制备包含治疗性蛋白质的颗粒的方法
【专利说明】制备包含治疗性蛋白质的颗粒的方法 发明领域
[0001] 本发明处于药物制剂的领域中。更具体地，其涉及制备包含治疗性蛋白质诸如抗 体的微粒的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 用于治疗、诊断或预防目的诸如疫苗的分子的靶向和/或受控释放正在广泛地探 索，因为其相比治疗剂、诊断剂或疫苗的常规施用提供了潜在益处。大分子（诸如蛋白质， 例如抗体或多核苷酸）的靶向和/或受控释放代表了本领域的一个特定挑战。
[0004] 经常用于动物或人中的治疗、诊断或预防应用（例如疫苗）的蛋白质诸如抗体必 须以高剂量施用使其有效。疫苗、抗体或其它治疗或诊断蛋白质通常必须肠胃外施用于动 物或人。通常此类蛋白质需要注射（例如静脉内、皮下或肌内）。经延长期间诸如数天、数 周或数月以受控方式释放的的贮库制剂因此需要避免频繁注射且增加对于所要求施用方 案的依从性。
[0005] 批准的治疗性抗体和其它蛋白质治疗剂的药物制剂通常不适合用于蛋白质诸如 抗体的受控释放。抗体或其它治疗性蛋白质的受控释放制剂是期望的，以允许较不频繁的 施用，由此减少对注射的需求和改善患者依从性。因此，本领域中需要提供实现抗体或其它 蛋白质治疗剂的受控释放的药物制剂。
[0006] 实现分子在体内的靶向和受控释放的一种方式是通过使用颗粒，诸如纳米颗粒或 微粒。这些颗粒可以通过不同的途径（包括口服和肠胃外途径）施用。颗粒可以例如吸入 或注射（例如静脉内、皮下或肌内）。
[0007] 可用于动物或人中的体内应用的颗粒应当是可生物降解且生物相容的。在过去 二十年中，合成的可生物降解聚合物已被用作载体或用于微粒或纳米颗粒中以递送小分 子药物[1]。热塑性脂族聚（酯），诸如聚-丙交酯[PLA]，聚-乙交酯[PGA]，和特别是聚 (D，L-丙交酯-共-乙交酯）[PLGA]由于其优异的生物相容性和生物降解性已经产生了极 大的兴趣。已经使用这些聚合物产生了各种聚合物药物递送系统，诸如微粒、微囊、纳米颗 粒、丸粒、植入物和膜，用于递送各种治疗性药物。它们也已经由FDA批准用于药物递送用 途。
[0008] 也可以进一步修饰基于PLA或PLGA的颗粒，例如通过连接革El向部分，所述连接革巴 向部分诸如聚（乙二醇）[PEG]或蛋白质。这种颗粒的主要限制之一是血浆蛋白质在微粒 上的非特异性吸附。血浆蛋白质的吸附据信是解释微粒的器官分布的关键因素，例如已知 特定蛋白质的存在经由与细胞膜受体的特异性或非特异性相互作用由一些细胞促进摄入。 因此，已经追寻不同的修饰策略来抑制该效应。用PEG修饰PLGA颗粒是减少蛋白质吸附的 重要和众所周知的方法。另一个选项已经经由官能化的聚（L-赖氨酸）-g_聚（乙二醇） (PLL-g-PEG)在PLGA微粒上引入官能团，由此产生具有强烈减少的蛋白质吸附的PLGA微粒 [2]。
[0009] 颗粒修饰的另一个潜在原因是将所述颗粒靶向至体内期望的组织或细胞类型，以 便实现期望的治疗效果。将活性成分特异性递送至期望的目标细胞不仅允许效率增加，而 且允许减少源自活性成分对不同组织的不希望的效果的副作用。这可以使用不同的靶向部 分（诸如抗体、其片段或受体靶向肽）来实现。例如，抗体和受体靶向肽两者已经显示在皮 下注射之后有效地将PLGA颗粒优选靶向至树突细胞[3]。
[0010] 基于聚合物基质的颗粒、特别是基于PLA、PGA或PLGA的颗粒相比于常规的药物递 送系统的优点，除了其生物相容性和生物降解性以外，包括长达数天、数周或数月的延长释 放。然而，已经注意到，这些聚合物基质的使用对于蛋白质诸如抗体而言是有问题的，因为 聚合物基质似乎对于制备和储存期间的蛋白质稳定性具有负面影响，这主要是由于其降解 的酸催化性质。此外，聚合物基质药物递送媒介物的制备中使用的处理条件对蛋白质二级 结构具有有害影响[4]。
