群不紧密相关。运不令人惊讶，因为单核细胞未活化，且通过凝血酶 活化血浆来收集血清。然而，可能一旦单核细胞在血浆浓缩装置中活化，其参与所见的显著 比-Ir曰生成。
[020引实施例3 :从PRP生成蛋白质溶液
[020引从5个人供体收集抗凝血（120CC)。富血小板血浆（PR巧用一次性GPS巧III (印 第安纳州华沙己奥米特公司）制备。将PRP加样到改良血浆浓缩装置（Plasmax?，美国印 第安纳州华沙己奥米特公司）并处理。输出分成4组：有和没有凝血酶活化（1M CaC12 中lOOOU/mL)的浓缩血浆中的比-Ira，有和没有凝血酶活化的无细胞比-Ira。比-Ira用 ELISA(安迪生物）随着时间测量。
[0210] PRP接触Plasmax?装置中的聚丙締酷胺珠，同时用电容禪合电磁场提供电磁场刺 激。
[0211] 未凝结PRP在24小时内平均生成约50ng。无细胞样品在24小时内平均生成约 34ng，而没有变化。一旦凝结，IL-Ira洗脱变慢，10小时后仅约30%洗脱。无细胞样品释 放也延迟，但10小时后洗脱100%可用比-Ira。
[0212] 实施例4 :产生蛋白质溶液和鉴定健康对象及骨关节炎对象中的细胞因子水平
[0213] 来自健康患者的自体蛋白质溶液（AP巧如下制备W用于测量生长因子。从6个 供体通过静脉穿刺各采72ml抗凝全血。3ml的各供体抗凝全血等分到微量离屯、管中并 于-50°C冷冻。将60ml抗凝全血加样到GPS饭III 一次性装置（美国印第安纳州华沙 己奥米特公司），根据厂商说明书处理W生成PRP。PRP从GPSd) III装置中移出并加入 Plasmax?装置（美国印第安纳州华沙己奥米特公司），根据厂商说明书处理W生成APS。从 各装置提取APS，等分到微量离屯、管中，-50°C冷冻。全血和PRP的各样品接受3个冻融循 环。就各AI^和全血样品而言，用于￥66。、？〇6。-88、？〇6。-48、66。^6。-0 1、16。斗2和16尸-1 的如antikine人免疫测定（美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物）根据厂商说明书 一式两份进行。
[0214] 来自健康患者的AI^如上制备W用于测量抗炎性细胞因子。就各AI^和全血样品 而言，用于比-Ira、比-10、比-8、sTNF-RI、TNF-a、比-6、sTNF-RII、比-10、比-13 和比-4 的如antikine人免疫测定（美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物）根据厂商说明书 一式两份进行。还进行免疫测定W检测肝细胞生长因子（HG巧和可溶性IL-1RII。
[021引来自105名骨关节炎患者的APS如上制备W用于测量生长因子抗炎性细胞因子。 APS在-50°C或干冰保存。
[0216] 对比健康供体与OA患者在基线血液和APS中的细胞因子浓度。比-I e在OA患 者中浓缩水平更高，但倍数增加仍远低于IL-lra。浓缩到至少健康供体所见水平的其它细 胞因子和生长因子包括sTNF-RI、IGF-I、比-8、VEGF和比-6。可溶性细胞因子sTNF-RII和 SlklRII浓缩到与健康浓缩水平极类似的水平，虽然没有那么高。结果示于表6。
[0217] 表6.从健康患者和骨关节炎患者所得APS的生长因子及抗炎性细胞因子浓度 (pg/ml)
[0220] 实施例5 :从脂肪组织产生蛋白质溶液
[0221] 脂肪基质细胞如下制备。脂肪组织切成小块（约lcm3)，用2mg/血I型胶原酶（新 泽西州莱克伍德的沃辛顿生化公司（Wcxrthington Biochemical Co巧.））在间歇式机械揽 拌下37°C水浴消化180分钟。通过加入培养基或血源性溶液可中和消化作用。离屯、细胞悬 液（300xg持续7分钟，25°C )，然后从细胞团块中移出上清。随后，团块重悬于相容溶液W 提供含脂肪基质细胞的液体体积。
