°C;和分离凝血部分。通过离屯、加热的全血或血浆可完成分离。合适的分离 装置作为Clotalyst?自体凝血酶收集系统（下文的"Clotalyst系统"）市售可得，由美国 印第安纳州华沙的己奥米特公司销售。
[0112] 用图4的装置400生成凝血剂的示例性过程起始于将含氯化巧和乙醇的试剂经第 一端口 410注入主室405。玻璃珠也置于主室405。注入试剂后，第一端口 410用第一替换 帽415密封。将带抗凝剂的血液经第二端口 420注入主室405。注入血液后，第二端口 420 用第二替换帽425密封。可选地，注射器和血分离装置400预热到约25°C的溫度。
[0113] 血组分分离装置400的内容物通过重复翻转装置400来混合，例如约12次，从而 使血液接触玻璃珠。混合后，溫育装置。溫育过程采用一定溫度和持续时间，从而允许装置 400的内容物在约25°C加热约15分钟。完成溫育阶段后，红细胞、血浆和玻璃珠的凝结团 在主室405的第二末端406形成。完成溫育后，充分振荡装置400 W去除和破坏任何可能 存在的凝胶。用非离屯、方法获得含有白细胞的液体
[0114] 如上所述，含白细胞的液体能通过非离屯、方法如培养获得。如本文所示，"非离屯、 方法"包括从组织获得含细胞因子生成细胞的组织部分的方法，而不采用离屯、。在一些实施 方式中，方法是"非重力的"，其中基于密度W外的细胞物理、化学或物理化学性质，其中所 述部分的白细胞浓度高于组织中的白细胞浓度。特别地，运种非重力方法不同于白细胞部 分通过离屯、全血或其它组织而产生的方法。在一些实施方式中，所述非离屯、方法包括仅基 于密度W外的所述白细胞性质的方法。非离屯、方法包括过滤、抗体结合和电泳法。
[0115] 例如，如上所讨论，可通过过滤从全血、骨髓抽吸物或其它组织制备白细胞。获自 血液、骨髓、脂肪组织或其它来源的白细胞和其它细胞因子生成细胞还能用本领域已知方 法培养。然后，所述细胞悬于合适介质如血浆，从而维持其活力并促进与固相提取材料混合 或其它接触。含所述细胞的液体还可通过压缩或破坏血凝块来生成，如上所述。
[0116] 将含有白细胞的液体接触提取材料并分离蛋白质溶液
[0117] 进一步参考图1的示例过程，溫育细胞因子细胞悬液或另外与固相提取材料接触 (步骤140) W生成含蛋白质的液体。随后，从固相提取材料分离此液体（步骤150)，作为 本技术的蛋白质溶液。不意在限制本技术的范围、机制或功能，本文所用的固相提取材料浓 缩液体体积白细胞中的细胞因子或其它蛋白质，在一些实施方式中，可活化、刺激或另外增 加细胞因子生成，包括IL-lra。因此，在一些实施方式中，方法包括用固相提取材料活化细 胞因子细胞悬液。
[0118] 固相提取材料能包括提供特定表面积W接触细胞的多种物质。固相提取材料可W 是连续材料或不连续，且包括多种单独颗粒。例如，固相提取材料可采用多种珠、纤维、粉 末、多孔材料或容器表面形式，所述容器包括含所述细胞的液体。固相提取材料可包括具有 多种横截面形状的几何体，如球形、楠圆形或多边形等。固相提取材料还能包括类似海绵的 连续多孔网络，或能包括多种个体多孔颗粒。相较非多孔材料，固相提取材料还可因多孔而 提供更大的表面积。
[0119] 在一些实施方式中，固相提取材料包括具有大长宽比的颗粒，例如其中颗粒为针 样形状。固相提取材料还可形成为长纤维且可W是或采用类似玻璃棉的形式。
[0120] 一些情况下，固相提取材料能包括保持细胞因子细胞悬液的容器内壁。例如，固相 提取材料可包括含有细胞因子细胞悬液的注射器腔。其它容器包括管如离屯、管，或血液分 级分离装置或浓缩器组件，如本文他处所述。