[0011] 基于聚合物基质诸如PLA、PGA或PLGA的颗粒的产生需要多个步骤，且涉及多个参 数。包含蛋白质（例如抗体）的基于聚合物基质的颗粒的制备是特别有挑战性的，这是由 于蛋白质和大蛋白质（诸如抗体）的复杂性和固有不稳定性。蛋白质和抗体易于在形成基 于聚合物基质的颗粒的过程期间变得无活性。
[0012] 几种方法已经用于产生基于PLGA的颗粒。最常用的方法采用乳化-溶剂挥发方 法。在该方法中，在疏水性药物的情况下，聚合物和活性分子（例如预防、预后、诊断或治疗 分子）两者均溶解于有机溶剂（诸如二氯甲烷）中，以形成乳剂油。然后通过随后将水和 乳化剂诸如聚乙烯醇（PVA)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)添加至聚合物溶液而制备水（w)包油 (〇)(即ο/w)乳剂。通过超声处理或均质化诱导颗粒，且然后蒸发溶剂或然后萃取溶剂以制 备颗粒。在亲水性药物诸如蛋白质的情况下，将聚合物溶解于有机溶剂，且将活性分子溶解 于水相，第一水-油乳剂从所述水相中制备。接下来，添加水和乳化剂以生成双重水包油包 水乳剂（w/o/w)。从该第二乳剂然后诱导颗粒，且随后蒸发或萃取溶剂以得到颗粒。
[0013] 在水/溶剂界面处的蛋白质吸附和变性是在微囊化过程期间发生的蛋白质生物 活性降低的主要因素之一。为了避免在水包油包水（w/o/w)方法中形成油包水（w/o)乳剂 期间主要发生的蛋白质变性，已经开发了水包油包固体（s/〇/w)方法[5]。实际上，在固态 中，蛋白质据信通过急剧减少构象移动性（conformational mobility)来保持它们的生物 活性。在s/o/w方法中，将聚合物溶解于有机溶剂中，其中分散固体蛋白质颗粒以生成主要 油包固体（s/o)悬浮液。然后将该悬浮液添加至含有乳化剂诸如PVA或PVP的水相中，以 形成s/o/w乳剂。然后将所得乳剂维持在搅拌下，以允许有机溶剂的萃取和蒸发和随后颗 粒的回收。
[0014] s/o/w方法中的主要问题之一是蛋白质颗粒微粉化，即用微粉化方法（包括冻干、 喷雾-干燥和喷雾-冷冻-干燥）降低这些固体颗粒的平均直径[6]。冻干，也称为冷冻干 燥，是一种脱水方法，其通过冷冻材料、然后降低周围压力以使材料中的冷冻水从固相直接 升华为气相而发挥作用。另一方面，喷雾干燥是一种通过用热气体迅速干燥而从液体或浆 料产生干燥粉末的方法。空气是加热的干燥介质；然而，如果液体是易燃溶剂诸如乙醇或产 物是氧敏感的，则使用氮气。最后，喷雾-冷冻-干燥简要地由以下组成：将液体溶液雾化为 低温气体或液体，伴随快速冷冻生成的小滴，随后在冷冻干燥期间在低温和压力下升华冰。
[0015] 事实上，通常使用喷雾干燥制备蛋白质微粒，尽管该方法具有问题，诸如低回收率 和由于热和物理应激导致的蛋白质变性和聚集的风险。
[0016] 在该过程期间，鉴于治疗性蛋白质（一般）和抗体（具体地）的高成本，高蛋白质 负载率和高囊化效率是关键参数。囊化效率（EE% )是指在微粒中检测到的活性分子的量 与初始引入有机相的活性分子的量相比的比率。尽管蛋白质负载率是指微粒中存在的活性 分子的量，通常表示为重量比。
[0017] 此外，对于特定应用诸如通过注射施用，可注射的颗粒的平均直径应当足够小足 以注射。通常，22-25号针（394 - 241 μπι的内径）用于静脉内输注以及肌内和皮下注射。 因此，特征在于低于250 μ m、理想地小于125 μ m的平均直径的颗粒被认为适合用于施用于 个体。粒径和粒径分布也是蛋白质释放速率中的重要因素，因为蛋白质递送的总表面积取 决于粒径[7]。
