暴露于一种或多种分化信 号，以提供活的三维结缔组织构建体。
[0103] 在一些实施方案中，作为非限制性的实例，所述结缔组织为骨、软骨、腱、韧带以及 它们的组合。在一些实施方案中，该结缔组织是复合组织，包括，例如，骨、软骨、腱、韧带和 它们的组合以及非结缔组织。在进一步的实施方案中，软骨和骨可以在层状组织中组合以 形成供关节修复使用的结缔组织。在进一步的实施方案中，工程化结缔组织构建体可以设 计成与可植入的医疗装置或假体相容，以强化该装置或假体的移植或功能。在一些实施方 案中，韧带可以被工程化成在一个或两个末端上包括类骨样组织，以帮助手术递送或移植， 或强化递送后的功能。在更进一步的实施方案中，肌腱可以被工程化为在一个末端上具有 类骨样组织和/或在相对末端上具有肌肉组织，以帮助手术递送或移植，或强化递送后的 功能。 分化的评估
[0104] 多种技术和方法适用于评估多能细胞（例如，干细胞）向特定组织表型的分化。在 一些实施方案中，利用显微镜检查和染色通过识别特定化学物质、细胞表面抗原、细胞器、 细胞结构和/或细胞群体来评估分化。关于对间充质干细胞/基质细胞向结缔组织表型的 分化的评估，在一些实施方案中，利用茜素红S(对钙晶体进行染色）和/或Von Kossa(对 磷酸钙沉积物进行染色）来识别和任选地量化骨生成。进一步举例来说，升高的碱性磷酸 酶水平表明活性骨形成的发生，因为这种酶是成骨细胞活性的副产物；因此，在一些实施方 案中，利用碱性磷酸酶染色来检测向骨表型的分化。在一些实施方案中，利用酶联免疫吸附 测定（ELISA)通过识别特定化学物质、细胞表面抗原、细胞器、细胞结构和/或细胞群体来 评估分化。关于对间充质干细胞/基质细胞向结缔组织表型的分化的评估，在一些实施方 案中，利用针对骨桥蛋白的ELISA(在成骨细胞中表达的细胞外结构蛋白质）识别并任选地 量化骨生成。
[0105] 参照图2A和2B，在一个特定的实施方案中，生物打印含有间充质干细胞的构建 体，并将其在成骨分化培养基或仅基础间充质干细胞培养基中培养。利用生物打印的构建 体的原位碱性磷酸酶染色来检测成骨细胞活性。图2A说明了在暴露于成骨分化培养基的 构建体中的碱性磷酸酶的表达。而图2B说明了在仅暴露于基础间充质干细胞培养基的构 建体中没有或几乎没有碱性磷酸酶的表达。
[0106] 参照图2C和2D，在一个特定的实施方案中，生物打印含有间充质干细胞的构建 体，并在打印后立即将其在成骨分化培养基或仅基础间充质干细胞培养基中培养。钙沉积 物通过茜素红S染色来识别。图2C说明了在暴露于成骨分化培养基的构建体中的钙沉积。 而图2D说明了在仅暴露于基础间充质干细胞培养基的构建体中不存在或几乎不存在钙。
[0107] 参照图3,在一个特定的实施方案中，培养间充质干细胞/基质细胞并用其产生生 物墨水，生物打印该生物墨水以形成组织构建体。打印后在分化培养基中孵育5天后，对所 得组织进行组织切片、福尔马林固定和石蜡包埋。对构建体进行针对骨桥蛋白表达的免疫 荧光染色。示出的反应指示了间充质干细胞的分化和骨生成。
[0108] 参照图4A和4B，在一个特定的实施方案中，生物打印含有间充质干细胞的构建 体，并将其在成骨分化培养基或仅基础间充质干细胞培养基中培养。利用生物打印的构建 体的组织学碱性磷酸酶染色来检测成骨细胞的活性。图4A说明了在仅暴露于基础间充质 干细胞培养基的构建体中没有或几乎没有碱性磷酸酶的表达。而图4B示出了在暴露于成 骨分化培养基的构建体中碱性磷酸酶的表达。 预形成的支架
[0109] 在一些实施方案中，本文公开了工程化组织，包括结缔组织构建体，及其阵列，其 不含或基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，"支架"是指：合成的支架，例 如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层和脱细胞的组织； 以及任何其他类型的预形成的支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是重要 的，并且不从该组织和/或器官中除去。
[0110] 在一些实施方案中，该工程化组织（包括结缔组织构建体）及其阵列，不利用任何 预形成的支架，例如，来形成该组织、该组织的任何层或者形成该组织的形状。作为非限制 性的实例，本发明的工程化组织不利用任何预形成的合成支架（例如聚合物支架）、预形成 的细胞外基质层或任何其他类型的预形成的支架。在一些实施方案中，该工程化组织基本 不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，该组织的细胞组分含有可检测到的但是 痕量或微量的支架，例如，小于总组成的2. 0%、小于总组成的1. 0%、小于总组成的0. 5% 或小于总组成的0. 1%。在更进一步的实施方案中，痕量或微量的支架不足以影响该组织 或其阵列的长期行为或者妨碍其主要生物功能。在另外的实施方案中，在打印之后，通过物 理、化学或酶方法除去支架组分，从而产生不含或基本不含支架组分的工程化组织。
