）而组成型地，或差异地调 控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启 动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动 子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。
[0038] "信号肽"和"前导序列"在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的 蛋白质或氨基酸序列的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定 位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌 后，通常从蛋白质的其余部分（通常称为成熟蛋白）切割信号肽/前导序列。信号肽/前 导序列连接在蛋白质的氨基末端上。
[0039] 如本文中所用，"严格杂交条件"可意指第一核酸序列（例如，探针）将与第二核酸 序列（例如，靶）（诸如在核酸的复杂混合物中）杂交的条件。严格条件是序列依赖性的， 并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点（TJ 低约5-KTC作为严格条件。可以是50%的与靶互补的探针在平衡（由于靶序列过量存 在，因此在下，50%的探针在平衡时被占据）时与靶序列杂交时的温度（在限定的离子强 度、pH和核酸浓度下）。严格条件可以是在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸 如约0? 01-1. 0M的钠离子浓度（或其它盐）以及温度为至少约30°C(对于短探针（例如， 约10-50个核苷酸））和至少约60°C(对于长探针（例如，大于约50个核苷酸）的那些条 件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性 信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS在42°C下孵育，或者5xSSC、1%SDS在65°C下孵育，在65°C于0. 2xSSC和 0? 1%SDS中洗涤。
[0040] 如本文中所用，"受试者"可意指想要或需要利用本文中描述的治疗剂免疫的哺乳 动物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
[0041] 如本文中所用，"基本上互补的"可意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域上具有至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。
[0042] 如本文中所用，"基本上相同的"可意指第一与第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 或更多个氨基酸 的区域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同。基本上相同的还可 意指第一核酸序列和第二核酸序列在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、 400、500、600、700、800、900、1000、1100 或更多个核苷酸的区域上至少 60%、65%、70%、 75%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同。
[0043] 如本文中所用，"治疗"或"处理"可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方 式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的治疗剂。 抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的治疗剂。压制疾病包 括在疾病临床表现后向动物施用本发明的治疗剂。所述疾病可与缺氧和/或局部缺血相关 联。
[0044] 本文中针对核酸所用的"变体"意指（i)参考的核苷酸序列的部分或片段；（ii)参 考的核苷酸序列或其部分的补体；（iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或 (iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
[0045] "变体"还可被定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异 的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。"生物活性"的代表性实例包括被特定抗体结合 或促进免疫应答的能力。疫苗还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的 参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性 质（例如，疏水性、带电区域的程度和分布）的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为 通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水 性指数（hydropathicindex)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132 (1982)。氨基 酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数 的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨 基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的 背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗 原性和免疫原性密切相关的有用的度量。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基 酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基 酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致， 与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对 相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。
[0046] 变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列 可在全长的基因序列或其片段上具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。变体可 以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所 述氨基酸序列或其片段上具有 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的同一性。