[0121] 固相提取材料是连续材料如多孔海绵样材料时，该固相提取材料使用的量足W在 固相提取材料的孔或间隙内吸收或吸附或纳入基本完整液体体积的白细胞。固相提取材 料是不连续材料如多种颗粒时，该固相提取材料能与含所述细胞的液体联合形成浆样组合 物。从具有高固体部分的似膏体到具有低固体部分的易流动浆体，所述浆体的稠度可变，。
[0122] 固相提取材料能提供大表面积与细胞接触。然而，一些情况下，固相提取材料能进 一步处理W增加其表面积，例如通过物理或化学蚀刻或侵蚀固相提取材料表面。关于化学 侵蚀，根据材料性质，能采用腐蚀剂修饰固相提取材料表面。经修饰表面可用碱或酸生成， 例如色横酸（C虹omosulphonic acid)，特别是约20% -约80%强度，优选约50%色横酸。 固相提取材料能用腐蚀剂溫育约5分钟-约30分钟W化学蚀刻表面并增加表面积。然后， 可洗涂固相提取材料去除腐蚀剂。例如，固相提取材料能包括保持细胞因子细胞悬液的容 器内壁，其中内壁蚀刻从而随后增加接触液体的表面积。
[0123]多种聚合物、金属、陶瓷和玻璃能用作固相提取材料。在一些实施方式中，固相提 取材料包括吸湿材料。合适固相提取材料的示例包括玻璃、矿物、聚合物、金属和多糖。矿物 包括刚玉和石英。聚合物包括聚苯乙締、聚乙締、聚氯乙締、聚丙締和聚丙締酷胺。金属包 括铁。多糖包括葡聚糖和琼脂糖。优选的固相提取材料包含聚丙締酷胺或基本由其组成， 如下进一步所述。
[0124] 例如，固相提取材料可包括玻璃的连续固相提取材料或多种玻璃颗粒、玻璃棉，金 属如铁的连续固相提取材料、多种金属珠、金属粉末，和其组合。金属的连续固相提取材料 能包括块状或其它=维形状，由带开口细胞结构的多孔金属或金属合金形成。固相提取材 料可包括多个珠或多种尺寸的颗粒，包含大致球形珠。珠包括聚苯乙締珠、聚丙締酷胺珠、 玻璃珠、金属（如铁）珠、或任何其它合适的珠。珠可W是适合容器和所用细胞因子悬液量 的任何尺寸。一些情况下，珠尺寸范围可为约0.001毫米-约3毫米直径。珠尺寸足够小 时，所述珠看上去更像粉末。
[0125]用作固相提取材料的聚丙締酷胺珠能通过聚合丙締酷胺单体而形成，使用本领域 已知的可控和标准操作W生成由聚丙締酷胺凝胶形成的相对均匀珠。一般，聚丙締酷胺通 过用合适双功能交联剂聚合丙締酷胺来形成，最常见为N，N'-亚甲基双丙締酷胺（双丙 締酷胺）。凝胶聚合通常用过硫酸锭起始，通过加入催化剂如N，N，N'，N'-四甲基乙二 胺（TEMED)来提高反应速率。在各种实施方式中，聚丙締酷胺珠包括0.5微摩尔簇基/毫 升珠，赋予轻微阴离子特性（负电荷）。所述珠通常还抗抑变化，且在许多水性和有机溶 液中稳定。通过调整总丙締酷胺浓度，聚丙締酷胺凝胶可W广泛范围的孔径形成。此外，聚 丙締酷胺珠可W多种尺寸形成且能具有相对均匀的大小分布。珠尺寸范围为数微米直径到 数毫米直径。例如，不同类型的Bio-Gel?聚丙締酷胺凝胶珠（美国加利福尼亚州赫拉克勒 斯的伯乐公司（Bio-Rad L油oratories))的粒径范围是小于约45 Jim-约180 ym。聚丙締 酷胺珠还可获自法国爱森（SNF Floerger)(美国乔治亚州化ceboro)、皮尔斯公司（Pierce Biotechnology, Inc.)(美国伊利诺伊州罗克福德）和聚合物公司（Polymers, Inc.)(美国 阿肯色州费耶特维尔）。
[0126] 一旦聚合，聚丙締酷胺珠可干燥并W粉末样形式保存。干珠不溶于水，但再水合后 能显著膨胀。再水合使聚丙締酷胺珠恢复胶稠度，可为干燥状态尺寸的约2-约3倍。因此， 干的聚丙締酷胺珠（即使聚丙締酷胺珠脱水）可用于吸收部分液体体积，包括小于珠孔径 的溶质，且能用于浓缩比-Ira和其它由白细胞生成的蛋白质。例如，联合干聚丙締酷胺珠 与血液和/或富血小板血浆可通过白细胞激活IL-Ira生成，并且随着干珠再水合和膨胀， 还降低总液体体积。