[0111] 在一些实施方案中，本文公开的不含或基本不含预形成的支架的工程化组织，与 用某些其他组织工程方法开发的那些组织形成鲜明对比，在这些其他组织工程方法中，例 如，首先形成支架材料，然后将细胞接种到支架上，随后细胞增殖，以填充并呈现支架的形 状。在一个方面，本文中描述的生物打印方法允许产生活的且有用的组织，该组织基本不含 预形成的支架。在另一方面，在一些实施方案中，利用限制材料使将本发明的细胞保持为所 期望的三维形状。该限制材料至少在以下事实上与支架是不同的：该限制材料是暂时的和 /或可从细胞和/或组织除去。 阵列
[0112] 在一些实施方案中，本文公开了包括结缔组织构建体在内的工程化组织的阵列。 在一些实施方案中，"阵列"是一种科学工具，其包括多个空间排布的元件的关联，以允许在 一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或兼具两者。在一些实施方 案中，该阵列适用于或相容于筛选方法和装置，包括与高通量筛选相关的那些方法和装置。 在进一步的实施方案中，阵列允许同时进行多个试验。在进一步的实施方案中，阵列允许同 时检测多个样品。在一些实施方案中，该阵列为细胞微阵列。在进一步的实施方案中，细胞 微阵列为允许在固体支持体表面上对活细胞进行多重探询的实验室工具。在其他实施方案 中，该阵列为组织微阵列。在进一步的实施方案中，组织微阵列包括组装成阵列的多个单独 的组织或组织样品，以允许进行多个生物化学的、代谢的、分子的或组织学的分析。
[0113] 在一些实施方案中，该工程化组织（包括结缔组织构建体）各自存在于生物相容 性多孔容器的孔中。在一些实施方案中，每个组织被放入孔中。在其他的实施方案中，每个 组织被生物打印入孔中。在进一步的实施方案中，该孔被包被。在各个进一步的实施方案 中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、一种或多种蛋白质、一种或 多种化学品、一种或多种肽、一种或多种抗体和一种或多种生长因子，包括它们的组合。在 一些实施方案中，该孔用NovoGel?包被。在其他实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些 实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔内的多孔生物相容性膜上。
[0114] 在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）在一侧或多侧被生物相 容性表面所限。在进一步的实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）通过在一侧 或多侧被生物相容性表面所限而保持于阵列配置中。在更进一步的实施方案中，该组织在 1、2、3、4个或更多侧被生物相容性表面所限。在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组 织构建体）在一侧或多侧附着至生物相容性表面。
[0115] 在一些实施方案中，该生物相容性表面为任何对该组织或与该组织接触的生物体 不产生显著伤害或毒性风险的表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为任何适 合于传统组织培养方法的表面。作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括：经处理 的塑料、膜、多孔膜、涂覆的膜、涂覆的塑料、金属、涂覆的金属、玻璃和涂覆的玻璃，其中合 适的涂层包括水凝胶、ECM成分、化学品、蛋白质等。
[0116] 在一些实施方案中，工程化组织在一侧或多侧上向生物相容性表面的附着有助于 使该组织经受机械或生物机械力。在进一步的实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构 建体）经受机械或生物机械力。在各个实施方案中，工程化组织在1、2、3、4个或更多个侧 经受机械或生物机械力。
[0117] 在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）的阵列包括两个或更多 个元件的关联。在各个实施方案中，该阵列包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、 225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475 或 500 个元件（包括其中的增量）的关 联。在进一步的实施方案中，每个元件包括一个或多个细胞、多细胞聚集体、组织、器官或它 们的组合。
[0118] 在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）的阵列包括以预先确定 的图案空间排布的多个元件。在进一步的实施方案中，该图案为元件的任何合适的空间排 布。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，图案排布包括二维网格、三维网格、一条或多 条线、弧或圆、一系列的行或列等等。在进一步的实施方案中，针对与高通量生物学分析或 筛选方法或装置的兼容性而选择该图案。
