）。美国专利号7, 845, 499、美国专利号7, 806, 276和美国专利 号7, 992, 725公开了浮标系统。
[0136] 获得蛋白质溶液的方法包括离屯、旋转S/C装置500。离屯、力使浮标系统515能穿 过全血，导致部分全血位于浮标分离区535。例如，此部分可包括富血小板血浆。使用回收 注射器，选定部分能经第=浮标组件530从收集体积535中移出，第=浮标组件530界定与 收集通道545相连的移出通道540。连接弯管550可与移出通道540互连，从而能经连接弯 管550、移出通道540和浮标收集通道545形成真空。收集管555能与带回收弯管560的连 接弯管550互连，回收弯管560从壁565延伸，壁565可W是浓缩区570的底壁。第二回收 管575可首先与止回阀集合580和第一回收端口 585相连。第一回收端口 585能通过卢尔 锁式连接或其它合适连接与回收注射器相连。
[0137] 止回阀集合580确保移出部分W-个方向流动并防止移出部分再进入第二回收 管575。此外，当材料从第一回收端口 585推回止回阀集合580从而材料会进入浓缩区570 时，止回阀580内的阀盘可朝着第二回收管575向下弯曲并关闭开口，从而打开止回阀集合 580内的第二开口。第二开口使该部分能推入浓缩区570。
[013引 因此，成分血随后经第一回收端口 285、止回阀集合580再注入浓缩区570的上体 积588。向上体积588中的成分血加入聚丙締酷胺珠590,该成分血和聚丙締酷胺珠590可 振荡混合。可选地，所述成分血和珠590能在方法操作前溫育选定时间段。
[0139] 所述方法包括离屯、旋转的第二步。第二次离屯、中，通过推动抗炎性细胞因子组合 物通过滤器592并进入浓缩区570的低浓度区595,抗炎性细胞因子组合物与珠590分离。 所述蛋白质溶液可经第=回收管596撤回并用第二回收注射器从第二回收端口 598撤出。 所述注射器能再次通过Luer液锁式连接与第二回收端口相连。
[0140] 再次参考图1，液体与固相提取材料接触后，分离蛋白质溶液，如步骤150所示。通 过抽出至少部分液体体积且留下珠，可完成分离。一些情况下，提取材料可在抽出蛋白质溶 液前通过离屯、沉淀。分离还可由过滤进行，其中所述材料被滤器保留而蛋白质溶液通过滤 器，例如用离屯、力或真空。如果采用干的聚丙締酷胺珠与提取材料溫育，液体体积可减少， 因为珠在再水合后会膨胀，从而浓缩所得蛋白质溶液。为维持增加的浓度，分离步骤必须小 屯、W防止挤压珠或液体从膨胀珠中脱离。例如，高离屯、力或高真空可能破坏珠和/或将液 体抽离珠内部体积。
[0141] 可选的电磁刺激
[0142] 在液体与固相提取材料接触之前或期间，细胞因子细胞悬液能用电磁场刺激。因 此，在一些实施方式中，刺激含所述细胞的液体可在液体接触固相提取材料之前进行。然 而，优选至少部分接触步骤和至少部分刺激步骤在时间上重叠，从而含所述细胞的液体同 时与固相提取材料接触并用电磁场刺激。
[0143] 用电磁场刺激细胞因子细胞悬液可设及多种形式的电磁场刺激，如脉冲电磁场或 电容禪合电磁场。在一些实施方式中，所述液体用偶联刺激线圈的电源刺激。经过线圈的 电流产生脉冲磁场，其在液体中诱导脉冲电场。线圈可部分包围保持在容器内的液体，所述 容器如管或注射器。线圈可并入保持细胞因子细胞悬液的容器或可移出。例如，塑料管能 用整体式线圈形成或线圈能暂时偶联容器或置于容器内；例如，管能配置成使线圈可接到 容器上。需要时，电源可偶联线圈W进行刺激步骤。
[0144] 用电磁场刺激液体还可包括跨液体放置至少2个电极。然后，电能可应用于电极 W电容禪合电极并在之间产生电磁场。因此，电磁场能穿过液体，从而增加细胞因子生成速 度和/或量。在其它实施方式中，电极能用于产生直流电或者一个或多个线圈能用于产生 脉冲电磁场。
