立替康与磷酸氯喹组合。
[0089] 对比例1
[0090] 将盐酸伊立替康0. 02g加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50°C的水浴 中孵育l〇min，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内 的游离药物，得到盐酸伊立替康脂质体，测得盐酸伊立替康的包封率为99. 1 %，载药量为 4. 61 %，脂质体的平均粒径（数均）为79. 2nm〇
[0091] 对比例2
[0092] 将磷酸氯喹0. 02g加入到实施例1的5mL空白脂质体中，之后在50°C的水浴中孵 育lOmin，冷却到室温后，用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体和未被包封在内的游 离药物，得到磷酸氯喹脂质体，测得磷酸氯喹的包封率为97. 4%，载药量为3. 53 %，脂质体 的平均粒径（数均）为68. Onm。
[0093] 细胞毒性对比实验
[0094] 将作为对照组1的游离盐酸伊立替康水溶液（lmg/mL)、作为对照组2的游离磷酸 氯喹水溶液（lmg/mL)、对比例制备的脂质体、实施例制备的各种盐酸伊立替康和氯喹类药 物不同比例的脂质体以及实施例中各种盐酸伊立替康和氯喹类药物不同比例的组合分别 用于细胞实验，采用MTT (噻唑蓝）比色法进行实验，步骤如下：
[0095]对数生长期的的癌细胞用胰蛋白酶消化、PBS缓冲液（即：含0. 05%吐温-20的 pH7. 4的磷酸盐缓冲液，质量百分比）洗涤、离心后将其制备成浓度为3XIO4个/mL的细胞 悬液，将该悬液按100UL/孔均匀加入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为3000个。将细胞 板置于37°C孵箱中，孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将载药脂质体、 药物组合、盐酸伊立替康及磷酸氯喹溶于生理盐水中，所有溶液以其中盐酸伊立替康的含 量为基准，稀释成不同浓度，折算成盐酸伊立替康溶度分别为0.1 y g/mL，0. 5 y g/mL，I y g/ mL，5 y g/mL，10 y g/mL，25 y g/mL，50 y g/mL，100 y g/mL，200 y g/mL，向上述 96 孔细胞培养 板中加入上述不同浓度的溶液25 y L/孔，培养48h后，每孔加入32 y L浓度为5mg/mL噻唑 蓝（MTT)溶液，继续培养4h，吸出上清液，加入200 y L二甲基亚砜（DMSO)，然后振摇5min。 用酶标仪检测各孔570nm处的OD值，记录结果。上述实验，每组重复3次，每个浓度设3个 复孔。
[0096] IC5tl即50%抑制浓度，是抑制半数癌细胞生长时的药物浓度，IC 5Q值越低，说明细 胞毒性作用越大。试验中IC5tl值由IC 5(l. exe软件计算得到。
[0097] 实验结果显示，同一氯喹类药物和盐酸伊立替康比例，不同种类的磷脂、不同种类 的胆固醇对于IC 5tl几乎没有影响。
[0098] 对照组1、对照组2、对比例1、对比例2及实施例7、8、9、10和11制备的脂质体、实 施例19制备的药物组合对两种敏感人结肠癌细胞株HCT-8和HT-29的IC 5tl ( y g/mL)值，如 表2所示：
[0099] 表 2
[0100]
[0101] CI > 1为拮抗作用，CI = 1为相加作用，CI < 1为协同作用（Cl值越小，说明协 同作用越强）。
[0102] 由表2可见，对照组2和对比例2中氯喹类药物没有显示出明显的细胞毒性，表明 氯喹类药物的细胞毒性较小；从对照组1和对比例1可以看出，伊立替康类药物脂质体比游 离的伊立替康类药物有更小的IC 5tl值，说明制备成脂质体剂型在一定程度上增强了伊立替 康类药物的细胞毒性。从实施例19可以看出，游离的伊立替康类药物和氯喹类药物组合可 以起到较好的协同作用（Cl均小于1)。共载实施例组（实施例7-11)对两种敏感人结肠 癌细胞株HCT-8和HT-29细胞都起到了一定的抑制作用，并且随着氯喹比例的增加而加大， 根据CI值可判断，伊立替康类药物和氯喹类药物协同作用较好，且在结肠癌细胞株HT-29 中协同作用更强，这说明氯喹类药物增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作 用。由此可见，本发明伊立替康类药物和氯喹类药物组合、伊立替康类药物和氯喹类药物共 载脂质体对细胞起到较好的增敏作用。
[0103] 实施例17、18、20和21中的药物组合也可以起到较好的协同作用；共载实施例组 (实施例12-16)伊立替康类药物和氯喹类药物协同作用也较好，且在结肠癌细胞株HT-29 中协同作用更强；这说明氯喹类药物增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作 用。
