些实施方式中，从尿中分离抗炎性细胞因子，用于生成本技术的蛋白质溶液。 蛋白质能通过本领域已知方法从尿中分离。一个运种方法用于ProteoSpinTM尿蛋白浓缩 Maxi试剂盒，所述试剂盒获自Norgen Biotek公司（Norgen Biotek Co巧.）（加拿大安大略 省索罗尔德）。此试剂盒采用并入旋转柱的离子交换树脂。简言之，获得尿样品且其抑调 至3. 5。尿随后转至含离子交换树脂的旋转柱，其置于收集管中。之后柱进行离屯、，其中蛋 白质附于树脂，剩余液体和盐流入收集管并弃去。随后，用提供的柱活化和洗涂缓冲剂清洗 蛋白质，接着离屯、。弃去通过的流体，重复洗涂过程。向柱加入洗脱缓冲剂（IOmM憐酸钢， pH 12.5)且向洗脱管加入中和剂。含洗脱缓冲剂的旋转柱置于洗脱管中并离屯、，其中洗脱 蛋白质并在含中和剂的洗脱管内捕获。
[0166] 治疗组合物
[0167] 本技术还提供含蛋白质溶液和含活性物质、生理学运载体和其组合的第二组分的 组合物。在一些实施方式中，组合物包含安全和有效量的蛋白质溶液W及安全和有效量的 第二活性剂。"安全和有效"量的组分是用于本技术方法时，足W在人或哺乳动物对象中产 生所需治疗效果的量，而没有过度不良副作用（如毒性、刺激或变态反应），具有合理的利 益/风险比。特定安全和有效量的组分显然随着诸如W下因素而变化：所治疗具体病症、患 者的身体状况、同期疗法（如果有）性质、所用特定组分、特定给药途径和剂型、所用运载体 (如果有）、和所需剂量方案。
[016引本文所用活性物质包括生物和药物活性剂。生物活性剂包括成分血，如PRP、血液 制品和浓缩骨髓抽吸物（CBM)。
[0169] 因此，在一些实施方式中，本技术提供含安全和有效量蛋白质溶液W及安全和有 效量CBMA的组合物。CBMA能包括造血干细胞、基质干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、红 细胞、白细胞、成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞或内皮细胞。如上所述，可制备蛋白质溶 液，使用骨髓抽吸物作为含细胞因子的组织。然而，治疗组合物可额外包含CBMA与蛋白质 溶液。在一个实施方式中，治疗组合物包括蛋白质溶液和cBMA，蛋白质溶液：CBMA之比是 约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。或者，蛋白 质溶液：cBMA之比可W是约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约 10:1。CBMA和蛋白质溶液还可同时生成。因此，参考图1和上述过程，在步骤140的接触 固相提取材料之前或期间，可向步骤115所得全血加入骨髓抽吸物；运种过程设及操作步 骤115和130。例如，在步骤120的富血小板血浆分离之前或期间，可向全血加入骨髓抽吸 物。运类方法包括W下所述那些：美国专利公开号2006/0278588, Woodell-May, 2006年12 月14日公开。
[0170] 在一些实施方式中，所述CBMA和带白巧溶液可W同时产生。因此，参考图1和上述 方法，可W在步骤140中的与固相提取材料接触之前或期间，将骨髓抽吸物添加到步骤115 中获得的全血；运种方法设及步骤115和130的操作。例如，可W在步骤120中的分离富血 小板血浆之前或期间将骨髓抽吸物添加全血。运类方法包括W下所述那些：美国专利公开 号 2006/0278588, Woodell-May, 2006 年 12 月 14 日公开。