[0145] 刺激期间的电磁场强度可W是至少约0. 5微伏/厘米，无论是由直流电、电容禪合 电流或是脉冲电磁场生成。在直流电电极的情况下，电流振幅可W是约I-约200微安，在 一些实施方式中，振幅可W是约20-约100微安。在其它实施方式中，电流可W是约20、约 60或约100微安。然而，应理解电流振幅可W是其它合适量级。
[0146] 刺激步骤中应用的电磁场可恒定或随着时间变化。例如，能应用正弦时变电磁场， 采用跨液体放置的电极。运种正弦时变电磁场可具有约1伏-约10伏的跨电极峰值电压， 在一些实施方式中，峰值电压可W是约5伏。产生的对应电场振幅可为约0. 1微伏/厘米 (mV/cm)-约lOOmV/cm，在一些实施方式中，可为约20mV/cm。正弦时变电场的频率可为约 1,000Hz-约200, OOOHz,在一些实施方式中，频率可为约60, OOOHz。
[0147] 应用于液体的电磁场还可W是脉冲电磁场。脉冲电磁场能用外部线圈和脉冲发生 器诱导。在此方面，脉冲电磁场可具有约10微秒/脉冲-约2000微秒/脉冲的脉冲持续 时间。在一个实施方式中，脉冲持续时间可W是约225微秒。脉冲可包括电磁爆发，其中爆 发能包括1个脉冲-约200个脉冲。或者，电磁场可具有含约10脉冲-约30脉冲的爆发。 就此而言，在一个实施方式中，各爆发能包括约20脉冲。
[0148] 脉冲电磁场中爆发的频率可变。就此而言，在一些实施方式中，爆发能W约 IHz-约100化的频率重复，在其它实施方式中，能W约IOHz-约20化的频率重复。此外，爆 发能W约1.甜Z、约15化或约76化的频率重复。爆发的持续时间可为约10微秒到多至约 40, 000微秒。在此方面，爆发的持续时间可为约4. 5微秒。
[0149] 产生电容禪合电磁场的合适装置包括SpimiIPak饭髓刺激器（新泽西州帕西帕 尼的邸I (邸I，L P.))或DC刺激装置如SpF饭化脊柱融合刺激器（新泽西州帕西帕尼的 EBI)。脉冲电磁场能用多种已知方法和设备生成，如用单线圈或一对亥姆霍兹线圈。例如， 合适的设备包括邸I骨愈合系统⑩2001型（新泽西州帕西帕尼的邸I)和BTBS刺激线 圈。关于直流电，电场可用任何已知产生直流电场的装置生成，例如Osteogen?植入式骨生 长刺激器（新泽西州帕西帕尼的邸I)。可使用产生电磁场的其它合适设备。
[0150] 根据液体与固相提取材料接触的需要，电磁刺激细胞因子细胞悬液可连续和/或 重复。然而，应理解，用电磁场刺激液体的步骤包括不是与周围条件相关电场或电磁场（如 通过偶然暴露于收音机、电话机、台式计算机或类似设备而产生的电磁场）的场，或除与周 围条件相关电场或电磁场之外还包括其它场。
[0151] 在一些实施方式中，如图1所示的接触和刺激步骤都在小于约1小时内进行。接 触和刺激步骤还能在约20°C -约37°C的溫度范围进行。在优选实施方式中，所述细胞因子 细胞悬液的溫度在接触和刺激步骤中保持约37°C。接触和刺激步骤之一或两者通常离体进 行。
[0152] 形成蛋白质溶液的其它方法
[0153] 本技术提供形成蛋白质溶液组分的其它方法，如混合蛋白质和其它组分并且分离 和浓缩蛋白质及组分，而不用固相提取材料。例如，如上所述，通过混合运些方法所制备蛋 白质与从同种异体来源分离组织所制备的组分或溶液并用固相提取材料处理，能制备本技 术的蛋白质溶液。
[0154] 例如，多种方法提供非细胞或基本非细胞蛋白质溶液，包括一种或多种上述蛋白 质。不意在限制本技术的范围、机制或功能，运种非细胞抗炎性细胞因子组合物可在某些应 用中提供优势，只要其在施用对象中不产生免疫原性应答。