[0127] 不意在限制本技术的范围、机制或功能，已发现与固相提取材料接触的表面能激 活细胞，一些情况下，固相提取材料协助分离和浓缩所得蛋白质溶液，所述溶液富含包括 比-lra在内的细胞因子。例如，在多孔固相提取材料的情况中，含所述细胞的部分液体能进 入孔并保留在其中。所述液体中的细胞可接触此额外表面积。在一些实施方式中，孔过小 W至于细胞无法进入，但部分液体能进入孔。例如，液体能通过离屯、从固相提取材料和孔中 移除。
[012引固相提取材料优选用本领域已知技术灭菌，W防止细胞因子细胞悬液污染。例如， 加热和加压灭菌法如高压灭菌法可根据固相提取材料的具体组成来使用。能使用替代方法 如化学灭菌或福照，其中固相提取材料可能受到高压灭菌过程的不利影响。
[0129] 在一些实施方式中，所述细胞因子细胞悬液用固相提取材料溫育一段时间W有效 移出部分液体。溫育可在约30秒-约72小时阶段内完成且可在约20°C-约4rC溫度下 完成。例如，溫育可W是24小时或更少，10小时或更少，5小时或更少，2小时或更少，1小 时或更少，30分钟或更少，15分钟或更少，10分钟或更少，5分钟或更少，4分钟或更少，3分 钟或更少，2分钟或更少。溫育可W是至少约15秒，至少约30秒，至少约1分钟，至少约90 秒，至少约2分钟，至少约10分钟，或至少约30分钟。在一些实施方式中，溫育是约1分 钟-约3分钟。在一些实施方式中，溫育在约37°C进行。在一些实施方式中，所述液体不溫 育，但只在必须时与固相提取材料接触W进行后续处理。所述接触可在周围条件下进行，例 如约20-25°C的溫度。
[0130] 在一些实施方式中，揽拌所述细胞因子细胞悬液和固相提取材料W在接触期间 更充分混合运些组分。所述揽拌可通过翻转、振荡、摇动、揽拌或满旋液体和固相提取材 料来完成。揽拌可增加液体内细胞与固相提取材料的接触。揽拌可进行一次，重复多 次，定期重复，或可连续。当含所述细胞的液体用电磁场刺激时，还可揽拌该液体和固相 提取材料。设及用聚丙締酷胺珠和其它固相提取材料生成富含蛋白质溶液的另外方面 和特征参见：美国专利申请公开号2009/0220482, Higgins等，2009年9月3日公开；美 国专利申请公开号2010/0055087, Higgins等，2010年3月4日公开；美国专利申请公 开 2011/0052561, Ho巧pner, 2011 年 3 月 3 日公开；国际申请公开 2012/030593, Higgins 等，2012年3月8日公开；和美国专利申请公开2012/0172836, Higgins等，2012年7月5 日公开。美国专利申请序列号13/840562, Binde等，《用于治疗炎症性疾病的方法和非免疫 原t生组合物》（Methods and Non-Immuno邑enic Compositions for Treatin邑 Inflammatory Diseases);美国专利申请序列号13/841083 Lan化igan等；《用蛋白质溶液治疗炎症 性呼吸道疾病》（Treatment of Inflammatory Respiratory Disease Using Protein Solutions);美国专利申请序列号13/837005, Woodell-May等；《治疗炎症性疾病的方法 和非细胞组合物》（Methods and Acellular Compositions for Treating InflammatoiT Disorders);美国专利申请序列号13/839280, Leach等，《用非离屯、法从组织制备细胞 因子组合物的方法》（Methods for Making 切tokine Compositions