[007引如图I所示例，运种方法包括：
[0079] (a)获得细胞因子细胞悬液，如含白细胞的液体（步骤105、115或135,或其组 合）；
[0080] 化）将组织与固相提取材料接触（步骤140);和
[0081] (C)从固相提取材料分离含蛋白质的液体（步骤150)。
[0082] 获得悬液105、115和135能包括产生含细胞液体的任意多种本领域已知方法。运 类方法包括从组织和培养物分离。获得悬液可在所述方法中直接进行，其中健康护理人员 或其他个体进行分离、加工、培养或其它方法W产生悬液，所述过程包括接触和分离步骤。 在一些实施方式中，产生悬液的方法与接触和分离步骤同时进行，作为照护过程的一部分， 如本文进一步所讨论。或者，获得悬液可W是间接的，仅设及获取悬液W用于接触和分离步 骤，其中产生悬液的加工处理之前由另一方完成。
[0083] 在各种实施方式中，获得包括从血液、脂肪组织、骨髓抽吸物或其它含细胞因子生 成细胞的组织中分离细胞因子细胞悬液，所述悬液包含白细胞或其它细胞因子生成细胞， 如图1的步骤110、120和125所示例。方法可包括从2、3或更多组织来源获得细胞因子细 胞悬液。
[0084] 从血液获得细胞因子细胞悬液
[0085] 在包括使用血液的实施方式中，血液可直接用于接触固相提取材料，如图1的步 骤140所示例，或在优选实施方式中，可加工所述血液W提供成分血，如PRP。产生成分血的 许多装置和方法为本领域已知，采用诸如离屯、和过滤等手段。
[0086] 在各种实施方式中，本技术方法包括用离屯、产生作为细胞因子细胞悬液的PRP。运 种方法一般包括将血液置于容器中，分离器可操作使血液分成2个或更多部分，并且离屯、 分离器W产生富血小板血浆部分。运类装置可包括管和置有浮标的管，其中所述浮标的密 度使得浮标能在管内组织离屯、后达到平衡位置，所述平衡位置在含白细胞的第一部分和第 二部分之间，第二部分的白细胞浓度大于第一部分的白细胞浓度。运种方法还包括对管进 行离屯、，从而所述浮标界定含白细胞的第一与第二部分之间的界面。然后，收集第二部分W 进一步用于本技术方法。
[0087] 本文所用的一个运种装置参见美国专利号7,992,725，Leach等，2011年8月9日 公开。运类装置市售可得，如来自己奥米特公司度iomet Biologies,化C)(美国印第安纳 州华沙）的GPS III血小板浓缩和分离系统。所述装置能用于临床或实验室环境W从悬液 或多组分组织材料中分离各部分，所述材料获自对象，如血液、骨髓抽吸物、脑脊液、脂肪组 织。分离部分可包括血小板、贫血小板血浆、富血小板血浆和基质细胞。所述分离部分各自 可在分离容器内具有平衡点或位置，当分离发生时可达到。例如，分离全血样品时，全血的 白膜层（PRP)的平衡位置在红细胞之上。
[0088] 分级分离装置200如图2所示例。分级分离装置200包括浮标210和容器壁215。 对分离容器205进行离屯、时，浮标周界210a和容器壁215有间隙，允许浮标210在分离容 器205内移动且材料能在浮标周界210a与容器壁215之间通过。或者，浮标210可具有开 口，如中屯、或内置式开口或者沿着浮标高度的外围通道，运允许材料穿过浮标。
[0089] 分离容器205中载有浮标210,浮标210的调谐密度配置成到达悬液的选定平衡位 置。所述浮标的密度调整在约l.Og/cc-约1. lOg/cc范围内，如约1.06g/cc。根据各种实 施方式，浮标210能设立成纳入调谐密度且能由一种或多种材料形成W达到调谐密度。