[0171] 本文所用的药物活性剂包括有机分子、蛋白质、肤、模拟肤、核酸、核蛋白、反义分 子、多糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物和多糖、植物提取物W及其合成和生物工程类似物、 活细胞（白细胞基质细胞W外）如软骨细胞、骨髓细胞、病毒和病毒颗粒、天然提取物、和其 组合。生物活性物质的特定非限制性示例包括激素、抗生素和其它抗感染剂、生血剂、促血 小板生成素（thrombopoietics)、抗病毒剂、抗肿瘤剂（化疗剂）、退热剂、镇痛药、抗炎剂、 抗过敏剂、血管扩张剂、细胞因子、生长因子、基因调节剂、维生素、矿物质和其它营养品、保 健营养品和其组合。在一些实施方式中，除所述蛋白质溶液中所存在生长因子W外组合物 还可包含如血小板来源的生长因子（PDGF)、转化生长因子0 (TGF-P)、膜岛素样生长因子 (IGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、表皮生长因子巧GF)、血管内皮生长因子（VEG巧和骨形 态发生蛋白度MP)的那些。
[0172] 除了含所述蛋白质溶液的任何液体W外，所述组合物可包含运载体物质。应理解 在本技术的各种实施方式中，治疗方法采用如上所含和制备的蛋白质溶液，而没有更多运 载体，通过直接注射或另外施用于治疗位点。然而，在一些其它实施方式中，可出于诸如易 于施用、用特定递送装置帮助施用、提高活性、增加蛋白质溶液在施用位点维持的时间长度 等原因而使用额外运载体物质。本文所用的运载体包括盐水、透明质酸、胶原蛋白、缓冲液 (如汉克缓冲液）、细胞培养基、血液制品（如PRP和贫血小板血浆）和其混合物。
[0173] 蛋白质溶液和含蛋白质溶液的组合物可在施用前通过任何合适方法灭菌。例如， 蛋白质溶液可如下灭菌：纳入无菌过滤器W处理由上述过程制备的产品。在一些实施方式 中，抗生素可在上述接触步骤中纳入固相提取材料，或可在一个或多个本文所述方法和治 疗的不同步骤中加入。或者或另外，所述蛋白质溶液可无菌生成。
[0174] 蛋白质溶液和含蛋白质溶液的组合物还可在生成后冻干（冷冻干燥或冻干），用 本领域已知方法。因此，如图1所示，所述蛋白质溶液能在从固相提取材料分离后冻干160。 冷冻干燥时，抗炎性细胞因子组合物可用盐水水合，在施用前或施用时。冷冻干燥时，抗炎 性细胞因子组合物可用合适介质水合，在施用前或施用时。通过混合组合物与溶液可完成 水合，所述溶液包括盐水、缓冲液、血液、成分血、骨髓抽吸物、浓缩骨髓抽吸物和其组合。
[0175] 本技术还提供含血液或其它组织来源的组分的组合物，其适合同种异体施用。特 别地，运类组合物可包括分离自哺乳动物对象或多个哺乳动物对象的蛋白质和其它组分， 所述对象是在本技术方法中给其施用组合物的对象W外的那些。进一步参考图1，从固相提 取材料分离蛋白质溶液后，冷冻干燥使得组合物适宜同种异体施用，所述组合物通过含有 白细胞的液体接触固相提取材料来制备，如步骤160所示。在一些实施方式中，所述组合物 能处理成移出接触步骤140后蛋白质溶液组合物中存在的白细胞。移出白细胞的方法包括 本领域已知的那些，包括过滤、凝结和重量法。在一些实施方式中，分离含血浆的成分血和 移出白细胞基本上同时进行。因此，本技术提供制备非免疫原性抗炎性细胞因子组合物的 方法，所述方法包括：
[0176] (a)从哺乳动物供体获得细胞因子细胞悬液；
[0177] 化）所述液体与固相提取材料接触W产生富含白介素-1受体括抗剂的组合物；
[017引 （C)进行W下之一或两者：
[0179] a)从所述组合物移出细胞讯
[0180] (ii)冷冻（如冷冻干燥）组合物W生成非免疫原性抗炎性细胞因子组合物。
[0181] 在一些实施方式中，向所述蛋白质溶液加入冻存储液，W提供后续低溫存储的稳 定性。合适的储液包括本领域的那些，如甘油和二甲亚讽值MS0)。所述组合物可低溫保存， 如约rc-约6°C。在一些实施方式中，所述组合物在约-80°c液氮下保存。所述冻存储液 优选在给哺乳动物对象施用前从蛋白质溶液中移出。移出储液可由本领域已知方法进行， 所述方法用于处理含冻存剂的胆存血液。用洗液如盐水进行洗涂。在运些实施方式中，待 治疗对象的血型可与获得细胞因子细胞悬液的供体血型匹配。