[0104] 本发明制备方法中参数的变化并不影响共载脂质体的制备，因此本发明制备方法 中任意参数的组合均可实现共载脂质体的制备。在此不再赘述。
【主权项】
1. 一种伊立替康类药物和氯喹类药物组合，其特征在于，所述的伊立替康类药物和氯 喹类药物的质量比为1-100 :1-100。2. 根据权利要求1所述的伊立替康类药物和氯喹类药物组合，其特征在于，所述的伊 立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1:0. 5-5。3. 根据权利要求1所述的伊立替康类药物和氯喹类药物组合，其特征在于，所述的伊 立替康类药物为伊立替康、伊立替康与酸所成的盐中的一种或多种；所述的氯喹类药物为 氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种。4. 一种伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，由药物、磷脂、胆固 醇类化合物和水相介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的质量比为I :2-100 : 〇. 8-35 ;所述的药物为伊立替康类药物和氯喹类药物；所述的伊立替康类药物和氯喹类药 物的质量比为1-100 :1-100 ;所述的伊立替康类药物为伊立替康、伊立替康与酸所成的盐 中的一种或多种；所述的氯喹类药物为氯喹、氯喹与酸所成的盐中的一种或多种；所述的 胆固醇类化合物为胆固醇、聚乙二醇修饰的胆固醇中的一种或者两种。5. 根据权利要求4所述的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所 述的伊立替康与酸所成的盐为盐酸伊立替康；所述的氯喹与酸所成的盐为磷酸氯喹、盐酸 氯喹、硫酸氯喹中一种或多种。6. 根据权利要求4所述的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所 述的水相介质为硫酸铵水溶液。7. 根据权利要求6所述的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所 述的硫酸铵水溶液的浓度为〇? 05mol/L-0. 5mol/L〇8. 根据权利要求4所述的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，其特征在于，所 述的伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1:0. 5-5。9. 根据权利要求4或5所述的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体的制备方法， 其特征在于，采用pH梯度法或硫酸铵梯度法制备。10. 根据权利要求4-8任一项所述的伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体的制备 方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中，混合均匀，除去有机溶剂，形成薄膜， 再加入水相介质硫酸铵水溶液混合均匀，充分水化后经粉碎、均一粒径，得到空白脂质体悬 液；所述的有机溶剂为无水乙醇或者氯仿； (2) 将步骤（1)中的空白脂质体悬液以蒸馏水为透析介质，透析4h-20h，得到空白脂质 体； (3) 将伊立替康类药物和氯喹类药物加入到空白脂质体中，经水浴孵育后冷却，分离出 游离药物，得到伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体。
【专利摘要】本发明公开了一种伊立替康类药物和氯喹类药物组合及其共载脂质体和制备。伊立替康类药物和氯喹类药物组合中伊立替康类药物和氯喹类药物的质量比为1-100：1-100。伊立替康类药物和氯喹类药物共载脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物和水相介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1：2-100：0.8-35；所述的药物为伊立替康类药物和氯喹类药物。利用伊立替康类药物和氯喹类药物的协同作用，增强了伊立替康类药物对结肠癌敏感株细胞的杀伤作用。所述的共载脂质体的制备方法采用pH梯度法或硫酸铵梯度法，制备工艺简单，控制的参数较少，反应条件较低，有利于降低生产成本，易于工业化生产。
【IPC分类】A61K31/4745, A61K31/4706, A61K9/127, A61P35/00
【公开号】CN104971062
【申请号】CN201510314990
【发明人】邱利焱, 高梦华, 许玉珍
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月10日