[0155] 例如，特别地，蛋白质溶液可包括白介素-1受体括抗剂（IL-Ira)，除了上述方法 W外，IL-Ira是合成或重组的，或分离自自体、同种异体或异种血液或其它生物来源。例 如，Kineret?(阿那白滞素）是IL-Ira的重组、非糖基化形式，可获自安进公司（加利福尼 亚州千橡市）。多种重组白介素-1抑制剂和治疗方法参见美国专利号6, 599, 873, Sommer 等，2003年7月29日公开；美国专利号5, 075,222, Hannum等，1991年12月24日公开； 和美国申请公开号2005/0197293, Mellis等，2005年9月8日公开。另外，包括使用自身 体液在内的从体液生成IL-Ira的方法参见美国专利号6, 623, 472, Reinecke等，2003年9 月23日公开；美国专利号6, 713, 246, Reinecke等，2004年3月30日公开；和美国专利号 6, 759, 188, Reinecke等，2004年7月6日公开。要生成同种异体抗炎性细胞因子组合物 时，来自多个对象的多种来源IL-Ira可汇集在一起。
[0156] 更一般地，制备非细胞蛋白质溶液的方法能包括在天然生成抗炎性细胞因子如 IL-Ira的细胞培养物中培养细胞，或培养改造成产生运些细胞因子的细胞。天然生成抗炎 性细胞因子的细胞的非限制性示例包括脂肪组织细胞、脂肪细胞、脂肪来源干细胞、基质细 胞、骨髓细胞、间充质干细胞和血细胞。
[0157] 在各种实施方式中，细胞系能改造成过量生成抗炎性细胞因子。抗炎性细胞因子 的非限制性示例包括 VEGF、TNF- a、比-Ira、sTNF-RI、sTNF-RII、PGDF-AB、PDGF-BB、IGF-I、 EGF、TGF-e UsIklRII和HGF。过表达抗炎性细胞因子的稳定真核细胞系能如下产生：用 重组DNA转染真核细胞如哺乳动物细胞，所述重组DNA包括编码抗炎性细胞因子的基因和 选择标记。或者，原核生物和酵母通过重组DNA转化能改造成过表达抗炎性细胞因子，所述 重组DNA包括编码抗炎性细胞因子的基因和选择标记。转化和转染可用重组DNA分子进行， 所述分子包括编码抗炎性细胞因子如比-Ira的DNA序列和选择标记。真核和原核细胞能改 造成组成型或经诱导过表达抗炎性细胞因子。在真核和原核细胞中表达抗炎性细胞因子如 比-Ira、sTNF-RI、sTNF-RII 和 SlLl-RII 的方法参见美国专利号 6, 337, 072,化rd 等，2002 年1月8日公开；和美国申请公开号2001/0053764, Sims等，2001年12月20日公开。
[0158] 比-Ira基因在人中转录时，mRNA可剪接成4个变体，产生4种翻译比-Ira亚型。 SEQ ID N0:l、3、5 和 7 分别是比-Ira亚型 1-4 的 cDNA，SEQ ID N0:2、4、6 和 8 分别是比-Ira 亚型1-4的氨基酸序列。比-Ira亚型统称为"比-Ira"。沈Q ID NO: 9是sTNF-RI的cDNA序 列且沈Q ID NO: 10是sTNF-RI的氨基酸序列。沈Q ID NO: 11是sTNF-RII的cDNA序列且 沈Q ID NO: 12是sTNF-RII的氨基酸序列。沈Q ID NO: 13是SlklRI的cDNA序列且沈Q ID NO: 14是SlklRI的氨基酸序列。沈Q ID NO 15和17分别是SlklRIIvl和sIklRIIv3的 cDNA且沈Q ID側：16和18分别是3比-11?11￥1和3比-11?11￥3的氨基酸序列。比-11?11￥2 的CDNA序列是非编码序列；因此，其不包括在内。