[022引或者，所述团块悬于获自对象的全血，加入GPS?血小板浓缩系统，所述系统来自 己奥米特公司（美国印第安纳州华沙）。离屯、后，从该系统提取富血小板血浆层，其还包含 脂肪基质细胞。
[0223] 脂肪基质细胞可选包括富血小板血浆层，随后与聚丙締酷胺珠组合并通过使用一 对亥姆霍兹线圈施加脉冲电磁场W刺激IL-Ira生成。脂肪基质细胞和聚丙締酷胺珠与液 体溶液分离获得富含比-lra的溶液。
[0224] 实施例6 :从脂肪组织提取物产生蛋白质溶液
[022引IL-Ira的治疗组合物从分离自脂肪组织的基质细胞产生。分离人基质细胞如下进 行：从吸脂/抽脂术获得人皮下脂肪组织，在I型胶原酶溶液（新泽西州莱克伍德的沃辛顿 生化公司）中消化，37°C溫和揽拌1小时。解离细胞用500 ym和250 ym Nitex滤器过滤。 所述部分W 300xg离屯、5分钟。弃上清，细胞团块重悬于相容溶液如血源性溶液。
[0226] 术语的非限制性讨论
[0227] 本文所用的标题（如"【背景技术】"和"
【发明内容】
"）和副标题仅用于本公开范围内 主题的一般结构，且不意在限制本技术公开内容或其任何方面。特别地，"【背景技术】"中公开 的主题物可包括新技术且不构成对现有技术的列举。"
【发明内容】
"中公开的主题物不是本技 术或其任何实施方式完整范围的全部或完全公开。本说明书章节内的材料出于方便按具体 效用分类或讨论，但不应由此推论该材料用于任何给定组合物时，必须或仅根据本文分类 起作用。
[022引本公开引用的所有专利和专利申请的公开内容通过引用纳入本文。
[0229] 描述本技术实施方式的说明和特定实施例仅用于阐述目的且不意在限制本技术 范围。特定实施方式、材料、组合物和方法的等价改变、修改和变化在本技术范围内作出，结 果基本相似。此外，列举有所示特征的各种实施方式不意在排除有另外特征的其它实施方 式，或纳入不同组合所示特征的其它实施方式。提供特定实施例W阐明如何制备和应用本 技术的组合物及方法，且除非另有明确说明，否则不用于表示本技术的给定实施方式有或 没有进行或测试。
[0230] 本文所用的单词"优选"或"优选的"指本技术的实施方式在某些情况下提供特定 益处。然而，其它实施方式也可在相同或其它情况下优选。此外，列举一个或多个优选实施 方式不意味着其它实施方式没有用，且不意在从本技术范围中排除其它实施方式。
[0231] 本文所用的单词"包括"和其变体无限制性，从而在列表上列出条目不排除其它类 似条目也可用于本技术的材料、组合物、装置和方法。类似地，术语"能"和"可"及其变体 无限制性，从而关于实施方式能或可包括某些元件或特征的叙述不排除未含有运些元件或 特征的本技术其它实施方式。
[0232] 尽管开放式术语"包括"作为非限制性术语如包括、包含或具有的同义词，在本文 中用于描述本技术的实施方式并要求权利，但实施方式可用更具限制性术语"由……组成" 或"基本由……组成"替代描述。因此，对于列举材料、组分或方法步骤的任何给定实施方 式，本技术还特定包括由所述材料、组分或方法组成的实施方式，或基本由其组成，排除额 外材料、组分或方法（用于"由……组成"）和排除影响实施方式重要性质的额外材料、组 分或方法（用于"基本由……组成"），尽管运些额外材料、组分或方法在本申请中未明确详 述。例如，列举元件A、B和C的组合物或方法详述特定设想了由A、B和C组成的实施方式， 或基本由其组成，排除本领域可能列举的元件D，尽管元件D未明确描述为被本文排除。此 夕F，如本文所用，术语"基本由所列举材料或组分组成"设想了"由所列举材料或组分组成" 的实施方式。