[0119] 在各个实施方案中，基于特定的研宄目的或目标，选择用于制造阵列中的一种或 多种组织的细胞的细胞类型和/或来源。在进一步的各个实施方案中，基于特定的研宄目 的或目标，选择阵列中的特定组织。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工 程化组织，以促进对特定疾病或状况的研宄。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种 特定的工程化组织，以促进对特定受试者的疾病或状况的研宄。在进一步的实施方案中，用 源自两个或更多个不同人类供体的一种或多种细胞类型来产生该阵列中的一种或多种特 定的工程化组织。在一些实施方案中，阵列中的每种组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细 胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是基本相似的。在其他实施方案中，阵列中的一种或多 种组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是独特的。在 各个实施方案中，阵列中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300 种或更多种组织是独特的。 在其他各个实施方案中，阵列中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的组织是独特的。
[0120] 在一些实施方案中，阵列中的一种或多种组织代表人体内的一种或多种特定的组 织。在进一步的实施方案中，阵列中的一种或多种个体组织代表人体组织，作为非限制性的 实例，该人体组织包括：血管或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、 肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰脏、脾、脑、食道、胃、肠、结肠、直 肠、卵巢、前列腺、内胚层、中胚层和外胚层。在一个实施方案中，选择阵列中的组织，以代表 受试者中的所有主要的组织类型。
[0121] 在一些实施方案中，阵列中的每种组织被独立地在培养物中保持。在进一步的实 施方案中，阵列中每种组织的培养条件为使得它们与其他组织分离，并且不能交换培养基 或在培养基中可溶的因子。在其他实施方案中，该阵列中的两种或更多种个体组织交换可 溶性因子。在进一步的实施方案中，阵列中的两种或更多种个体组织的培养条件为使得它 们与其他组织交换培养基或在培养基中可溶的因子。在各个实施方案中，阵列中的1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、 150、175、200、225、250、275、300种或更多种组织交换培养基和/或可溶性因子。在其他各 个实施方案中，阵列中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的组织交换培养基和 / 或可溶性 因子。 体外分析
[0122] 在一些实施方案中，本文公开的工程化组织（包括结缔组织构建体）和阵列用于 体外分析。在一些实施方案中，"分析"是指检测或测量物质（例如化学品、分子、生物化学 品、药物等）在有机或生物样品（例如细胞聚集体、组织、器官、生物体等）中的存在或活性 的过程。在进一步的实施方案中，分析包括定性分析和定量分析。在更进一步的实施方案 中，定量分析测量样品中物质的量。
[0123] 在各个实施方案中，作为非限制性的实例，工程化组织（包括结缔组织构建体）和 阵列用于分析以检测或测量如下的一种或多种：分子结合（包括放射性配体结合）、分子摄 取、活性（例如，酶活性和受体活性等）、基因表达、蛋白质表达、受体激动作用、受体拮抗、 细胞信号传导、细胞凋亡、化学敏感性、转染、细胞迀移、趋化性、细胞活力、细胞增殖、安全 性、有效性、代谢、毒性和滥用责任。
[0124] 在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）及其阵列用于免疫测定。 在进一步的实施方案中，免疫测定是竞争性免疫测定或非竞争性免疫测定。在竞争性免疫 测定中，例如，样品中的抗原与标记抗原竞争结合抗体，随后测量结合到抗体位点的标记抗 原的量。在非竞争性免疫测定（也称作"夹心法分析"）中，例如，样品中的抗原结合到抗体 位点；接着，标记的抗体与该抗原结合，并且随后测量在该位点上的标记抗体的量。
[0125] 在一些实施方案中，工程化组织（包括结缔组织构建体）及其阵列用于酶联免疫 吸附测定（ELISA)。在进一步的实施方案中，ELISA是用于检测抗体或抗原在样品中的存 在的生物化学技术。在ELISA中，例如，使用了至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。进 一步举例来说，将具有未知量的抗原的样品非特异性地（通过吸附到表面上）或特异性地 (在"夹心"ELISA中，通过对同样抗原具有特异性的另一种抗体进行捕获）固定在固体支 持体（例如，聚苯乙烯微量滴定板）上。再进一步举例来说，在抗原固定之后，加入检测抗 体，与