[0159] 为在原核培养物特定例如细菌中表达比-Ira、STNF-RI或sTNF-RII (-般称为"感 兴趣蛋白质"），将cDNA序列（SEQ ID ^:1、3、5、7、9、11、13、15或17)克隆到适合细菌的 表达载体中。表达载体应包括强启动子和选择标记如抗生素抗性。能杀死细菌细胞的抗生 素的非限制性示例包括氨节青霉素、四环素、卡那霉素和氯霉素。表达载体还应包括引起感 兴趣蛋白质组成型或诱导型表达的元件。可选地，与功能性偶联感兴趣蛋白质的标签对应 的DNA序列可存在于载体中，邮邻感兴趣蛋白质的基因，所述标签能鉴定和纯化蛋白质。例 如，N或C末端His标签能用于检测带抗化S抗体的蛋白质，且能在儀柱上纯化。制备含感 兴趣蛋白质表达基因的表达载体时，细菌细胞例如大肠杆菌巧.coli)能用该表达载体转 化。选择标记确保仅转化有载体的细胞在LB肉汤中存活，所述LB肉汤补充有对应选择标 记的抗生素。然后，细菌能在补充有抗生素的LB肉汤中生长，W用于表达和纯化。表达载 体、克隆感兴趣蛋白质到表达载体中的方法、转化原核细胞的方法、从经转化原核细胞表达 蛋白质的方法W及蛋白质纯化方法通常为本领域普通技术人员已知。
[0160] 为在真核培养物例如哺乳动物细胞中表达感兴趣蛋白质，将CDNA序列（SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15或17)克隆到适合特定哺乳动物细胞的表达载体中。表达载体应 包括强启动子和选择标记如抗生素抗性。能杀死哺乳动物细胞的抗生素的非限制性示例 包括遗传霉素和庆大霉素。表达载体还应包括引起感兴趣蛋白质组成型或诱导型表达的元 件。可选地，与功能性偶联感兴趣蛋白质的标签对应的DNA序列可存在于载体中，邮邻感兴 趣蛋白质的基因，所述标签能鉴定和纯化蛋白质。制备含感兴趣蛋白质表达基因的表达载 体时，哺乳动物细胞如人细胞能用该表达载体转染。转染细胞能在细胞培养基中生长，所述 培养基补充有对应选择标记的抗生素。抗生素的存在能分离稳定细胞系。然后，稳定细胞 系能在补充有抗生素的细胞培养基中生长，W用于表达和纯化。表达载体、克隆感兴趣蛋白 质到表达载体中的方法、转染真核细胞和开发稳定细胞系的方法、从经转染真核细胞表达 蛋白质的方法W及蛋白质纯化方法通常为本领域普通技术人员已知。
[0161] 或者，可培养未通过DNA转染改变基因的真核细胞。所述真核细胞可W是原代培 养物，即细胞直接生长自真核供体如人，或真核细胞可W是确立的细胞系。许多确立细胞系 可市售获自美国模式培养物保藏中屯、（American Type Qilture Collection, Inc.)(美国 弗吉尼亚州马纳萨斯）。所述细胞能与外源信号如重组蛋白质一起生长。真核细胞通常在 有细胞培养基的培养瓶中培养。从瓶中回收细胞培养基，离屯、W移出非贴壁细胞。
[0162] 细胞培养可W是单层培养、非贴壁培养或生物反应器。单层培养包括在适当基质 上培养的错依赖性细胞，所述底物允许细胞粘附和伸展，如细胞培养瓶和细胞培养皿。非贴 壁培养包括在悬液中维持的细胞。合适的细胞是非错依赖性，或其是适合悬浮培养的错依 赖性细胞。许多细胞系例如许多昆虫细胞，能单层或悬浮生长。生物反应器是能支持生物 活性环境的装置，其中完成化学过程和/或获得生化活性物质。生物反应器可包括悬浮或 固定细胞。单层培养、非贴壁培养和生物反应器能通过本领域常用方法维持。
[0163] 在一些实施方式中，细胞培养物经受电磁场，从而刺激一种或多种蛋白质生成。用 电磁场刺激培养物可设及多种形式的电磁场刺激，如脉冲电磁场或电容禪合电磁场。刺激 的方法和条件包括上述那些。
[0164] 细胞培养物能向培养基自然释放抗炎性细胞因子，或所述培养物可经诱导释放抗 炎性细胞因子到培养基中。通过抽吸、离屯、或过滤可分离培养基，W用于形成非细胞抗炎性 细胞因子组合物。
[0165] 在一