[0182] 治疗方法
[0183] 本技术提供在人或其它哺乳动物对象中治疗疼痛疾病的方法，包括将本技术的蛋 白质溶液施用施用到所述对象中的疼痛位置。如本文所述，"治疗"包括防止、减轻和消除疼 痛的一或多种。疼痛疾病可W是急性或慢性的，并且可W与引起疼痛的潜在的骨、肌肉、软 骨、血管组织或其它组织的伤害、创伤、疾病或其它生理机能不全相关。在各种实施方式中， 所述疼痛疾病与炎症性疾病相关，包括ILl-ra介导的炎症。运种炎症性疾病包括类风湿性 关节炎、骨关节炎、骨质溶解、肌腫炎、滑膜炎、外周血管疾病、和炎症性呼吸道疾病（如慢 性阻塞性肺病、纤维化、气肿、急性呼吸窘迫综合征和肺炎）。具体的疼痛疾病包括与创伤 性损伤、肌肉拉伤、关节炎（类风湿性关节炎和骨关节炎）、滑膜炎、紙骼关节病变、背疾、术 后注射、肌腫注射、运动医学手术（例如A化修复、M化修复、BTB修复、骸骨修复或软骨修 复）、挫伤、肌肉拉伤、创伤后骨关节炎相关的疼痛。
[0184] 在各种实施方式中，方法用于治疗人中的疼痛疾病。在其它实施方式中，治疗用于 非人哺乳动物，如陪伴、役用和运动类动物。例如，此技术的运些方法可用于治疗马的与关 节伤害相关的疼痛。
[0185] 在各种实施方式中，本技术的方法包括制备蛋白质溶液的照护方法。如本文所示， "照护方法"中本技术的方法在给所治疗对象施用所述蛋白质溶液的时间附近进行。运类方 法可在临近位置进行，如同一房间（例如床边）或另外紧邻用所述蛋白质溶液治疗的哺乳 动物对象。在各种实施方式中，"相邻时间"可W是例如所述蛋白质溶液施用对象的12小时 内、8小时内、2小时内、1小时内或30分钟内。
[0186] 在一些实施方式中，所述蛋白质溶液与伴随治疗一起施用。例如，运种疗法包括施 用上述药物活性剂或生物活性剂。在一些实施方式中，伴随治疗与蛋白质溶液同时施用。例 如，方法可包括用安全和有效量的活性剂施用蛋白质溶液，所述活性剂选自镇痛药和糖皮 质激素。
[0187] 在一些实施方式中，方法包括用上述浓缩骨髓抽吸物施用蛋白质溶液。例如，CBMA 与蛋白质溶液可同时施用。
[0188] 本技术的方法一般包括向哺乳动物对象疼痛位置施用蛋白质溶液。施用蛋白质溶 液能用任何合适装置进行，包括本领域已知用于局部递送组合物到肌肉、关节、血管、肺或 其它组织的装置。例如，用于治疗与关节疾病相关的疼痛的局部递送可包括在关节处或附 近注射蛋白质溶液。治疗炎症性呼吸道疾病相关的疼痛可包括通过气管内导管、吸入器和 喷雾器递送蛋白质溶液。
[0189] 本技术的实施方式通过下列非限制性实施例进一步说明。
[0190] 实施例1 :制备和鉴定蛋白质溶液
[0191] 富含白介素-I受体括抗剂的蛋白质溶液制备自7个签署知情同意书的人供体。将 血液巧5血）吸入带5血巧樣酸葡萄糖抗凝液A (ACD-A，马萨诸塞州布伦特里的Citra Ubs) 的60CC注射器。富血小板血浆（PR巧用GPS吸III血小板浓缩系统（800-1003A，印第安纳 州华沙己奥米特公司）根据使用说明书产生。通过向含1克聚丙締酷胺珠的改良Plasmax 装置（印第安纳州华沙己奥米特公司）加入6mL PRP，产生所述溶液。从Plasmax装置移出 IL-Ira溶液并在-50°C冷冻W用于测定。细胞因子含量在16-plex ELISA(Searchli曲t蛋 白质阵列，马萨诸塞州比尔里卡的Aushon生物系统公司（Aushon Biosystems))上测定。分 析物包括Iレ4、IレlO、Iレll、IレI3、IレIra、IFN-丫、sTNF-RI、sTNF-RII、Iレla、IレI0、 TNF-Q、比-17、比-18、bFGF、TBF-0 1 和 TBF-0 2。