[0090] 如图2所示，分离过程发生后，收集区域220位于装置200内。收集区域220相对 于浮标210定义，位于容器内分开或分离的中间部分225的平衡位置。选定部分的平衡位 置能定义为相对于分开样品或材料的容器内其它部分，其在该容器内的位置。平衡位置还 能相对于浮标210或容器12的X轴定义。然而，平衡位置可取决于样品内一定量选定部分 的样品量。根据图12说明，部分230的平衡位置高于或比中间部分225的平衡位置更接近 装置200的顶部235。因此，浮标210能调整，如包括选定密度或特定重力，从而相对于任何 选定部分的平衡位置放置收集区域220。
[0091] 在一些实施方式中，浮标210能包括收集端口 240。收集端口 240与进入端口 245 连通并与浮标上表面250之上的收集空间220连通，并且能位于浮标周界210a附近。在一 些实施方式中，浮标未载有收集端口 240,反而收集端口是回收装置，如经进入端口或装置 200顶部插入的注射器。
[0092] 根据各种实施方式，分离器255与浮标210偶联。根据各种实施方式，分离器与浮 标的组合还能称为分离集合成员。例如，分离器255提供产生收集室220的方式且包括一 个或多个间隔器260、265 W使分离器255与浮标210位置分开，从而形成收集室220。分离 器255载有回收端口 270,连通回收端口 245与收集端口 240。间隔器260、265还能用作收 集端口 50与回收或回收端口 245之间的回路275。回收端口 245用作从收集室220回收经 分离或第二部分310的结构。
[0093] 含全血的装置200进行离屯、后，第一部分或顶端部分230可W是贫血小板血浆，中 间部分225可W是富血小板血浆或血小板浓缩物，底端部分278可W是红细胞。因此，分级 分离方法还包括从装置200回收所需部分。能提供多个端口 205、245和280 W允许进入装 置200的任何合适室。进入端口 205、245、280可W是允许从分离装置200外部连通该装置 内部的任何方式，如卢尔锁端口、隔片、阀或其它开口。另外，收集通气管285允许经开口 290移出收集区域220中的分离悬液，而不需移出分离器255之上的所述部分如血浆。即使 没有收集通气管285,分离器上的部分能移出且收集区域可排入分离器上的区域。
[0094] 采用分级分离装置200的方法可通过经进入端口 245输入全血而开始。分级分离 装置200置于离屯、机内并旋转，旋转时间适合分级分离全血。示例性时间段可W是约5分 钟-约20分钟，速度为约320巧m-约5000巧m。此速度可产生约7. 17xg-约1750xg (正常 重力倍数）的选定重力。
[0095] 可用于分离富血小板血浆的其它装置描述于例如美国专利 5, 585, 007, Antanavich, 1996年 12 月 17 日公开；美国专利号 6, 398, 972, Blasetti 等，2002 年6月4日公开；美国专利号6, 649, 072,化amlt等，2003年11月18日公开；美国专利 号 6, 790, 371, Dolocek, 2004 年 9 月 14 日公开；美国专利号 7, 011, 852, S址avaneshvar 等，2006年3月14日公开；美国专利号7, 179, 391，Leach等，2007年2月20日公开；美国专 利号 7, 374, 678, Leach 等，2008 年 5 月 20 日公开；美国专利号 7, 223, 346, Dorian 等，2007 年5月29日公开；和美国专利号7, 708, 152, Dorian等，2010年5月4日公开。