from Tissue Using Non-Centrifugal Methods);美国专利申请序列号13/840129,Ma1:usuka等，《用蛋白质溶 液治疗胶原缺陷》（Treatment of Collagen Defects Using Protein Solutions);和美国 专利申请序列号13/841103 Lan化igan等，《用蛋白质溶液治疗外周血管疾病》CTreatment of F^eri曲eral Vas州Iar Disease Using Protein Solutions);所有专利都通过引用纳入 本文。
[0131] 含白细胞的液体与固相提取材料接触可用合适容器或实现接触的其它装置进 行。接触能在连续过程中进行，其中液体流越过或穿过固相提取材料，或液体和固相提取 材料可包含于容器。如上所讨论，所述容器能包括固相提取材料，或仅用作保持珠或其它 形式材料的容器。本技术所用的容器包括本领域已知的那些，如PlasmaxTM Plus血浆浓 缩器，市售获自己奥米特公司（美国印第安纳州华沙），且可包括W下专利所述的那些装 置和应用方法：美国专利号7, 553, 413, Dorian等，2009年6月30日公开；和美国专利号 7, 694, 828, Swift 等，2010 年 4 月 13 日公开。
[0132] 运类装置如图3A和3B所示，用于与聚丙締酷胺凝胶珠固相提取材料示例性应用。 装置300具有上室305和下室310。上室305具有端壁315,凝胶珠揽拌器325的揽拌器阀 杆320沿着其延伸。装置300还具有沿着端壁315延伸并进入上室305的入口 330。装置 300还包括连通血浆浓缩物回路340的出口 335。上室305基底包括滤器345,其上表面支 撑干的浓缩聚丙締酷胺珠350。
[0133] 使用中，含白细胞的液体355和可选的血小板经入口 330注入上室305并与聚丙 締酷胺珠350混合。流体355和聚丙締酷胺珠350可通过旋转揽拌器阀杆320和凝胶珠揽 拌器325来混合，W帮助混合流体355和聚丙締酷胺珠350。然后，混合的流体355和聚丙 締酷胺珠350在所需溫度下溫育所需时间。随后，装置300进行离屯、，从而液体传到下室 310,而聚丙締酷胺珠350被滤器345保留，由此分离聚丙締酷胺珠350与IL-Ira和其它蛋 白质的所得溶液360,所述溶液收集于下室310。溶液360可经出口 335从装置移出。
[0134] 在一些实施方式中，蛋白质溶液能W某一方法制备，其中含白细胞的液体从组织 中分离，随后在连续过程中接触固相提取材料。再次参考图1，在一些实施方式中，分离 110、120、135和接触140用单一设备进行，本文称为单一分离和浓缩装置（"S/C装置"）。 一个运种装置参见美国专利申请序列号13/434, 245, 0' Connell, 2012年3月29日提交。
[0135] S/C装置包括分离区、第一浓缩区、第二浓缩区、浮标系统、入口、止回阀、第一回收 端口和第二回收端口。图5显示S/C装置500能从全血产生抗炎性细胞因子组合物。例 如，所述方法可起始于获得一定体积的全血，其经入口 510注射填入S/C装置500的分离 区505。浮标系统515位于分离区505内。浮标系统包括第一浮标组件520、第二浮标组 件525 W及连接第一浮标组件520与第二浮标组件525的第=浮标组件530。第一和第二 浮标组件520、525之间的空间界定了浮标分离区535。各浮标组件的密度能根据所需成分 血（作为分离结果）来选择。浮标系统515能包括选定浮标系统，如一般用于GPS饭II orGPS(咬III重力血小板分离系统的浮标系统，所述重力血小板分离系统获自己奥米特 公司（美国印第安纳州华沙