[0233] 本文所用的"一个"和"一种"表明存在"至少一个"项目；可能时，可存在多个运类 项目。"约"用于数值时，表明计算或测量允许数值略微不精确（用一些方法来达到值精确； 近似或相当接近值；几乎）。出于某种原因，如果"约"提供的不精确根据此通常意义在本领 域无法理解，则本文所用的"约"表明测量或使用运类参数的普通方法至少可引起变化。
[0234] 如本文所示，除非另有特定说明，范围涵盖终点且包括披露所有不同值和完整范 围内的更多划分范围。因此，例如，"从A到B"或"从约A到约B"的范围涵盖A和B。披露 特定参数（如溫度、分子量、重量比分比等）的值和值范围不排除本文所用的其它值和值范 围。设想给定参数的2个或更多特定示例值可定义所述参数要求的值范围终点。例如，若参 数X在本文中例示具有值A且还例示具有值Z，设想参数X可具有从约A到约Z的值范围。 类似地，设想披露参数的2个或更多值范围（无论所述范围是嵌套、重叠或是不同的）会归 入该值所有可能的范围组合，其可W用所公开范围的终点要求。例如，若参数X在本文中例 示具有1-10、或2-9、或3-8的值范围，还设想参数X可具有包括1-9、1-8、1-3、1-2、2-10、 2-8、2-3、3-10和3-9在内的其它值范围。
【主权项】
1. 用于治疗哺乳动物对象中疼痛疾病的方法，包括将来源于血液的组合物局部施用 到疼痛位置，所述组合物包含选自IL-lra、sTNF-Rl、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、 TOGF-BB、VEGF、TGF-β1和sIL-lRII的至少两种蛋白质，其中各蛋白质在所述组合物中的 浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。2. 权利要求1的方法，其中所述来源于血液的组合物是所述对象自体的。3. 权利要求1的方法，其中所述来源于血液的组合物包含 (a) 至少约 10,OOOpg/ml的ILl-ra; (b) 至少约 1，200pg/ml的sTNF-RI;和 (c) 蛋白质，选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、 sIL-lRII及其混合物，其中所述蛋白质的浓度高于正常血液中所述蛋白质的基线浓度。4. 用于治疗哺乳动物对象中疼痛疾病的方法，包括将来源于血液的组合物局部施用到 疼痛位置，所述组合物包含 (a) 白介素-1受体拮抗剂（IL-lra)，浓度是正常血液中的IL-lra浓度的至少3倍； (b) 可溶性组织坏死因子-rl(sTNF-rl)，浓度是正常血液中的IL-lra浓度的至少2 倍； (c) 白细胞，浓度是正常血液中的白细胞浓度的至少2倍；和 (d) 血小板，浓度是正常血液中的血小板浓度的至少2倍。5. 权利要求4的方法，其中所述组合物进一步包含选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、 TOGF-AB、TOGF-BB、VEGF、TGF-β1、sIL-1RII及其混合物的蛋白质，其中所述蛋白质在所述 组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。6. 权利要求4的方法，其中所述组合物进一步包含浓缩的骨髓抽吸物。7. 用于治疗哺乳动物对象中疼痛疾病的方法，包括： (a) 从所述对象获得细胞因子细胞悬液； (b) 分级分离所述悬液以产生包含白介素-1受体拮抗剂的自体的蛋白质溶液； (c) 将所述自体的蛋白质溶液施用到所述对象中的疼痛位置。8. 权利要求9的方法，其中所述细胞因子细胞悬液包含全血、骨髓抽吸物、脂肪组织、 尿液、其部分和其混合物。9. 权利要求8的方法，其中所述液体是富血小板血浆或骨髓浓缩物。10. 权利要求7的方法，其中所述分级分离包括将血液置于容器，可操作以将所述血液 分离为两或多个部分的分离器；以及离心所述分离器以产生富血小板血浆部分。