[009引除了GPS'"血小板浓缩和分离系统，多种其它市售可得装置能用于分离富血小 板血浆，包括Magellan?自体血小板分离器系统，可购自美敦力公司（Me化ronic, Inc.) (美国明尼苏达州明尼阿波利斯）！SmartPReP?，可购自Harvest技术公司化arvest Technologies Coloration)(美国马萨诸塞州普利茅斯）；DePuy(美国印第安纳州华沙）； AutoloGel?法，可购自切tomedix公司（切tomedix, Inc.)(美国马里兰州罗克维尔）； GenesisCS系统，可购自Em切te公司（Em切te Co巧oration)(美国佛罗里达州迈尔斯堡）； 和PCCS系统，可购自己奥米特3i公司度iomet 3i，Inc.)(美国佛罗里达州栋桐滩花园）。
[0097] 再次参考图1，获取自患者的血可在一个或多个步骤115、120、125和130中与抗凝 剂混合，从而有利于加工。合适的抗凝剂包括肝素、构祿酸盐憐酸盐葡萄糖（CPD)、乙二胺四 乙酸巧DTA)、抗凝巧樣酸葡萄糖溶液（ACD)和其混合物。例如，所述抗凝剂可置于用于从对 象采血的注射器中，或可在抽取后与血液混合。
[0098] 通过混合细胞与合适液体可制备含白细胞的液体，如步骤125所示，使用本领域 已知方法。例如，白细胞可如下从全血分离：通过裂解红细胞或用密度梯度离屯、全血，其 中白细胞沉淀到离屯、管底部。密度离屯、示例包括Ficoll-PaqueTM Plus (美国新泽西州皮 斯卡塔韦的通用电气医疗集团生命科学部（GE Healthcare Bio-Sciences))。一些情况 下，密度离屯、可用于进一步分离单核细胞与多形核细胞。白细胞还可用过滤从全血制备； 示例包括Acelere? MNC收获系统（美国密歇根州安阿伯市的颇尔生命科学（Pali Life Sciences))。白细胞还能从骨髓获得。随后，白细胞悬于适当介质如血浆，从而维持其活力。
[0099] 其它方法可用于产生富血小板血浆或含白细胞的其它液体。例如，全血能进行离 屯、，而不需用浮标系统，全血可在多个阶段中离屯、，能使用连续离屯、法，还能用过滤。另外， 含富血小板血浆的血液组分能如下生成：用慢速离屯、步骤分离血浆与红细胞W防止血小板 成团。在其它实施方式中，从离屯、血液形成的白膜层可与剩余血浆分离并重悬形成富血小 板血浆。
[0100] 从脂肪组织获得细胞因子细胞悬液
[0101] 在包括使用脂肪组织的实施方式中，所述脂肪组织可直接用于接触固相提取材 料，如图1的步骤140所示例，或所述脂肪组织可处理成提供步骤110的经分离脂肪细胞。 本方法还使用含脂肪来源干细胞的细胞部分。在一些实施方式中，脂肪组织源自通过躯干 抽吸辅助脂肪切除术或抽脂术分离的人皮下脂肪。基质细胞可用任何合适方法从脂肪组织 和/或组织部分分离，包括本领域已知方法如机械和分解离屯、。基质细胞还可用酶消化分 离。例如，基质细胞能从脂肪组织提取物中分离，通过超声波和/或酶消化处理，离屯、富集。 分离自脂肪组织的基质细胞可洗涂和成团。
[0102] 例如，在专用收集容器内通过躯干抽吸辅助肿胀吸脂术能收集脂肪组织，所述容 器连接吸入软管和吸脂管。收集容器可具有纱布型网格，允许肿胀液通过并保留固体脂肪 组织。收集脂肪组织后，收集容器从抽吸装置中移出并重新连接离屯、装置。过滤单元还可 包含孔径约100微米的滤器。一旦含脂肪组织的收集容器连接离屯、装置，对组织进行超声 波处理。超声波处理后，将完整设备插入离屯、桶并W例如300xg离屯、5分钟。离屯、后，收集 容器与过滤单元一起分离且可弃去。随后，含基质细胞的团块能重悬于生物相容性溶液，如 血浆、血浆浓缩物和富血小板血浆。