[0192] 所述溶液含有同化细胞因子化FGF、TGF- e 1、TGF- e 2 (见表2))和抗炎性细胞因 子（比-Ira、sTNF-RI、sTNF-RII、比-4、比-10、比-11、比-13、IFN-丫（见表 3))，不表达大 剂量异化细胞因子（IL-1 a、比-I 0、TNF-a、IL-17、IL-18 (见表4))。抗炎性细胞因子 IX-Ira和sTNF-R均W ng/mL量检测，而所有异化分析物采用pg/mL量。然而，检测到供体 间变异性。对比异化细胞因子比-1和TNF- a与抗炎分析物比-Ira和sTNF-R之间的相关 性，未检测到大相关性（表5)。平均来说，比-Ira是比-1 a的约13, 260倍且是比-1 0的 约7, 561倍。
[0193] 表2.溶液中的同化细胞因子
[0196] 表3.溶液中的抗炎性细胞因子
[019引表4.溶液中的异化细胞因子
[0200] 表5.相关性分析
[020引实施例2 :从富血小板血浆产生比-Ira
[020引比-Ira溶液如下产生。从5个健康志愿者中采全血（70血)，用ACD-A(美国马萨 诸塞州布伦特里）抗凝（10% )。保留部分（IOmL)用于全血测量。富血小板血浆（PRP) 化血）用GPS吸II系统（印第安纳州华沙己奥米特公司）产生。根据验证程序收集全 血和 PRP 样品的血细胞计数，如 Woodell-May JE, Ridderman DN, Swift MJ, Higgins J." 生成富血小板血浆的准确血小板计数：血液分析器验证和计数的制备技术（PrO化C ing Accurate Platelet Counts for Platelet Rich Plasma:Validation of a Hematology A打过Iyzer 过打d Prepsrstioo Techniques for Cou打ti打g)"J. Cr过打iof过c. Surg. (2005)9 月 16日巧）：749-56所述。
[0204] PRP生成后，向改良血浆浓缩装置（Plasmax?，美国印第安纳州华沙己奥米特公 司）加入5mL PRP，用装置内的聚丙締酷胺脱水珠室溫溫育24小时。与聚丙締酷胺珠电磁 场接触后，离屯、血浆浓缩装置W分离血清部分。
[020引为分析时间零点时的基线比-Ira水平，全血和PRP样品用50 y L凝血酶和10% CaC12(l，000单位/mL)活化。形成血凝块并室溫溫育30分钟。溫育后，所述凝块W 3, 00化pm离屯、5分钟。从凝块中收集血清并保留用于化ISA分析。来自血浆浓缩器的血 清部分不需要通过凝血酶活化，可直接测试。分析所有样品的IL-lra，使用ELISA试剂盒 (比-Ira如antikine?试剂盒，美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物（R&D Systems))。
[0206] PRP样品产生约8倍血小板增加、约5倍总白细胞（WBC)增加、约9倍WBC单核细 胞部分增加、和约3倍WBC PMN部分增加。全血和PRP样品的比-Ira生成与WBC浓度最紧 密相关。PRP的5倍增长可能源于WBC增加，全血和PRP比-lra值都能视作基线比-Ira含 量。运与血浆浓缩器溫育后IL-Ira增长195倍不同。此血浆浓缩装置通常引起血浆蛋白 质浓度增加3倍，运归因于干燥过程导致体积减少。此3倍体积减少不引起所见的IL-Ira 量水平增加。因此，此水平增加指示在接触固相提取材料（如聚丙締酷胺珠）和电磁场刺 激期间刺激WBC生成比-Ira。
[0207] 相关性分析显示比-Ira生成与WBC增加的关联比血小板含量更密切。比-Ira水 平与PRP中的单核细胞