11. 权利要求10的方法，其中所述分级分离进一步包括将所述富血小板血浆与聚丙烯 酰胺珠接触，并将所述富血小板血浆与所述聚丙烯酰胺珠分离以形成所述自体的蛋白质溶 液。12. 权利要求7的方法，其中所述分级分离包括： (1) 将包含全血、骨髓抽吸物或两者的组织和抗凝剂加样到置有浮标的管内，其中所述 浮标的密度使得浮标能在管内组织离心后达到平衡位置，所述平衡位置在包含细胞因子生 成细胞的第一部分和第二部分之间，第二部分的细胞浓度大于第一部分的白细胞浓度； (2) 对管进行离心，从而所述浮标界定第一部分与第二部分之间的界面；和 (3) 收集第二部分； (4) 将所述第二部分加样到包含固相提取材料的浓缩器组件，温育与固相提取材料接 触的第二部分；和 (5) 旋转浓缩器组件，采用的离心速度能分离固相提取材料和富含白介素-1受体拮抗 剂的溶液，所述溶液的白介素-1受体拮抗剂浓度大于全血。13. 权利要求12的方法，其中所述固相提取材料选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、 聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和其组合。14. 权利要求13的方法，其中所述固相提取材料包含聚丙烯酰胺。15. 权利要求13的方法，其中所述固相提取材料的形式选自珠、纤维、粉末、多孔材料 和其组合。16. 权利要求7的方法，进一步包括： (d) 从所述对象获得骨髓抽吸物； (e) 浓缩所述骨髓抽吸物以产生浓缩的骨髓抽吸物（cBMA); (f) 给所述对象施用cBMA。17. 权利要求16的方法，其中在分级分离所述血液期间或之前将所述骨髓抽吸物与所 述血液混合。18. 权利要求7的方法，进一步包括给所述对象施用伴随的疼痛管理治疗。19. 权利要求18的方法，其中所述疼痛管理治疗包括将包含透明质酸、胶原蛋白、类固 醇、微球体、镇痛药和其组合的组合物施用到疼痛位置。20. 权利要求18的方法，其中所述疼痛管理治疗包括使用减负型支具（offloader brace)、电刺激和其组合。21. 权利要求18的方法，其中所述治疗包括施用选自镇痛药、类固醇和其组合的的系 统性药物。22. 权利要求7的方法，其中所述哺乳动物对象是人。23. 权利要求7的方法，其中所述哺乳动物对象是陪伴、役用或运动类动物。24. 权利要求7的方法，其中所述细胞因子细胞悬液是所述哺乳动物对象自体的。25. 权利要求7的方法，其中所述疾病是与骨关节炎相关的疼痛、与滑膜炎相关的疼 痛、骶髂关节疼痛、背部疼痛、与手术后注射相关的疼痛、与肌腱注射相关的疼痛、与运动医 学过程相关的疼痛、与挫伤相关的疼痛、与肌肉拉伤相关的疼痛、与肺气肿相关的疼痛或与 创伤性损伤后骨关节炎相关的疼痛。26. 权利要求25的方法，其中所述疾病是与选自ACL修复、MCL修复、BTB修复、髌骨修 复和软骨修复的运动医学过程相关的疼痛。
【专利摘要】使用蛋白质溶液治疗疼痛的方法，所述蛋白质溶液包含IL-1ra、sTNF-R1、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1和sIL-1RII的两种或多种。组合物还可以含有白细胞和血小板。
【IPC分类】A61K38/19, A61P29/00, A61P19/00, A61K35/14
【公开号】CN105358161
【申请号】CN201480027408
【发明人】K·欧肖内西, J·E·伍德尔-马伊, J·C·希金斯, M·D·利奇
【申请人】拜欧米特生物制剂有限责任公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】CA2916080A1, EP2968410A1, US20140271870, WO2014149270A1