[0103] 用于分离和/或分级分离脂肪组织及脂肪细胞的多种方法和装置包括W下 专利所述的那些：美国专利号7, 374, 678, Leach, 2008年5月20日公开；美国专利号 7, 179,391，Leach等，2007 年 2 月 20 日公开；美国专利号 7, 992,725, Leach等，2011 年 8月9日公开；美国专利号7,806,276，Leach等，2010年10月5日公开；和美国专利号 8, 048, 297, Leach等，2011年11月I日公开。诸如GPS?血小板浓缩系统的装置市售获自 己奥米特公司（美国印第安纳州华沙），可用于分离脂肪细胞。
[0104] 从骨髓获得含白细胞的液体
[0105] 在包括使用骨髓的实施方式中，所述骨髓可直接用于接触固相提取材料，如图1 的步骤140所示例，或可处理成提供步骤135的骨髓浓缩物。获得和浓缩骨髓的许多装置 及方法为本领域已知。
[0106] -种分离和产生骨髓浓缩物（cBMA)的不例性过程如图6所不。一般，方法600可 起始于步骤605,获得骨髓抽吸物体积。骨髓抽吸物度MA)可W任何选定或一般已知方式获 得。例如，选定骨区域如接近外科手术的部分，能用于获得骨髓抽吸物。一般，进入装置如 注射器和针能用于进入选定骨的髓内区域。可从多个位置抽取小体积的选定部分W获得适 当体积的BM或选定BM部分。
[0107] 一旦步骤605获得选定体积的BMA，其可用重力分离器分离并浓缩。本文所用 的分离器可操作分离多组分流体，所述流体一般包括混杂或混合在一起的不同密度的多 种组分或成分，包括上述用于分离来自血液和脂肪组织的部分的那些。分离器可包括相 对于BMA具有选定密度的浮标。运种分离器包括上述用于浓缩和分离来自血液和脂肪 组织的部分的那些，包括W下专利所述的那些：美国专利号7, 374, 678, Leach, 2008年 5月20日公开；美国专利号7, 179, 391，Leach等，2007年2月20日公开；美国专利号 7, 992, 725, Leach 等，2011 年 8 月 9 日公开；美国专利号 7, 806, 276, Leach 等，2010 年 10 月5日公开；和美国专利号8,048,297，Leach等，2011年11月1日公开。诸如GPS?血 小板浓缩系统的装置市售获自己奥米特公司（美国印第安纳州华沙），能用于分离脂肪细 胞。例如，可用于在步骤610和615分级分离BMA的分离器和方法还描述于美国申请公开 号2006/0278588, Woodell-May, 2006年12月14日公开。根据各种实施方式，BMA可在步 骤610中置于分离器内。一旦BMA置于分离器内，选定部分的BMA可在步骤615中与BMA 分离。
[010引一旦BMA置于分离器内，分离器在离屯、机中W约1,000-约8, OOORPM范围旋转。运 对分离器和BMA生成正常重力的约65-约4500倍的力，如本领域通常所计算。在此力作用 下，BMA样品中密度较高的物质被推向管底部。因此，分离器能用于从骨髓样品移出有核细 胞。在各种实施方式中，浓缩BMA的有核细胞浓度是BMA中有核细胞浓度的至少2倍、至少 3倍、至少4倍、或至少5倍。
[0109] 从血凝块获得含有白细胞的液体
[0110] 在包括使用血液的其它实施方式中，含细胞因子生成细胞的液体陷于血凝块内。 通过压缩（"挤压"）、血块破碎或离屯、能从血凝块产生细胞释放物。通过联合血或成分血 与凝血剂，血凝块能用或未用抗凝剂且用或未用外源性凝血酶制备。合适的凝血剂包括凝 血酶（如牛、重组人、混和人或自体）、自体凝血蛋白和聚乙二醇。巧可采用巧盐形式，如氯 化巧。
[0111] 在一些实施方式中，所述凝血剂包括凝血蛋白，其可W是来源于血液的凝血部分， 所述血液获得自待治疗的患者。合适的凝血部分能通过如下方法获得：用巧溶液（如溶于 乙醇的氯化巧）将全血或血浆加样到血分离装置；可选加热全血或血浆至少约20分钟，溫 度为至少约20