[0047] 如本文中所用，"载体"意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬 菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主 复制的染色体外载体和优选地，是DNA质粒。载体可含有或包括一个或多个异源核酸序列。
[0048] 对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例 如，对于6-9的范围，除了 6和9外还包括数值7和8,而对于范围6. 0-7. 0,明确地包括数 值 6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9 和 7. 0。
[0049] 2.治疗剂
[0050] 治疗剂可包含药剂、其片段、其变体或其组合。所述药剂可促进或诱发血管形成。 所述药剂可促进或诱导血管紧张度、血管生成和/或动脉生成。相较于未被施予所述治疗 剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的毛细血管密度、侧支血管形 成、血管尺寸或其组合。相较未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述 治疗剂的受试者的组织灌流。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可减少被 施予所述治疗剂的受试者的组织坏死。
[0051] 本发明的治疗剂可具有有效治疗剂所需的特性，诸如是安全的，以使治疗剂本身 不会引起疾病或死亡；预防疾病；和提供施用的容易性、副作用少、生物稳定性和每剂量的 低成本。该治疗可通过包含所述药剂来实现这些特性的一些或全部特性。
[0052] a?药剂
[0053] 所述治疗剂可包含药剂。所述药剂可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述 核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包含编码通 过肽键连接于所述药剂的接头或标签序列的额外序列。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、 其变体、其片段或其组合。
[0054] (l)HIF-la
[0055] 所述药剂可以是缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)、其片段、其变体或其组合。HIF-1a 是转录因子HIF-1的两个亚基之一。另一个亚基是HIF-10。因此，HIF-1是a和亚基 的异二聚体，其中0亚基是组成型表达的并且a亚基的稳定性受氧浓度调节。
[0056] 两个亚基都是转录因子的碱性螺旋-环-螺旋PER-ARNT-S頂(bHLH-PAS)家族的 成员。如图1中显示的，HIF-1a含有bHLH结构域和2个PAS结构域以及N末端转录激活结 构域（NTAD)和C末端转录激活结构域（CTAD)。此外，HIF-1a含有2个被含有脯氨酰-羟 化酶结构域（PHD) (S卩，PHD1、PHD2和PHD3)的酶羟化的脯氨酸残基（例如，人HIF-1a中 的P402和P564)，和位于CTAD中的通过抑制HIF的因子（FIH)羟化的天冬酰胺残基（例如 人HIF-la中的N803)。这些残基在氧存在的情况下在HIF-la中被羟化。
[0057] 具体地，羟化的天冬酰胺残基在空间上抑制HIF-1a与转录辅助激活因子之间的 相互作用，然而羟化的脯氨酸残基被希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白（PVHL)识别并结合。pVHL 发现于包含延伸因子B、延伸因子C和cullin-2的复合物中，并且具有遍在蛋白连接酶E3 活性。该复合物介导羟化HIF-la的遍在蛋白化，所述羟化HIF-la随后通过26S蛋白酶 体降解。
[0058] 因此，在常氧存在的情况下，HIF-1a不稳定和/或不能与转录辅助激活因子相互 作用，从而HIF-1是无活性的。在缺氧或局部缺血状态下，HIF-la的羟基被减少或抑制， 从而稳定HIF-la并允许HIF-1介导对缺氧和局部缺血的适应性响应。这些适应性响应可 包括指导通过对血管紧张度的作用、血管生成和/或动脉生成参与血管动态平衡的基因的 转录。
[0059] 然而，在病理状态下，HIF-1可被抑制，从而导致减少的组合灌流、静止时缺血性疼 痛的表现、溃疡和/或坏疽，和最终导致截肢。这样的病理状况可包括严重肢体缺血。
[0060] 因此，所述治疗剂可用于治疗涉及缺氧和/或局部缺血的病理状况。缺氧或局部 缺血可与严重肢体缺血、外周动脉疾病、伤口愈合、血管疾病、循环系统疾病、冠状动脉病、 心血管疾病、糖尿病或其组合相关联。缺氧或局部缺血可与严重肢体缺血相关联。
[0061] 相较于未施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试 者的毛细血管密度、侧支血管形成、血管尽管或其组合。相较于未被施予所述治疗剂的受试 者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的组织灌流。相较于未被施予所述治疗 剂的受试者，所述治疗剂可减少被施予所述治疗剂的受试者的组织坏死。
[0062] 编码HIF-1a的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠（小家鼠）和人（智人）。可 针对密码子选择和相应的RNA转录物优化编码HIF-1a的核酸。编码HIF-1a的核酸可以 是针对表达而优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码HIF-1a的核酸可包含Kozak 序列（例如，GCCACC)，以增强翻译的效率。编码HIF-1a的核酸可包含多个终止密码子 (例如，TGATGA，TGATAA等），以增强翻译终止的效率。编码HIF-la的核酸还可编码免 疫球蛋白E(IgE)的前导序列。IgE前导序列在核酸中可位于HIF-la的5'。编码HIF-la 的核酸还可包含编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HIF-1a的核 酸不含或不包含编码IgE前导序列的核苷酸序列。
[0063] 在一些实施方案中，编码HIF-1a的核酸可以是异源核酸序列和/或含有或包括 一个或多个异源核酸序列。编码HIF-la的核酸可以被突变，以使得HIF-la的氨基酸序 列中的一个或多个氨基酸或残基被另一种氨基酸或残基替代或取代。编码HIF-la的核 酸可以被突变，以使得HIF-la的氨基酸序列中可被羟化的一个或多个残基（例如，脯氨 酸、天冬酰胺等）被不能被羧化的另残基替代或取代。编码HIF-la的核酸可被突变，以使 得HIF-1a的氨基酸序列中的一个或多个脯氨酸残基被不能被羟基化的残基替代或取代。 编码HIF-1a的核酸可被突变，以使得HIF-1a的氨基酸序列不能被pVHL识别和/或结 合。编码HIF-la的核酸可被突变，以使得HIF-la的氨基酸序列不能遍在蛋白化。编码 HIF-la的核酸可被突变，以使得HIF-la的氨基酸序列不能被降解，例如，但不限于被26S 蛋白酶体降解。编码HIF-la的核酸可被突变，以使得无论细胞和/或组织中的氧浓度如 何，HIF-la的氨基酸序列都是稳定的，因此，HIF-la蛋白可在细胞和/或组织中积累。
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