[0018] 本领域中需要提供用于制备包含抗体或其它治疗、诊断或预防蛋白质的基于聚合 物基质的颗粒的改进的方法。本领域中需要用于受控释放的包含抗体或其它治疗、诊断或 预防蛋白质的改进的基于聚合物基质的颗粒。本领域中需要提供用于制备基于聚合物基质 的颗粒的改进方法，所述基于聚合物基质的颗粒具有增加的囊化效率以便能够以商业上可 行的成本制备此类颗粒。
[0019] 发明概述
[0020] 本发明的一个目标是提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法。
[0021] 在一个实施方案中，本发明提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方 法，其包括以下步骤：从包含蛋白质的溶液使蛋白质凝固，将凝固的蛋白质与包含聚合物基 质的溶剂合并，在水中将包含聚合物基质和蛋白质的溶剂与乳剂乳化剂合并来稳定，搅拌 包含聚合物基质、蛋白质和乳化剂的溶剂以形成乳剂，将包含聚合物基质和蛋白质的乳剂 与水合并以允许颗粒形成，和回收颗粒。
[0022] 在根据本发明的方法的另一实施方案中，通过喷雾干燥进行凝固。
[0023] 在根据本发明的方法的另一实施方案中，所述聚合物是混合的D，L-乳酸和乙醇 酸的共聚物或L-乳酸和乙醇酸的共聚物。
[0024] 在根据本发明的方法的另一实施方案中，所述乳化剂是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷 酮。
[0025] 在另外的实施方案中，所述稳定剂可以是氨基酸诸如脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺 等，或者它可以是糖诸如蔗糖或海藻糖，或者它也可以选自多元醇诸如甘露糖醇、麦芽糖醇 或山梨糖醇，或上述的任何组合。
[0026] 在根据本发明的方法的另一个实施方案中，所述包含聚合物基质的溶剂是乙酸乙 酯。
[0027] 在另一个实施方案中，所述蛋白质是抗体。
[0028] 附图简述
[0029] 图1 :乳化速率（4500至13 500rpm)对以不同的PLGA浓度（1、10和15% )产生的 负载IgG的PLGA微粒的平均粒径的影响-图1显示粒径的观察值相对于乳化速率及PLGA 浓度。为了清楚起见，将平滑曲线（通过三次样条获得）添加至图中。
[0030] 图2 :负载IgG的PLGA微粒的扫描电子显微照片：（制剂25)表面孔隙率（a)放大 倍数800x和（b)放大倍数500x和横截之后的内部形态（c)放大倍数500x和（d)放大倍 数SOOx ;添加圆圈以帮助使可见微粒。
[0031] 图3 :通过荧光显微镜测定的负载IgG-FITC的PLGA微粒的分布。
[0032] 图4 :SD IgG量（30至IOOmg)和外相的体积（30、65和100ml)对负载IgG的PLGA 微粒的载药率w/w)的影响-图4显示载药率的观察值相对于SD IgG量及外相体积。 为了清楚起见，将平滑曲线（通过三次样条获得）添加至图中。
[0033] 图5 :理论载药率（4至36% w/w)对负载IgG的PLGA微粒的囊化效率（EE% )的 影响。图5显示EE%的观察值相对于理论载药率。为了清楚起见，将平滑曲线（通过三次 样条获得）添加至图中。
[0034] 图6 :PLGA浓度（1至15% w/v)对负载IgG的PLGA微粒的突释效应（24小时之 后释放的％ w/w IgG)的影响-图6显示突释效应的观察值相对于PLGA浓度。为了清楚起 见，将平滑曲线（通过三次样条获得）添加至图中。
[0035] 图7 :PLGA浓度（1至15 % w/v)对从负载IgG的PLGA微粒的IgG释放性质的影 响：（?)用1 % PLGA溶液产生的微粒的平均溶出曲线（η = 6)，（鲁）用5. 5% PLGA溶液 产生的微粒的平均溶出曲线（η = 3)，（▲)用10% PLGA溶液产生的微粒