. 2)清洗3遍，每组培养液中加入约2000个原头节，置37°C，5% C0J?育箱内培养，在倒置显微镜下观察TUDCA对细粒棘球蝴原头节形态和活力的影响。
[0028]数据统计方法：加药后24h开始，每组每天均匀抽取200 y L培养液（平均含原头节约90-120个），用0. 1%伊红染色15min，倒置显微镜下观察原头节的活力。活头节拒染、不着色，且有活动性；死亡或活力减弱的原头节红染着色，伴有结构破坏。计算每组每天平均死亡率。每隔4d换液一次（每组体系和浓度同第一次加药时），连续观察，直至最大作用浓度的原头节全部死亡。实验重复三次。实验2 :CA作用后原头节表面结构的变化
[0029]在测活力的同时，随机取相对应的原头节做电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min ;置4%戊二醛固定24h。将原头节放入浓度为50%、70%、80%、90%、100%的酒精内逐级梯度脱水，脱水时间分别为5min、10min、30min、lh至过夜，临界点干燥，真空喷金L00A，在LE01430VP扫描电子显微镜下观察原头节表层超微结构变化。
[0030]实验3 ：CA作用后原头节内部结构的变化
[0031]在测活力的同时，随机取相对应的原头节做电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min ;置4%戊二醛前固定24h。用小离心管离心，去除上清液，用琼脂糖包埋头节，取出凝胶继续放入4%戊二醛内固定24h。将固定好的原头节用PBS(PH7. 4)冲洗3次，每次15min，2% 0s04中后固定lh，用PBS再冲洗两遍。酒精逐级梯度脱水，30%—50%— 60%各 10min，70% 过夜，次日再置 80%— 90% 各 lOmin，100% 30min。之后丙酮逐级脱水，环氧树脂（Epon812)包埋，固定后修型，LKB2088V型超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅双重染色，置于日立H-600型透射电子显微镜观察原头节内部超微结构的变化。
[0032]实验结果：
[0033]参考图1，为CA体外培养细粒棘球蝴原头节的形态变化，倒置显微镜下观察，CA作用后的原头节多呈外翻型，原头节顶突上的小钩排列紊乱，部分脱落，吸盘突起，变形，活动性减弱或死亡。药物作用5d后，随着CA浓度的增加，原头节的形态变化明显。DMSO组的原头节顶突凸出或凹入，体积较大，活动良好.参考图2，为CA对体外细粒棘球蝴原头节的杀伤作用。不同浓度 CA (500 ymol/L、1000 ymol/L、2000 ymol/L、3000 ymol/L)体外培养 18d的细粒棘球蝴原头节活力测定结果见图2，显示不同浓度CA对体外细粒棘球蝴原头节均有抑制作用。其中3000 ymol/L CA作用18d原头节死亡率达100%。从活力曲线图中可以看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，原头节的抑制率增加，此作用具有剂量依赖性和时间依赖性。各实验组原头节死亡率与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01)。
[0034]同时，申请人在扫描电子显微镜下观察了 CA作用后的原头节超微结构变化，观察显示空白对照组原头节表面光滑，多呈内陷型，头节呈球形或椭圆形；用3000 iimol/L CA作用细粒棘球蝴原头节5d后，在扫描电子显微镜下观察发现，原头节多呈外翻型，顶突破坏、头钩缺损、吸盘变形，体表出现许多陷窝，皮层呈虫蛀样损害（图3)。
[0035]同时，在透射电镜下观察，正常培养的细粒棘球蝴原头节合胞体带结构较致密，内有大小不等、形状不一的囊泡，排列较规则，外侧有较多排列整齐的微毛；原头节内含有不同类型的细胞，实质细胞的核大而明显，核仁居中，核内染色质较细腻，异染色质较少。CA作用后的细粒棘球蝴原头节合胞体带变薄，结构松散，囊泡扩张，纤毛减少，且排列不规则；部分实质细胞基质浓缩，核周隙轻微增宽，核仁消失；合胞体带和腔内出现空泡（图4)。
[0036]综上可以看到，不同浓度CA对体外细粒棘球蝴原头节均有抑制作用，浓度为3000 ymol/L的CA对细粒棘球蝴原头节杀伤作用最明显，随着时间的延长，抑制作用显著增加（P < 0. 01)。在证实CA对原头节有抑制作用的基础上，探索不同浓度的CA对细粒棘球蝴原头节的形态学影响。研究结果显示，CA作用后，可导致体外细粒棘球蝴原头节的形态发生不同程度的改变。内陷型和外翻型原头节是虫体不同的存在形式。当条件适适宜时，原头节顶突内凹，可保护头钩、吸盘、微毛不受损害；当加入CA后，外翻型的原头节增多。正常培养的细粒棘球蝴原头节生发层的微毛发育良好，数量多，附着并延伸入角质层内，可增加生发层与角质层的接触面积，有利于营养物质的吸收，在棘球蝴无血液供应的情况下仍可较快生长并不断形成育囊。不同浓度CA作用后的细粒棘球蝴原头节，在透射电镜下观察，微毛出现不同程度的缺损，并且生发层内的细胞被空泡所替代。其不利于形成育囊，使原头节的生长受到抑制而死亡。
[0037]总而言之，CA对体外细粒棘球蝴原头节有杀伤作用。
【主权项】
1.胆酸作为活性成分在制备治疗细粒棘球蝴病药物中的应用。2.根据权利要求1的应用，其特征在于胆酸的浓度不低于500ymol/Lo3.根据权利要求2的应用，其特征在于胆酸的浓度为2000-3000μ mol/L。4.胆酸作为活性成分在制备治疗囊性肝包虫病药物中的应用。5.胆酸作为细粒棘球蝴原头节抑制剂的应用。6.根据权利要求5的应用，其特征在于胆酸的浓度不低于500μ mol/L。7.根据权利要求6的应用，其特征在于胆酸的浓度为2000-3000μ mol/L。
【专利摘要】本发明公开了胆酸作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，以胆酸杀灭细粒棘球蚴病的病原-细粒棘球蚴绦虫，具有显著的抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的效果，从而实现细粒棘球蚴病的治疗。
【IPC分类】A61K31/575, A61P33/10
【公开号】CN105012316
【申请号】CN201510445834
【发明人】姜玉峰, 吕海龙, 史红娟
【申请人】姜玉峰
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月27日